Name: determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

NB, GG, SB, KC, üniversite hibe komisyonuna (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE ve Bilimsel ve Endüstriyel Araştırma Konseyi'ne (CSIR) araştırma bursları için içtenlikle teşekkür eder. Biyoteknoloji Departmanı (DBT), Hindistan Hükümeti, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (DST-FIST), Hindistan Hükümeti'ni finansal destek için çok şükür kabul ediyoruz.

1. Giriş ve varış vektörlerindeki genlerin klonlatma (Şekil 2)
<ol><li>İlgi genlerinin (bizim durumumuzda M ve C genleri) kodlama sırasını (CDS) PCR ile güçlendirin ve uygun giriş vektörlerinde (örneğin, pENTR/D-TOPO vektörü) klonlayın; Bu denemede kullanılan vektörler için Tablo 1'e bakın).</li>
	<li>Klonları antibiyotik içeren plakalarda yetiştirin. Antibiyotikler üzerinde seçilen klonları,<sup class=...

<ol>
	<li>Grove, C. A., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+functionality+and+transcription+regulatory+networks.">Transcription factor functionality and transcription regulatory networks.</a> Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).</li><li>Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+your+partners:+dimerization+in+eukaryotic+transcription+factors.">Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+gene+family+in+rice:+genome-wide+identification,+organization+and+expression+profiling+during+reproductive+development+and+stress.">MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress.</a> BMC Genomics. 8 (242), (2007).</li><li>Thei&#223;en, G., Gramzow, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+plant+MADS+domain+transcription+factors.">Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors.</a> Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).</li><li>Schweiger, R., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+visualized+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+tobacco+protoplasts+and+leaves.">Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).</li><li>Bracha-Drori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+in+plants+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).</li><li>Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+bimolecular+fluorescence+complementation+and+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+reveals+ternary+SNARE+complex+formation+in+living+plant+cells.">Combined bimolecular fluorescence complementation and f&#246;rster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells.</a> Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).</li><li>Margineanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+protein-protein+interactions+using+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+(FLIM).">Screening for protein-protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM).</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+fundamentals+and+advances+in+instrumentation,+analysis,+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications.</a> Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+FRET-FLIM+labeling+conditions+to+detect+nuclear+protein+interactions+at+native+expression+levels+in+living+Arabidopsis+roots.">Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).</li><li>Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+highly+efficient+method+for+transient+gene+expression+in+rice+plants.">A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants.</a> Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).</li><li>Kudla, J., Bock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+the+way+to+protein-protein+interactions:+Recommendations+on+best+practices+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analyses.">Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses.</a> Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).</li><li>Shyu, Y. J., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+complementation:+an+emerging+tool+for+biological+research.">Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research.</a> Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+bimolecular+fluorescence+complementation+assay+with+a+high+signal-to-noise+ratio.">An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio.</a> BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC):+A+5-year+update+and+future+perspectives.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives.</a> BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).</li><li>Chakrabarty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSITE+vectors+for+stable+integration+or+transient+expression+of+autofluorescent+protein+fusions+in+plants:+Probing+Nicotiana+benthamiana-+Virus+Interactions.">pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).</li><li>Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+Agrobacterium+binary+Ti+vectors.">A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.</a> Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).</li><li>Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+migration+in+gel+filtration+of+the+Cf-4+and+Cf-9+resistance+proteins+is+an+intrinsic+property+of+Cf+proteins+and+not+because+of+their+association+with+high-molecular-weight+proteins.">Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins.</a> Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).</li><li>Xie, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+SARS-CoV-2+using+a+reverse+genetic+system.">Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system.</a> Nature Protocols. 16, (2021).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+plasmid+construction+strategy+for+Cas9.">Optimized plasmid construction strategy for Cas9.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).</li><li>Mattanovich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Agrobacterium+spp.+by+electroporation.">Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li><li>Tramier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picosecond-hetero-FRET+microscopy+to+probe+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).</li><li>Alvarez, L. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SP8+FALCON:+a+novel+concept+in+fluorescence+lifetime+imaging+enabling+video-rate+confocal+FLIM.">SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM.</a> Nature Methods. 20, 2-4 (2019).</li><li>Postma, M., Goedhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plotsofdata-a+web+app+for+visualizing+data+together+with+their+summaries.">Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries.</a> PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).</li><li>Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-chromophore+fret+microscopy+to+analyze+multiprotein+interactions+in+living+cells.">Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).</li><li>Waadt, R., Kudla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+plant+visualization+of+protein+interactions+using+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC).">In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).</li></ol>

Mevcut protokol, MADS kutu proteininin iki monomeri ile kalsiyum sensör proteini arasında üçlü bir kompleks oluşumunu belirlemek için BiFC tabanlı FRET-FLIM testinin kullanımını göstermektedir. Protokol, Y. John Shyu ve ark. tarafından hazırlanan ve Fos-Jun heterodimers ile NFAT veya p65 arasında oluşturulan üçlü kompleksi hassaslaştırılmış emisyon yöntemi7kullanarak görselleştirmek için BiFC tabanlı bir FRET yöntemi geliştirdikleri bir rapordan uyarlanmıştır. Dah...

Protein-protein etkileşimleri (PPI'ler) çeşitli metabolik ve gelişimsel süreçleri düzenleyerek ökaryotik hücrelerin düzgün çalışmasının temelini oluşturur. Bazı PPI'lar kararlıdır, bazıları ise doğada geçicidir. Etkileşimler, dimerik, trimerik, tetramerik homomerik ve heteromerik1gibi etkileşimdeki üye sayısına ve türüne göre kategorize edilebilir. Protein etkileşimlerinin tanımlanması ve karakterizasyonu, protein fonksiyonlarının ve düzenleyici ağların daha iyi anlaşılmasına neden olabilir.
Transkripsiyon faktörleri düzenleyici işlevlerde yer alan proteinlerdir. DNA'ya bağlanarak aşağı akış genlerinin transkripsiyon oranını düzenlerler. Bazen proteinler tarafından oligomerizasyon veya daha yüksek sıralı komplekslerin oluşumu, işlevlerini yerine getirmek için bir ön koşuldur2. Bitki MADS kutusu transkripsiyon faktörleri çiçek geçişi, çiçek organ gelişimi, gübreleme, tohum gelişimi, senescence ve vejetatif gelişim gibi çeşitli süreçleri düzenleyen homeotik genlerdir. DNA3,4'e bağlanan daha yüksek sıralı kompleksler oluşturdukları bilinmektedir. Transkripsiyon faktörleri ve etkileşimcileri arasında ÜFE ağlarının incelenmesi, transkripsiyonsal düzenlemenin altında kalan karmaşıklık hakkında içgörüler sağlar.
Nicotiana benthamiana'da geçici protein ekspresyasyonu, protein lokalizasyonunu veya protein-protein etkileşimlerini incelemek için popüler bir yaklaşımolmuştur 5. BiFC ve FRET, floresan muhabir sistemlerini kullanarak in vivo protein-protein etkileşimlerini incelemek için yöntemlerdir6. Bu iki tekniğin bir kombinasyonunun üç protein arasındaki etkileşimi ortaya çıkardığı gösterilmiştir7. FRET, kabul edici fotobleaching, duyarlı emisyon ve Floresan Ömür Boyu Görüntüleme (FLIM) tekniği kullanılarak ölçülür. FLIM tabanlı FRET tahlilleri, floresan ömürlerine göre iki molekül arasındaki enerji transferi ölçümlerine doğru nicelik ve mekansal özgüllük sağlayan bir araç olarak ortaya çıkmıştır8. FLIM, bir foton yaymadan önce bir flororforun heyecanlı bir durumda kaldığı zamanı ölçen ve sadece yoğunluk ölçümlerini kullanan tekniklerden daha iyidir9,10. Nicotiana benthamiana ve soğan epidermal peelingleri gibi heterolog sistemlerin yanı sıra, daha yeni raporlar, yerelkoşullaraltında protein-protein etkileşimlerinin in vivo analizi için Arabidopsis köklerinin ve genç pirinç fidelerininvb.
Uygun bir ifade sistemi dışında, BiFC ve FRET tahlilleri için etkileşime giren ortakların seçimi de bu deneyin başarısı için çok önemlidir. BiFC yapılandırmasında kullanılan ortaklar arasındaki ÜFE, FRET denemesinde eşleştirilmiş bir ortak olarak kullanılmadan önce uygun denetimler kullanılarak doğrulanmalıdır13. BiFC, floresan proteinin N ve C-terminal parçalarının yapısal tamamlayıcısını kullanır. BiFC tahlillerinde kullanılan tüm floresan proteinlerin çoğunda yaygın bir sınırlama, iki türev nonfluoresan parçası arasındaki kendi kendine montaj olmuştur, yanlış-pozitif floresanlara katkıda bulunur ve sinyal-gürültü (S / N) oranınıazaltır 14. Nokta mutasyonları veya floresan proteini bölme pozisyonu da dahil olmak üzere son gelişmeler, artan yoğunluk, daha yüksek özgüllük, yüksek S / N oranı15,16ile BiFC çiftlerine yol açtı. Bu floresan proteinler, deneyin uygunluğuna bağlı olarak BiFC'yi gerçekleştirmek için de kullanılabilir.
Geleneksel olarak, CFP ve YFP, FRET deneylerinde donör ve alıcı çift olarak kullanılmıştır17. Bununla birlikte, YFP veya m-Sitrin'in Arabidopsis kök sisteminde hedef proteinlerin doğal ekspresyumu sırasında yüksek kuantum verimi (QY) nedeniyle daha iyi FRET donörleri (kabul eden olarak RFP ile kullanıldığında) olduğu bulunmuştur. Organizatörlerin seçimi (konsitutive versus native/endogenous) ve fluorophore da başarılı bir BiFC-FRET-FLIM deneyi tasarlamada çok önemli bir rol oynamaktadır. FRET donörlerinin verimliliğinin ve FRET çiftlerinin uygunluğunun, organizatördeki değişiklik ve ifade için kullanılan biyolojik sistemle değişme eğiliminde olduğunu belirtmek önemlidir. Parlaklığı ile ilgili floroforun QY'si pH'a, sıcaklığa ve kullanılan biyolojik sisteme bağlıdır. FRET deneyi için florofor çiftini seçmeden önce bu kriterlerin iyice dikkate alınmasını öneriyoruz. Bu protokol için kullanılan biyolojik sistem, promotörler ve proteinler BiFC FRET-FLIM deneyi için CFP-YFP floroforları ile iyi çalıştı.
Bu çalışmada, BiFC tabanlı FRET kullanarak üç protein molekülü arasındaki etkileşimi görselleştirmek için FLIM özelliğini birleştiriyoruz. Bu teknikte, iki protein bölünmüş YFP proteini ve üçüncü protein CFP ile etiketlenir. Mads kutusu protein (M) homodimerinin Kalsiyum sensör proteini (C) ile etkileşimini incelemek istediğimizden, bu proteinler pSITE-1CA ve pSITE-3CA vektörlerinde floresan proteinlerle etiketlenmiştir18. Etkileşime giren ortaklardan ikisi, bu testte, pSPYNE-35S ve pSPYCE-35S vektörlerinde YFP'nin N ve C-terminal parçaları ile etiketlenmiştir veetkileşimleri,CFP (FRET donörü olarak hareket eden) ile etiketlenen üçüncü etkileşim ortağına FRET kabul edicisi olarak hareket eden işlevsel YFP'nin yeniden birleşmesi ile sonuçlanır (Şekil 1 ). Bu özel durumda, iki M monomeri ile M ve C arasındaki PPI, BiFC'nin maya-iki-hibrid sistemle birlikte üç farklı sistemde gerçekleştirilmesiyle doğrulanmıştır. Bu vektörler elektroporasyon ile Agrobacterium tumifaciens GV3101 suşu içine harekete geçirildi. GV3101 suşu, gentamisin direnci20olan etkisiz hale tedaklı bir Ti plazmid pMP90'a (pTiC58DT-DNA) sahiptir. Transgene susturma önlemek için tüm infiltratyonlarla birlikte bir p19 Agrobacterium suşu eklendi21. Üç proteinin üçlü etkileşimleri doğrulamak için zıt konformasyonlarda da kullanılmasını öneririz.
Bu teknikte, ilk olarak, bağışçının floresan ömrünün (söndürülmemiş donör ömrü) bir alıcının yokluğunda ölçüldüğü FLIM'i çalıştırdık. Bundan sonra, ömrü alıcının varlığında ölçülür (söndürülen donör ömrü). Donör floresan ömürlerindeki bu fark, floresan ömründe bir azalma gösteren foton sayısına bağlı olan FRET verimliliğini hesaplamak için kullanılır. Aşağıda, Nicotiana benthamiana'daki floresan etiketli proteinleri geçici olarak ifade ederek ve BiFC-FRET-FLIM ile etkileşimlerini test ederek herhangi bir üç protein arasında üçlü bir kompleks oluşumunu belirlemek için ayrıntılı bir protokol verilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml Syringes without needles</td>
			<td>Dispovan</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway&#160; LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11791020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>K240020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>F530-S</td>
			<td>Any High fidelity Polymerase can work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS1889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8 FALCON</td>
			<td>Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TC034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay

Protein-protein etkileşimleri hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde, sürdürülmesinde ve değiştirilmesinde çok önemli bir rol oynadıkları için hücrelerdeki tüm biyolojik süreçlerin ayrılmaz bir parçasıdır. Bu etkileşimler sinyal transdüksiyon, patojen yanıtı, hücre-hücre etkileşimleri, metabolik ve gelişimsel süreçler gibi çok çeşitli fenomenlerde yer almaktadır. Transkripsiyon faktörleri söz konusu olduğunda, bu etkileşimler alt ünüllerin oligomerizasyonuna, çekirdek, sitoplazma vb. Burada, Floresan Ömür Boyu Görüntülemeyi (FLIM) içeren Bimoleküler Floresan Kompleasyonu (BiFC) tabanlı Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) kullanarak in vivo üçlü etkileşimi görselleştirmek için bir metodoloji sunuyoruz. Bu gösteri için seçilen proteinlerden ikisi BiFC ortağı olarak etkileşime girer ve yeniden inşa edilen floresan aktiviteleri üçüncü ortakla FRET-FLIM'i test etmek için kullanılır. Dört ila beş haftalık büyüme odası tarafından yetiştirilen Nicotiana benthamiana bitkileri bu gösteri için model bitki sistemi olarak kullanılmıştır.

Bu protokol, bitkilerdeki vivo üçlü protein-protein etkileşimlerini incelemek için optimize edilmiş bir yöntemi temsil eder. Protokolün temel ilkesi, üç protein ortağı arasındaki üçlü kompleks oluşumunu ölçmek için bir test oluşturmak için iki floresan etiketli protein etkileşimi tekniğini, yani BiFC ve FRET'i birleştirmektir. Burada FRET bağışçısının varlığında ve yokluğunda FRET donör ortağının floresan ömrünü ölçmek için FLIM'i kullandık. İki protein arasında o...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Burada, BiFC tabanlı FRET-FLIM test tarafından floresan etiketli proteinler kullanarak üç protein ortağı arasındaki üçlü kompleks oluşumunu görselleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, protein-proteinetkileşim komplekslerini vivo olarak incelemek için değerlidir.

BiFC-FRET-FLIM Tahlilinde MADS Kutusu Transkripsiyon Faktörünün İki Monomeri ile Kalsiyum Sensör Proteini Arasındaki Üçlü Etkileşimin Belirlenmesi

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

Protein-protein etkileşimlerinin incelenmesi, birçok biyolojik işlemin düzenlenmesinin anlaşılmasını sağlar. Burada Y John ayakkabı ve co tarafından baş harfle açıklanan bir prosedürü gösteriyoruz. 2007'de, yazarların üç protein molekülü arasındaki üçlü etkileşimi doğrulamak için FRET ile birlikte BiFC'yi kullandıkları işçiler.Bununla birlikte, FRET ölçümlerini doğrulamak için floresan ömür ölçümlerini bu prosedüre dahil ettik. Üçlü etkileşimi göstermek için homodimerize olduğu bilinen bir protein seçtik. Ayrıca, bu protokolde C proteini olarak adlandırılan bir kalsiyum protein sensörü ile etkileşime girmek için şirket içinde de doğrulanmıştır.MNC proteinleri sitoplazmda etkileşime girer. Bu teknikte iki protein bölünmüş YFP proteinleri ile etiketlenir. Etkileşimleri, FRET bağışçısı olarak hareket eden CFP ile etiketlenen üçüncü etkileşim ortağına FRET kabulörü olarak hareket eden işlevsel YFP'nin iadesiyle sonuçlanır.Bizim durumumuzda M ve C genleri olan ilgi genlerinin kodlama dizilerinin PCR tarafından yükseltilmesi ile başlayın ve uygun giriş vektörlerinde klonlayın. Plaka içeren antibiyotiklerde seçilen klonları, sindirimi ve DNA dizilimini kısıtlayarak doğrulayın. Yeniden inşa edilen CDS'leri giriş klonlarından hedef vektörlere harekete geçirin.Bu denemede kullanılan tüm vektörler tablo bir'de listelenmiştir. Son olarak, agrobakteri GV3101 hücrelerini hedef vektörlerle elektroporasyon ile dönüştürün. Burada Nicotiana Benthamiana bitkilerini yetiştiriyoruz, hala bir yetiştirme odasında kontrollü koşullarda dört ila altı yaprak aşaması.Toprak ezmesi, kakao turbası ve kompostu 2:1:1 oranında karıştırarak toprak karışımını hazırlayın. Toprak yatağı yapmak ve biraz suyla doyurmak için bu karışımın bir inç kalınlığında tabakasını plastik bir tepsiye yayın. Toprağın üzerine yaklaşık 200 tohum serpin ve yaklaşık bir santimetre duran suya daha büyük bir tepsiye aktarın.Nem odası oluşturmak için bu tepsiyi plastik sargı ile örtün. Bu tepsiyi 16 saat ışık ve sekiz saat karanlık döngü ile 23 derecelik bir büyüme odasına aktarın. İki hafta sonra genç fideleri su doymuş toprak karışımı içeren küçük üç ila dört inç saksılara aktarın.Bu saksıları plastik bir tepsiye yerleştirin ve dört hafta daha oda büyütmek için aktarın. Agroinfiltrasyon için bakteri suşlarının taze alt kültüre edilmesi ve uygun oranlarda P19 agrobakteri suşu ile karıştırılması gerekir. BiFC ve FRET yapılarını içeren GV3101 agrobakteri suşlarını 10 ml'lik çizgi plakalardan aşılayarak bu işleme başlayın.uygun antibiyotikler içeren et suyuna. Ayrıca, transgene susturma önlemek için eklenen Agrobacteria P19 suşu kültürünü başlatın. Şişeyi alüminyum folyo ile örtün ve bir inkübatör çalkalayıcıda tutun, 16 saat boyunca 170 RPM'de 28 derece santigrat derece ayarlayın.Bir gecede büyümeden sonra, bu kültürlerin 1 ml'si, bir spektrofotometre kullanarak 600 nanometredeki optik yoğunluğu ölçmek için tek kullanımlık bir kübite aktarılır. Son OD 0,5 ve P19'unki toplam 2 ml hacimde 0,3 olacak şekilde suşlar içeren uygun BiFC ve FRET ortağının kültürlerini karıştırın.Bu oranlara ulaşmak için bu hesaplamalar için ekranda gösterilen formülü takip ediyoruz. 3000G'deki karışık agrobakteri kültürlerini oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin ve süpernatantı dikkatlice atın. Peletleri 2 ml'de askıya alın.sızma arabelleği. Homojen bir hücre süspansiyonundaki hücreleri tamamen yeniden askıya almak için bir girdap karıştırıcı kullanmanız gerekebilir. Bundan sonra tüpleri üç saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.Bu arada, içine sızacağı yapı karışımı için her bir bitki saksısını etiketleyin. 1 ml. iğnesiz bir şırıngayı agrobakteriyal karışımla doldurun.Şırınd ucunu yavaşça ama sıkıca tamamen genişletilmiş bir yaprağın abaksiyel tarafına bastırın ve yaprağı diğer taraftan destekleyin. Çözelti, şırıng ucuna göre iki ila üç kat daha eşdeğer yaprak alanında dolana kadar pistonu hafifçe itin. Bir yaprakta dört noktaya kadar bakteri karışımına sızın ve bir tür sızma için üç ila dört yaprak için bu prosedürü tekrarlayın.Ayrıca, sızma için yapı başına en az iki bitki ekleyin. Çapraz bulaşmayı önlemek için ellerinizi %70 alkolle silmeyi veya eldivenlerinizi değiştirmeyi unutmayın. Tüm tencereleri bir tepsiye aktarın ve aynı büyüme durumunda büyüme odasında kuluçkaya yatırın.Agroinfiltrated yaprağın küçük bir kısmını floresan mikroskop kullanarak kontrol edin. Hücrelerde hem YFP hem de CFP floresan tespit edildiğinde BiFC FRET-FLIM tahlil için konfokal mikroskopa geçilir. Bizim durumumuzda, bu analiz agroinfiltrasyondan üç gün sonra gerçekleştirildi.Artık bitkiler mikroskop altında görselleştirilmeye hazır olduğu için kare yaprak örneklerini beş ila 8 mm arasında kesin. Üzerine temiz bir kapak kayması yerleştirin ve mühürleyin.Bu örnekleri konfokal lazer tarama mikroskobunda görselleştirin. Bu prosedürde, iki protein arasındaki etkileşimi belirlemenin ve ölçmenin temeli, FRET donör ortağının FRET'in verimliliğini hesaplamak için kullanılan alıcı ile etkileşimi üzerine floresan ömrünün azalmasıdır. Üçlü etkileşim durumunda karmaşıklık daha da artar, çünkü bu durumda FRET kabul eden tek bir molekül değil, işlevsel bir FRET kabul edici floroforu olmak için in vivo olarak yeniden inşa edilmesi gereken bölünmüş bir YFP BiFC çiftidir.FRET-FLIM'i gerçekleştirmek için, donör moleküllerin floresan ömrünü, önce tek başına ve daha sonra bir FRET ortağının varlığında belirlemeliyiz. FLIM uygulamasını konfokal lazer tarama mikroskobunda açın, konsolu başlatın ve floresan ömrünü ölçmek için desen tanıma foton sayımını kullanın. Standart tüm foton sayım ölçüm modunu seçin.İki tür agroinfiltratlı bitki alacağız. Biri CCFP geni olan diğeri MYFP ile birlikte CCFP'ye sahip olan Çünkü M proteininin etkileşimi BiFC ve Y2H kullanılarak C proteini ile zaten doğrulandı, bu etkileşim çifti ile iyi FRET verimliliği bekliyoruz. Şimdi önce CCFP agroinfiltrated yaprağını tarayıp iyi CFP floresan gösteren bir hücre arıyoruz.Mikroskop ayarları ekranda gösterilir. Örnek, nabız başına yaklaşık 0,1 foton elde etmek için yeterli lazer gücünde aydınlatıldı. Değişken floresan yoğunluğuna sahip numuneler için, ömür boyu ölçüm için gerekli yeterli fotonları toplamak için 50 kare yakalayacağız.CFP'nin onay adaptasyonu nedeniyle iki floresan ömrü sergilediği bilindiğinden, N değerini ikiye eşit tutarken üstel bir rekonsvolüm modeli kullanarak verileri besliyoruz. Bu ayarlarda, iki ömür bir ve 3,2 nanosaniyede görülebilir. Sonraki tüm hesaplamalar için daha yüksek ömrü kullanacağız.Şimdi CCFP ve MYFP arasındaki FRET'i ölçmeye hazırlanıyoruz. Bunun için CCFP ve MYFP ile agroinfiltrated tesisinden yaprak örneğini kullanalım. Hem CCFP hem de MYFP'yi ifade eden bir hücre arıyoruz ve tam 40 nanometre darbe lazeri ve 514 nanometre beyaz ışık lazeri kullanarak onları heyecanlayarak ilgili emisyon modellerini onaylıyoruz.Bundan sonra, CCFP'nin ömrünü ölçmek için daha önce kullandığımız ayarları kullanarak CFP'nin ömrünü ölçmek için FLIM konsoluna geçiyoruz. Ancak bu kez hücre, CCFP ile potansiyel olarak etkileşime girebilen ve CCFP ömründe bir azalmaya neden olabilen MYFP'yi de ifade ediyor. N üstel rekonsvolüm modeli kullanılarak elde edilen grafiği ikiye eşit N ile okuduğumuz için, CFP ömründe 3,2 ila 2,6 nanosaniye arasında bir azalma vardır.Şimdi yazılımda FRET konsolunu başlatıyoruz ve yazılımda sağlanan denkleme tartışmasız ömür girerek FRET verimliliğini hesaplıyoruz ve gözlemlenen FRET verimliliği% 56 Şimdi son adıma geçelim, yani üç ortak arasındaki etkileşimi görselleştirelim. Bunun için CCFP ve MYFPN ile birlikte sızmış bir tesisten yaprak örneğini MYFPC ile alıyoruz. Yaprak bitkisini hem CFP hem de iki M proteini arasındaki etkileşimden kaynaklanan yeniden inşa edilmiş YFP floresanını gösteren bir hücre için tararız.Daha önce kullanılan lazer ve emisyon dalga boylarını kullanıyoruz. Daha sonra, 514 nanometre lazeri kapatıp FLIM konsoluna geçiyoruz. MYFP dimer CCFP ile etkileşime girerse.MYFP ile etkileşimi sırasında gözlemlendiği gibi CCFP'nin ömründe bir azalma görmeliyiz. Bununla birlikte, CCFP MYFP dimer ile etkileşime giremezse, floresan ömrü 3,2 nanosaniyede görünmelidir. Yukarıda belirtildiği gibi benzer ayarları kullanarak, CFP ömrünü yeniden inşa edilmiş YFP'nin varlığında ölçüyoruz.N üstel rekonsvolution modelini kullanarak grafiği ikiye eşit olarak sığdırıyoruz ve FRET konsoluna geçiyoruz. Ve evet CFP ömründe 3.2'den 2.3 nanosaniyeye kadar bir düşüş var. FRET verimliliğini yukarıda açıklandığı gibi hesaplıyoruz.Hesaplanan FRET verimliliği % 55 Burada FRET donör ortağının FRET kabul edenin varlığında ve yokluğunda floresan ömrünü ölçmek için FLIM'i kullandık. İki protein arasında olumlu bir etkileşim varsa, donörün floresan ömründe bir azalma bekleniyordu. Pozitif kontrol durumunda, ccfp ve MYFP'dir.Donörün floresan ömründe 3,3 ila 2,5 nanosaniye arasında bir azalma gözlemliyoruz ve FRET verimliliği% 56 yeniden inşa edilen benzer bir egzersizdi. İki amonomer ve C proteini arasındaki etkileşimden kaynaklananYFP, donörün floresan ömrünün 2,6 nanosaniyeye düşmesine yol açan pozitif bir FRET etkileşimine neden oldu. Hesaplanan FRET verimliliği bu durumda yaklaşık% 55 idi. FRET donörün floresan ömründeki azalma, bu proteinler arasındaki üçlü etkileşim için güçlü bir kanıt sağlar.Burada açıklanan protokol, canlı hücrelerde üçlü protein-protein etkileşimlerini belirlemek için güçlü bir araçtır. Bu prosedür ayrıca, herhangi bir protein kompleksinin işlevini ve fizyolojik önemini çözmede önemli olan sonuç komplekslerinin hücre içi lokalizasyonunu belirlemeye yardımcı olabilir. Sonuç olarak, BiFC tabanlı FRET-FLIM tahlil, hem hayvansal hem de bitki sistemlerinde protein-protein etkileşimi çalışmalarında yardımcı olabilecek üçlü protein etkileşimlerinin önemli yönlerini incelemek ve karakterize etmek için bir fırsat sunmaktadır.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Dört Transkripsiyon Faktör Fare Embriyonik Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi, Doksisiklin lentiviral İletim Sistemi Đndüklenebilir

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Helios Gen Tabancası kullanarak Soğan Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Elektrokemiluminesan immunoassay Serum Kardiyak Miyozin Bağlayıcı Protein-C belirlenmesi için hassas ve özel miktar tayini yöntemi

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...