Name: mesoscopic optical imaging of whole mouse heart
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart at JoVE.com

تلقى هذا المشروع تمويلا من برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 952166 (REPAIR) ، MUR في إطار برنامج FISR ، مشروع FISR2019_00320 ومنطقة توسكانا ، باندو ريسركا تحية 2018 ، مشروع PERCARE.

تم تنفيذ جميع إجراءات وإجراءات التعامل مع الحيوانات وفقا للإرشادات الواردة في التوجيه 2010/63 / EU الصادر عن البرلمان الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة للأغراض العلمية وتتوافق مع مبادئ وأنظمة وزارة الصحة الإيطالية. تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل وزارة الصحة الإيطالية (ال?...

<ol>
	<li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li><li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy:+genetic+basis,+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death.">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li><li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function.">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li><li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation.">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+of+fixed+tissue:+a+review+from+a+microscopist's+perspective.">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers.">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart.">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).</li><li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls.">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li><li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery.">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li><li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles.">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li><li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue.">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808 (2015).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes.">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).</li><li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvessel+prediction+in+H&amp;E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks.">Microvessel prediction in H&amp;E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+whole-organ/body+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues.">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).</li></ol>

في هذا العمل ، تم تقديم نهج ناجح لمسح وصبغ وصورة قلب فأر كامل بدقة عالية. أولا ، تم تحسين بروتوكول تحويل الأنسجة (CLARITY) وتنفيذه ، وتم تعديله قليلا لتطبيقه على أنسجة القلب. في الواقع ، للحصول على إعادة بناء فعالة في 3D من القلب كله ، من الضروري منع ظاهرة تشتت الضوء. تسمح لنا منهجية CLARITY بالحصول ع?...

يمكن أن تؤثر إعادة البناء الهيكلي المرتبطة بأمراض القلب على التوصيل الكهربائي وإدخال اختلالات كهروميكانيكية للجهاز 1,2. عادة ما تستخدم الأساليب الحالية المستخدمة للتنبؤ بالتغيرات الوظيفية التصوير بالرنين المغناطيسي و DT-MRI للحصول على إعادة بناء شاملة لترسب التليف وشجرة الأوعية الدموية وتوزيع الألياف للقلب ، ويتم استخدامها لنمذجة مسارات انتشار إمكانات العمل التفضيلي (APP) عبر العضو 3,4. يمكن أن توفر هذه الاستراتيجيات نظرة عامة جميلة على تنظيم القلب. ومع ذلك ، فإن دقتها المكانية غير كافية للتحقيق في تأثير إعادة البناء الهيكلي على وظيفة القلب على المستوى الخلوي.
إن وضع هذا الإطار في ترتيب مختلف من حيث الحجم ، حيث يمكن للخلايا المفردة أن تلعب أدوارا فردية في انتشار جهد الفعل ، يمثل تحديا. القيد الرئيسي هو عدم كفاءة طرق التصوير القياسية لأداء تصوير عالي الدقة (دقة ميكرومترية) في الأنسجة الضخمة (بحجم السنتيمتر). في الواقع ، تصوير الأنسجة البيولوجية في 3D بدقة عالية أمر معقد للغاية بسبب عتامة الأنسجة. الطريقة الأكثر شيوعا لإجراء إعادة بناء 3D في الأعضاء بأكملها هي إعداد أقسام رقيقة. ومع ذلك ، فإن التقسيم الدقيق والتجميع والتصوير يتطلب جهدا ووقتا كبيرين. النهج البديل الذي لا يتطلب قطع العينة هو توليد نسيج شفاف. خلال السنوات الأخيرة ، تم اقتراح عدة منهجيات لتوضيح الأنسجة5،6،7،8. تم تحقيق التحدي المتمثل في إنتاج أنسجة ضخمة وشفافة وموسومة بالفلورسنت مؤخرا من خلال تطوير مناهج تحويل الأنسجة الحقيقية (CLARITY9 ، SHIELD10). على وجه الخصوص ، تعتمد طريقة CLARITY على تحويل الأنسجة السليمة إلى شكل نانوي مسامي ، مهجن هيدروجيل ، خال من الدهون يمكن من منح شفافية عالية عن طريق الإزالة الانتقائية لطبقات الدهون الغشائية المزدوجة. والجدير بالذكر أن هذه الطريقة قد وجدت ناجحة أيضا في إعداد القلب11،12،13،14. ومع ذلك ، نظرا لأن القلب هش للغاية بحيث لا يكون مناسبا للمقاصة النشطة ، فيجب تطهيره باستخدام النهج السلبي ، والذي يتطلب وقتا طويلا لمنح الشفافية الكاملة.
بالاقتران مع تقنيات التصوير المتقدمة مثل الفحص المجهري للصفائح الضوئية ، فإن CLARITY لديه القدرة على تصوير أنسجة القلب الضخمة 3D بدقة ميكرومترية. في الفحص المجهري للورقة الضوئية ، يتم إجراء إضاءة العينة باستخدام ورقة رقيقة من الضوء محصورة في المستوى البؤري لهدف الكشف. يتم جمع انبعاث التألق على طول محور عمودي على مستوى الإضاءة15. تشبه بنية الكشف الفحص المجهري واسع المجال ، مما يجعل الاستحواذ أسرع بكثير من مجاهر المسح بالليزر. يسمح نقل العينة عبر ورقة الضوء بالحصول على تصوير مقطعي كامل للعينات الكبيرة ، حتى عينات بحجم سنتيمتر. ومع ذلك ، نظرا للخصائص الجوهرية لحزمة Gaussian ، من الممكن الحصول على ورقة ضوئية رقيقة جدا (بترتيب بضعة ميكرونات) فقط لامتداد مكاني محدود ، مما يحد بشكل كبير من مجال الرؤية (FoV). في الآونة الأخيرة ، تم تقديم مخطط إثارة جديد للتغلب على هذا القيد وتطبيقه على تصوير الدماغ ، مما يسمح بإعادة البناء ثلاثي الأبعاد بدقة16.
في هذه الورقة ، يتم تقديم نهج المقاصة السلبية ، مما يتيح تقليل كبير في توقيت المقاصة الذي يحتاجه بروتوكول CLARITY. يسمح الإطار المنهجي الموصوف هنا بإعادة بناء قلب فأر كامل بدقة ميكرومترية في مسح مقطعي واحد مع وقت اكتساب في حدود الدقائق.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-2&#8217; Thiodiethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>166782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>61-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AV-044 Initiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>AVP5874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca flash 4.0 v3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HC Image</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimating lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection arm</td>
			<td>Integrated optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>91863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extera&#236;nal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fold mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BBE1-E02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometric mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS211/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>4.6.1.19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser source</td>
			<td>Integrated Optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long-pass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KB25/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>CI-1316-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized traslator</td>
			<td>Physisk Instrument</td>
			<td>M-122.2DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TL2X-SAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycap AS</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>2606T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relay lens</td>
			<td>Qioptiq</td>
			<td>G063200000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACT508-200-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable lens</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>KNF Neuberger Inc</td>
			<td>N86KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WTB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesoscopic optical imaging of whole mouse heart

يمكن أن تسبب كل من أمراض القلب الوراثية وغير الوراثية عمليات إعادة تشكيل شديدة في القلب. يمكن أن تؤثر إعادة البناء الهيكلي ، مثل ترسب الكولاجين (التليف) والاختلال الخلوي ، على التوصيل الكهربائي ، وإدخال اختلالات كهروميكانيكية ، وفي النهاية تؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب. تستند النماذج التنبؤية الحالية لهذه التعديلات الوظيفية إلى معلومات هيكلية غير متكاملة ومنخفضة الدقة. يعد وضع هذا الإطار على ترتيب مختلف من حيث الحجم أمرا صعبا بسبب عدم فعالية طرق التصوير القياسية في إجراء تصوير عالي الدقة في الأنسجة الضخمة. في هذا العمل ، نصف إطارا منهجيا يسمح بتصوير قلوب الفئران بأكملها بدقة ميكرومترية. وقد تطلب تحقيق هذا الهدف جهدا تقنيا حيث تم الجمع بين التقدم في تحويل الأنسجة وطرق التصوير. أولا ، نصف بروتوكول CLARITY المحسن القادر على تحويل القلب السليم إلى شكل نانوي مسامي ، مهجن هيدروجيل ، خالي من الدهون يسمح بشفافية عالية وتلطيخ عميق. بعد ذلك ، يتم وصف مجهر ورقة ضوئية مضان قادر على الحصول بسرعة على صور لمجال رؤية ميزوسكوبي (مقياس مم) بدقة مقياس ميكرون. بعد مشروع mesoSPIM ، يسمح المجهر المصمم بإعادة بناء قلب الفأر بالكامل بدقة ميكرومترية في مسح مقطعي واحد. نعتقد أن هذا الإطار المنهجي سيسمح بتوضيح تورط فوضى العمارة الخلوية في الاختلالات الكهربائية ويمهد الطريق لنموذج شامل يأخذ في الاعتبار كل من البيانات الوظيفية والهيكلية ، مما يتيح تحقيقا موحدا للأسباب الهيكلية التي تؤدي إلى تغييرات كهربائية وميكانيكية بعد إعادة تشكيل الأنسجة.

يسمح إعداد المقاصة السلبية المطور بالحصول على قلب فأر بالغ تم تطهيره (ببعد من الطلب 10 مم × 6 مم × 6 مم) في حوالي 3 أشهر. يتم تثبيت جميع مكونات الإعداد كما هو موضح في الشكل 1. يسمح تدرج درجة الحرارة الضئيل بين كل غرفة مقاصة (بترتيب 3 درجات مئوية) بالحفاظ على درجة الحرارة في نطاق منا...

Watch this Scientific Journal Video about Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart at JoVE.com

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

نبلغ عن طريقة لإعادة البناء الميزوسكوبي لقلب الفأر بالكامل من خلال الجمع بين التطورات الجديدة في تحويل الأنسجة وتلطيخها مع تطوير مجهر ورقة ضوئية ممسوحة محوريا.

التصوير البصري بالمنظار لقلب الفأر بالكامل

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

تجمع هذه المنهجية بين تحسين بروتوكول المقاصة وقدرة العين على التقسيم البصري لتقنية Mesos PIM مما يسمح لنا بإجراء عمليات إعادة بناء متوسطة المنظار بدقة ميكرومترية. يوفر إمكانية تصوير أنسجة القلب الضخمة أو حل قلوب الفأر بالكامل في مسح واحد دون فقدان تنظيم الأنسجة ثلاثي الأبعاد الأصلي. بعد أن يتم تقليب القلب بواسطة الشريان الأورطي القريب المغسول في محلول تيرو وتثبيته في 4٪ ألدهيد بارافورم في 0.01 مولار PBS ، يكون جاهزا لبدء بروتوكول المقاصة.اغسل القلب ثلاث مرات في 0.01 مولار PBS عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد هذه الخطوة ، يمكن تخزين القلب في PBS و 0.01٪ أزيد الصوديوم عند أربع درجات مئوية لعدة أشهر. احتضان القلب في 20 ملليلتر من محلول هيدروجيل في حالة اهتزاز عند 15 دورة في الدقيقة لمدة ثلاثة أيام عند أربع درجات مئوية.قم بإزالة الغاز من العينة في درجة حرارة الغرفة باستخدام مجفف ومضخة تفريغ ونظام أنبوب يربط المجفف بكل من شريط المضخة وخط أنابيب النيتروجين. ضع العينة في المجفف وافتح القارورة مع إبقاء الغطاء عليها. أغلق المجفف وأزل الأكسجين من الأنبوب عن طريق فتح خط أنابيب النيتروجين.قم بتشغيل مضخة التفريغ لإزالة الأكسجين من المجفف لمدة 10 دقائق. قم بإيقاف تشغيل المضخة وافتح مقبض المجفف إلى خط أنابيب النيتروجين. ثم افتح صنبور النيتروجين.بمجرد أن يكون الضغط مساويا للضغط الجوي ، افتح المجفف بعناية وأغلق القارورة بسرعة. احتفظ بالقلب في محلول هيدروجيل منزوع الغازات عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات تقريبا في حالة راحة. عندما يتم بلمرة الهيدروجيل بشكل صحيح ويبدو جيلاتينيا تماما ، قم بإزالة القلب منه بعناية ووضعه في محلول مقاصة في القارورة بمحلول تطهير.قم بتغيير محلول المقاصة في القارورة مرة كل ثلاثة أيام لتسريع إجراء التوضيح. بمجرد أن يظهر القلب واضحا تماما ، أخرجه من القارورة واغسله في 50 ملليلتر من برنامج تلفزيوني دافئ لمدة 24 ساعة في حالة اهتزاز. اغسل مرة أخرى في 50 ملليلتر من X PBS T لمدة 24 ساعة في حالة الاهتزاز.احتضان العينة في 0.01 ملليغرام لكل ملليلتر جنين القمح aglutinin أرضية Alexa 633 في ثلاثة ملليلتر من واحد X PBS T في حالة اهتزاز عند 50 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة سبعة أيام. بعد الحضانة لمدة سبعة أيام ، اغسل العينة في 50 ملليلتر من X PBS T في درجة حرارة الغرفة في الاهتزاز لمدة 24 ساعة. احتضان العينة في 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة ثم اغسلها ثلاث مرات في 0.01 مولار PBS لمدة خمس دقائق لكل منها.احتضان القلب على التوالي في 20 و 47٪ TDE في 0.01 PBS المولي لمدة ثماني ساعات لكل منهما. ثم أخيرا عند 68٪ TDE في 0.01 المولي PBS لتوفير معامل الانكسار المطلوب 1.46. املأ برفق حوالي 80٪ من كوارتز الكوارتز الخارجي بوسط معامل الانكسار.املأ كوارتز الكوارتز الداخلي بنفس وسيط معامل الانكسار. اغمر العينة داخل quvet الداخلي. حرك العينة برفق إلى أسفل الكوفيت باستخدام ملاقط رفيعة ورتب القلب بمحوره الطولي الموازي للمحور الرئيسي للكوفيت لتقليل مسار ضوء الإثارة عبر الأنسجة أثناء المسح.قم بإصلاح القابس المخصص بعناية فوق quvet الداخلي بمسمارين. قم بتركيب العينة على مرحلة المجهر باستخدام المغناطيس. قم بترجمة مرحلة العينة الرأسية يدويا لغمر quvet الداخلي في المرحلة الخارجية.قم بتشغيل مصدر ضوء الإثارة بطول موجي يبلغ 638 نانومتر واضبطه على طاقة منخفضة في حدود ثلاثة ملي واط. حرك العينة باستخدام المترجم الآلي لإضاءة لوحة داخلية من الأنسجة. قم بتشغيل برنامج الكاميرا الحية لصورة HC واضبط مشغل الكاميرا على وضع ورقة ضوء مشغل الحافة الخارجية لدفع مشغل الاستحواذ للكاميرا بواسطة البرنامج المخصص الذي يتحكم في الإعداد بالكامل.قم بتمكين الحفظ التلقائي في برنامج الكاميرا وقم بتعيين مجلد الإخراج حيث يجب حفظ الصور. اضبط موضع العينة يدويا في المستوى X Y باستخدام المترجمين الخطيين لنقل العينة إلى مركز مجال رؤية مستشعر الكاميرا. حرك العينة على طول المحور Z باستخدام المترجم الخطي الميكانيكي لتحديد حدود القلب لإعادة البناء المقطعي.قم بزيادة طاقة الليزر إلى حوالي 20 ملي واط قبل البدء في جلسة التصوير. ابدأ الاستحواذ المقطعي بالنقر فوق زر البدء في لوحة الالتقاط الخاصة ببرنامج التصوير ، وفي نفس الوقت ابدأ في تحريك العينة على طول المحور Z بسرعة ثابتة تبلغ ستة ميكرومتر في الثانية باستخدام المترجم الآلي. إن الجمع بين منهجية الوضوح مع TDE كوسيط معامل الانكسار لا يغير بشكل كبير الحجم النهائي للعينة ولا يؤدي إلى تشوه الخواص للعينة.أنتجت بصريات الإثارة ورقة ضوئية بحد أدنى من النفايات يبلغ حوالي ستة ميكرومتر تباعدت حتى 175 ميكرومتر على حافة مجال الرؤية. تضمن مزامنة مصراع الكاميرا المتداول مع المسح المحوري لنفايات ورقة الضوء جمع إشارة الانبعاث فقط في جزء العينة المتحمس مع نفايات ورقة الضوء مما يؤدي إلى متوسط F W H M يبلغ حوالي 6.7 ميكرومتر على طول مجال الرؤية بأكمله. تم أيضا تقدير وظيفة انتشار نقطة Z للمجهر من خلال إعادة بناء التصوير المقطعي للغلاف النانوي الفلوري وتم تقدير F W H M من 6.4 ميكرومتر بواسطة الملاءمة.كما تم تأكيد قدرة النظام على حل الأغشية الخلوية المفردة في ثلاثة أبعاد مع إشارة كافية إلى نسبة الضوضاء في العضو بأكمله. إجراء إزالة الغازات هو الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول. إذا لم يتم تنفيذه بشكل صحيح ، فقد تواجه الأنسجة أضرارا تشير أثناء الحضانة في محلول التنظيف.يمكن دمج البروتوكول المقدم مع بروتوكول متعدد التلوين لتحقيق إعادة بناء الأعضاء بالكامل التي تدمج الهياكل البيولوجية المختلفة ويمكن تطبيقها لدراسة النماذج المرضية.

mesoscopic-optical-imaging-of-whole-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

العناية والتنظيف السليم للمجهر

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

مكونات رئيسية مجهر الضوء

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

وعلى النقيض من مرحلة التدخل التفاضلية المجهري التباين (DIC)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

ولد لتطبيع الإسفار التصوير المقطعي الإسقاط الضوئية للتصوير القلب الجامع

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

شبه الآلي التحليل البصري نبضات القلوب الصغيرة

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

جرحشاعثزرحشرتاد الإسفار عن التصوير المقطعي في الجسم الحي. تصوير النامية ذبابة الفاكهة</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

رواية<em&gt; خارج الحي</em&gt; الطريقة الثقافة لالجنينية القلب

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

رسم الخرائط البصرية البينية العضلية شبكية كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; وإمكانية الغشاء في قلب الأرنب Langendorff perfused-

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

إعداد ذبابة الفاكهة والتصوير الطولي من وظيفة القلب في فيفو باستخدام البصرية بالاتساق المجهري (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...