Name: mesoscopic optical imaging of whole mouse heart
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart at JoVE.com

Dit project heeft financiering ontvangen van het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie onder subsidieovereenkomst nr. 952166 (REPAIR), MUR in het kader van het FISR-programma, project FISR2019_00320 en Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-project.

Alle dierbehandeling en -procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt en in overeenstemming met de beginselen en voorschriften van het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid. Het experimentele protocol werd goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (protocolnummer 647/2015-PR). Alle dieren werden geleverd door ENVIGO, Italië. Voor deze ex...

<ol>
	<li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li><li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy:+genetic+basis,+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death.">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li><li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function.">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li><li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation.">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+of+fixed+tissue:+a+review+from+a+microscopist's+perspective.">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers.">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart.">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).</li><li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls.">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li><li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery.">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li><li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles.">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li><li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue.">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808 (2015).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes.">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).</li><li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvessel+prediction+in+H&amp;E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks.">Microvessel prediction in H&amp;E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+whole-organ/body+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues.">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).</li></ol>

In dit werk werd een succesvolle aanpak geïntroduceerd om een heel muizenhart op hoge resolutie te zuiveren, te beitsen en in beeld te brengen. Eerst werd een weefseltransformatieprotocol (CLARITY) geoptimaliseerd en uitgevoerd, enigszins aangepast voor de toepassing ervan op het hartweefsel. Inderdaad, om een efficiënte reconstructie in 3D van een heel hart te verkrijgen, is het essentieel om het fenomeen van lichtverstrooiing te voorkomen. De CLARITY-methodologie stelt ons in staat om een zeer transparant intact hart...

Structurele remodellering geassocieerd met hartaandoeningen kan de elektrische geleiding beïnvloeden en elektromechanische disfuncties van het orgaan introduceren 1,2. Huidige benaderingen die worden gebruikt om functionele veranderingen te voorspellen, maken vaak gebruik van MRI en DT-MRI om een algehele reconstructie van fibroseafzetting, vasculaire boom en vezelverdeling van het hart te verkrijgen, en ze worden gebruikt om preferentiële actiepotentiaalvoortplanting (APP) -paden over het orgaan te modelleren 3,4. Deze strategieën kunnen een mooi overzicht geven van de hartorganisatie. Hun ruimtelijke resolutie is echter onvoldoende om de impact van structurele remodellering op de hartfunctie op cellulair niveau te onderzoeken.
Het plaatsen van dit raamwerk in een andere orde van grootte, waar afzonderlijke cellen individuele rollen kunnen spelen bij de verspreiding van actiepotentialen, is een uitdaging. De belangrijkste beperking is de inefficiëntie van standaard beeldvormingsmethoden om beeldvorming met hoge resolutie (micrometrische resolutie) uit te voeren in massieve (centimetergrote) weefsels. In feite is het afbeelden van biologische weefsels in 3D met hoge resolutie erg ingewikkeld vanwege weefselondoorzichtigheid. De meest gebruikelijke aanpak om 3D-reconstructies in hele organen uit te voeren, is het voorbereiden van dunne secties. Nauwkeurige secties, assemblage en beeldvorming vereisen echter aanzienlijke inspanning en tijd. Een alternatieve aanpak die niet vereist dat het monster wordt gesneden, is het genereren van een transparant weefsel. In de afgelopen jaren zijn verschillende methoden voor het ophelderen van weefsels voorgesteld 5,6,7,8. De uitdaging om massieve, transparante en fluorescerend gelabelde weefsels te produceren, is onlangs bereikt door echte weefseltransformatiebenaderingen te ontwikkelen (CLARITY9, SHIELD10). In het bijzonder is de CLARITY-methode gebaseerd op de transformatie van een intact weefsel in een nanoporeuze, hydrogel-gehybridiseerde, lipidevrije vorm die het mogelijk maakt om hoge transparantie te verlenen door de selectieve verwijdering van membraanlipide-bilayers. Opmerkelijk is dat deze methode ook succesvol is gebleken bij hartvoorbereiding 11,12,13,14. Omdat het hart echter te kwetsbaar is om geschikt te zijn voor een actieve opruiming, moet het worden geklaard met behulp van de passieve benadering, die veel tijd nodig heeft om volledige transparantie te verlenen.
In combinatie met geavanceerde beeldvormingstechnieken zoals light-sheet microscopie, heeft CLARITY het potentieel om 3D massieve hartweefsels met micrometrische resolutie in beeld te brengen. Bij lichtplaatmicroscopie wordt de verlichting van het monster uitgevoerd met een dunne vellen licht die zijn opgesloten in het brandpuntsvlak van het detectieobjectief. De fluorescentie-emissie wordt verzameld langs een as loodrecht op het verlichtingsvlak15. De detectiearchitectuur is vergelijkbaar met widefield-microscopie, waardoor de acquisitie veel sneller is dan laserscanmicroscopen. Door het monster door het lichtblad te verplaatsen, kan een volledige tomografie van grote monsters worden verkregen, tot centimeters groot. Vanwege de intrinsieke eigenschappen van de Gaussische bundel is het echter mogelijk om een zeer dunne (in de orde van enkele micron) lichtplaat alleen voor een beperkte ruimtelijke uitbreiding te verkrijgen, waardoor het gezichtsveld (FoV) drastisch wordt beperkt. Onlangs is een nieuw excitatieschema geïntroduceerd om deze beperking te overwinnen en toegepast voor beeldvorming van de hersenen, waardoor 3D-reconstructies met isotrope resolutie16 mogelijk zijn.
In dit document wordt een passieve clearingbenadering gepresenteerd, waardoor de clearingtiming die nodig is voor het CLARITY-protocol aanzienlijk kan worden verminderd. Het hier beschreven methodologische raamwerk maakt het mogelijk om een heel muizenhart met micrometrische resolutie te reconstrueren in een enkele tomografische scan met een acquisitietijd in de orde van minuten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-2&#8217; Thiodiethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>166782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>61-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AV-044 Initiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>AVP5874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca flash 4.0 v3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HC Image</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimating lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection arm</td>
			<td>Integrated optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>91863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extera&#236;nal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fold mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BBE1-E02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometric mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS211/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>4.6.1.19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser source</td>
			<td>Integrated Optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long-pass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KB25/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>CI-1316-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized traslator</td>
			<td>Physisk Instrument</td>
			<td>M-122.2DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TL2X-SAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycap AS</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>2606T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relay lens</td>
			<td>Qioptiq</td>
			<td>G063200000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACT508-200-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable lens</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>KNF Neuberger Inc</td>
			<td>N86KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WTB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesoscopic optical imaging of whole mouse heart

Zowel genetische als niet-genetische hartaandoeningen kunnen ernstige remodelleringsprocessen in het hart veroorzaken. Structurele remodellering, zoals collageenafzetting (fibrose) en cellulaire uitlijning, kan de elektrische geleiding beïnvloeden, elektromechanische disfuncties introduceren en uiteindelijk leiden tot aritmie. De huidige voorspellende modellen van deze functionele veranderingen zijn gebaseerd op niet-geïntegreerde structurele informatie met een lage resolutie. Het plaatsen van dit raamwerk op een andere orde van grootte is een uitdaging vanwege de inefficiëntie van standaard beeldvormingsmethoden bij het uitvoeren van beeldvorming met hoge resolutie in massief weefsel. In dit werk beschrijven we een methodologisch raamwerk dat beeldvorming van hele muizenharten met micrometrische resolutie mogelijk maakt. Het bereiken van dit doel heeft een technologische inspanning vereist waarbij vooruitgang in weefseltransformatie en beeldvormingsmethoden zijn gecombineerd. Ten eerste beschrijven we een geoptimaliseerd CLARITY-protocol dat in staat is om een intact hart te transformeren in een nanoporeuze, hydrogel-gehybridiseerde, lipidenvrije vorm die een hoge transparantie en diepe kleuring mogelijk maakt. Vervolgens wordt een fluorescentie lichtplaatmicroscoop beschreven die in staat is om snel beelden te verkrijgen van een mesoscopisch gezichtsveld (mm-schaal) met de resolutie op micronschaal. In navolging van het mesoSPIM-project maakt de bedachte microscoop de reconstructie van het hele muizenhart met micrometrische resolutie in een enkele tomografische scan mogelijk. Wij geloven dat dit methodologische kader het mogelijk zal maken om de betrokkenheid van de cytoarchitectuur-wanorde in de elektrische disfuncties te verduidelijken en de weg vrij te maken voor een uitgebreid model dat zowel de functionele als structurele gegevens beschouwt, waardoor een uniform onderzoek mogelijk wordt naar de structurele oorzaken die leiden tot elektrische en mechanische veranderingen na de weefselremodellering.

De ontwikkelde passieve clearing setup maakt het mogelijk om een geklaard volwassen muishart (met een afmeting van de orde 10 mm x 6 mm x 6 mm) te verkrijgen in ongeveer 3 maanden. Alle componenten van de opstelling zijn gemonteerd zoals weergegeven in figuur 1. De verwaarloosbare temperatuurgradiënt tussen elke clearingkamer (in de orde van 3 °C) maakt het mogelijk om de temperatuur in alle kamers in een goed bereik te houden.
<...

Watch this Scientific Journal Video about Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart at JoVE.com

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

We rapporteren een methode voor mesoscopische reconstructie van het hele muizenhart door nieuwe ontwikkelingen in weefseltransformatie en kleuring te combineren met de ontwikkeling van een axiaal gescande lichtplaatmicroscoop.

Mesoscopische optische beeldvorming van het hele muizenhart

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Deze methodologie combineert verbetering van het clearingprotocol met de oogcapaciteit van optische sectioning van de Mesos PIM-technologie, waardoor we een mesoscopische reconstructie met micrometrische resolutie kunnen uitvoeren. Het biedt de mogelijkheid om massieve hartweefsels of hele muizenharten in één scan in beeld te brengen zonder de oorspronkelijke driedimensionale weefselorganisatie te verliezen. Nadat het hart is gecannuleerd door proximale aorta gewassen in tyro-oplossing en gefixeerd in 4% Paraform aldehyde in 0,01 molaire PBS, is het klaar om het clearingprotocol te starten.Was het hart drie keer in 0,01 molaire PBS op vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Na deze stap kan het hart gedurende enkele maanden worden opgeslagen in PBS en 0,01% natriumazide bij vier graden Celsius. Incubeer het hart in 20 milliliter hydrogeloplossing in schudtoestand bij 15 RPM gedurende drie dagen bij vier graden Celsius.Ontgas het monster bij kamertemperatuur met behulp van een droger, een vacuümpomp en een buizensysteem dat de droger verbindt met zowel de pompband als de stikstofleiding. Plaats het monster in de droger en open de injectieflacon met de dop erop. Sluit de droger en haal de zuurstof uit de buis door de stikstofleiding te openen.Schakel de vacuümpomp in om de zuurstof gedurende 10 minuten uit de droger te verwijderen. Zet de pomp uit en open de knop van de droger naar de stikstofleiding. Open vervolgens de stikstofkraan.Zodra de druk gelijk is aan de atmosferische druk, opent u de droger voorzichtig en sluit u de injectieflacon snel. Houd het hart in de ontgaste hydrogeloplossing op 37 graden Celsius gedurende ongeveer drie uur in rust. Wanneer de hydrogel goed gepolymeriseerd is en er volledig gelatineus uitziet, verwijdert u het hart er voorzichtig uit en plaatst u het in een opruimoplossing in de injectieflacon met opruimoplossing.Vervang de clearingoplossing in de injectieflacon eens in de drie dagen om de verduidelijkingsprocedure te versnellen. Zodra het hart volledig geklaard lijkt, verwijdert u het uit de injectieflacon en wast u het in 50 milliliter opgewarmde PBS gedurende 24 uur in trillende toestand. Was opnieuw in 50 milliliter van één X PBS T gedurende 24 uur in schuddende toestand.Incubeer het monster in 0,01 milligram per milliliter tarwekiem aglutinine Alexa floor 633 in drie milliliter van één X PBS T in schuddende toestand bij 50 RPM bij kamertemperatuur gedurende zeven dagen. Was het monster na de incubatie van zeven dagen in 50 milliliter van één X PBS T bij kamertemperatuur tijdens het schudden gedurende 24 uur. Incubeer het monster in 4% PFA gedurende 15 minuten en was het vervolgens drie keer in 0,01 molaire PBS gedurende elk vijf minuten.Incubeer het hart achtereenvolgens in 20 en 47% TDE in 0,01 molaire PBS gedurende elk acht uur. En dan uiteindelijk bij 68%TDE in 0,01 molaire PBS om de vereiste brekingsindex van 1,46 te leveren. Vul voorzichtig ongeveer 80% van de externe kwarts quvet met het brekingsindexmedium.Vul de interne kwarts quvet met hetzelfde brekingsindexmedium. Dompel het monster onder in de interne quvet. Verplaats het monster voorzichtig naar de bodem van de quvet met behulp van een dun pincet en rangschik het hart met zijn lengteas parallel aan de hoofdas van de quvet om het excitatielichtpad door het weefsel tijdens het scannen te minimaliseren.Bevestig de op maat gemaakte plug voorzichtig boven de interne quvet met twee schroeven. Monteer het monster met magneten op de microscooptrap. Vertaal de verticale monstertrap handmatig om de interne quvet onder te dompelen in de externe.Schakel de excitatielichtbron met een golflengte van 638 nanometer in en zet deze op laag vermogen in de orde van drie milliwatt. Verplaats het monster met behulp van de gemotoriseerde vertaler om een binnenste plaat van het weefsel te verlichten. Schakel de HC image live camera-software in en stel de cameratrigger in op de externe rand trigger light sheet-modus om de acquisitietrigger van de camera aan te sturen door de aangepaste software die de hele installatie bestuurt.Schakel automatisch opslaan in de camerasoftware in en stel de uitvoermap in waarin de afbeeldingen moeten worden opgeslagen. Pas de monsterpositie in het X Y-vlak handmatig aan met de lineaire vertalers om het monster naar het midden van het gezichtsveld van de camerasensor te verplaatsen. Verplaats het monster langs de Z-as met behulp van de lineaire gemotoriseerde vertaler om hartgrenzen te identificeren voor tomografische reconstructie.Verhoog het laservermogen tot ongeveer 20 milliwatt voordat u begint aan de beeldvormingssessie. Start de tomografische acquisitie door op de startknop in het opnamepaneel van de beeldvormingssoftware te klikken en begin tegelijkertijd met het verplaatsen van het monster langs de Z-as met de constante snelheid van zes micrometer per seconde met behulp van de gemotoriseerde vertaler. De combinatie van de helderheidsmethode met TDE als brekingsindexmedium verandert het uiteindelijke volume van het monster niet significant en leidt evenmin tot een isotrope vervorming van het monster.De excitatie-optica produceerde een lichtplaat met een minimale verspilling van ongeveer zes micrometer die tot 175 micrometer divergeerde aan de rand van het gezichtsveld. De synchronisatie van de rolluik van de camera met de axiale scan van het afval van de lichtplaat zorgde ervoor dat het emissiesignaal alleen in het monstergedeelte werd verzameld dat werd geëxciteerd met het afval van de lichtplaat, wat resulteerde in een gemiddelde F B H M van ongeveer 6,7 micrometer over het hele gezichtsveld. De Z-puntspreidingsfunctie van de microscoop werd ook geschat door een tomografische reconstructie van de fluorescerende nanosfeer en een F W H M van 6,4 micrometer werd geschat door de fit.De mogelijkheid van het systeem om enkelvoudige celmembranen in drie dimensies op te lossen met een voldoende signaal-ruisverhouding in het hele orgaan werd ook bevestigd. De ontgassingsprocedure is de meest kritieke stap van het protocol. Als het niet goed wordt uitgevoerd, kan het weefsel tijdens de incubatie schade oplopen die aangeeft in een reinigingsoplossing.Het gepresenteerde protocol kan worden gecombineerd met een multi-kleuringsprotocol om een hele orgaanreconstructie te bereiken waarbij verschillende biologische structuren worden geïntegreerd en kan worden toegepast om pathologische modellen te bestuderen.

mesoscopic-optical-imaging-of-whole-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Een goede verzorging en reiniging van de microscoop

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Belangrijke componenten van de lichtmicroscoop

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast en differentieel interferentie contrast (DIC) Microscopie

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

Geboren Normalisatie voor fluorescentie optische projectie Tomografie voor Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Semi-automatische Optical Heartbeat Analyse van kleine hart

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo beeldvorming en therapeutische behandelingen in een orthotope Muis Model van eierstokkanker

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultuur Methode voor de embryonale Mouse Hart

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Optische kaart brengen van Intra-sarcoplasmareticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; En Transmembrane potentieel in de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Voorbereiding en longitudinale beeldvorming van het hart functie in vivo met behulp van Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...