Name: mesoscopic optical imaging of whole mouse heart
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00
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Ce projet a reçu des financements du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n ° 952166 (REPAIR), MUR dans le cadre du programme FISR, projet FISR2019_00320 et Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, projet PERCARE.

Toutes les manipulations et procédures des animaux ont été effectuées conformément aux directives de la directive 2010/63/UE du Parlement européen sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et conformes aux principes et règlements du ministère italien de la Santé. Le protocole expérimental a été approuvé par le ministère italien de la Santé (protocole numéro 647/2015-PR). Tous les animaux ont été fournis par ENVIGO, Italie. Pour ces expériences, 5 souris mâles C57BL/6J âgées d...

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	<li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li><li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy:+genetic+basis,+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death.">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li><li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function.">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li><li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation.">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+of+fixed+tissue:+a+review+from+a+microscopist's+perspective.">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers.">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart.">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).</li><li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls.">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li><li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery.">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li><li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles.">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li><li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue.">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808 (2015).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes.">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).</li><li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvessel+prediction+in+H&amp;E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks.">Microvessel prediction in H&amp;E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+whole-organ/body+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues.">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).</li></ol>

Dans ce travail, une approche réussie pour nettoyer, colorer et imager un cœur de souris entier à haute résolution a été introduite. Tout d’abord, un protocole de transformation tissulaire (CLARITY) a été optimisé et réalisé, légèrement modifié pour son application sur le tissu cardiaque. En effet, pour obtenir une reconstruction efficace en 3D de tout un cœur, il est indispensable de prévenir le phénomène de diffusion de la lumière. La méthodologie CLARITY nous permet d’obtenir un cœur intact tr...

Le remodelage structurel associé aux maladies cardiaques peut affecter la conduction électrique et introduire des dysfonctionnements électromécaniques de l’organe 1,2. Les approches actuelles utilisées pour prédire les altérations fonctionnelles utilisent couramment l’IRM et l’IRM-DT pour obtenir une reconstruction globale du dépôt de fibrose, de l’arbre vasculaire et de la distribution des fibres du cœur, et elles sont utilisées pour modéliser les voies de propagation du potentiel d’action préférentielle (APP) à travers l’organe 3,4. Ces stratégies peuvent fournir un bel aperçu de l’organisation du cœur. Cependant, leur résolution spatiale est insuffisante pour étudier l’impact du remodelage structurel sur la fonction cardiaque au niveau cellulaire.
Il est difficile de placer ce cadre à un ordre de grandeur différent, où des cellules individuelles peuvent jouer des rôles individuels dans la propagation du potentiel d’action. La principale limitation est l’inefficacité des méthodes d’imagerie standard pour effectuer une imagerie à haute résolution (résolution micrométrique) dans des tissus massifs (de la taille d’un centimètre). En fait, l’imagerie de tissus biologiques en 3D à haute résolution est très compliquée en raison de l’opacité des tissus. L’approche la plus courante pour effectuer des reconstructions 3D dans des organes entiers consiste à préparer des sections minces. Cependant, un sectionnement, un assemblage et une imagerie précis nécessitent beaucoup d’efforts et de temps. Une approche alternative qui ne nécessite pas de couper l’échantillon consiste à générer un tissu transparent. Au cours des dernières années, plusieurs méthodologies de clarification des tissus ont été proposées 5,6,7,8. Le défi de produire des tissus massifs, transparents et marqués par fluorescence a récemment été relevé en développant de véritables approches de transformation tissulaire (CLARITY9, SHIELD10). En particulier, la méthode CLARITY est basée sur la transformation d’un tissu intact en une forme nanoporeuse, hybride hydrogel, sans lipides qui permet de conférer une grande transparence par l’élimination sélective des bicouches lipidiques membranaires. Notamment, cette méthode s’est avérée efficace également dans la préparation cardiaque11,12,13,14. Cependant, comme le cœur est trop fragile pour convenir à une clairière active, il doit être dégagé en utilisant l’approche passive, qui nécessite beaucoup de temps pour conférer une transparence complète.
En combinaison avec des techniques d’imagerie avancées telles que la microscopie à feuille de lumière, CLARITY a le potentiel d’imager en 3D des tissus cardiaques massifs à une résolution micrométrique. En microscopie à feuille de lumière, l’éclairage de l’échantillon est réalisé avec une fine feuille de lumière confinée dans le plan focal de l’objectif de détection. L’émission de fluorescence est recueillie le long d’un axe perpendiculaire au plan d’éclairage15. L’architecture de détection est similaire à la microscopie à grand champ, ce qui rend l’acquisition beaucoup plus rapide que les microscopes à balayage laser. Le déplacement de l’échantillon à travers la feuille lumineuse permet d’obtenir une tomographie complète de grands spécimens, jusqu’à des échantillons de la taille d’un centimètre. Cependant, en raison des propriétés intrinsèques du faisceau gaussien, il est possible d’obtenir une feuille de lumière très mince (de l’ordre de quelques microns) uniquement pour une extension spatiale limitée, limitant ainsi drastiquement le champ de vision (FoV). Récemment, un nouveau schéma d’excitation a été introduit pour surmonter cette limitation et appliqué à l’imagerie cérébrale, permettant des reconstructions 3D avec une résolution isotrope16.
Dans ce document, une approche de compensation passive est présentée, permettant une réduction significative du délai de compensation requis par le protocole Clarity. Le cadre méthodologique décrit ici permet de reconstruire un cœur entier de souris avec une résolution micrométrique en un seul balayage tomographique avec un temps d’acquisition de l’ordre de quelques minutes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-2&#8217; Thiodiethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>166782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>61-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AV-044 Initiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>AVP5874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca flash 4.0 v3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HC Image</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimating lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection arm</td>
			<td>Integrated optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>91863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extera&#236;nal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fold mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BBE1-E02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometric mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS211/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>4.6.1.19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser source</td>
			<td>Integrated Optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long-pass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KB25/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>CI-1316-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized traslator</td>
			<td>Physisk Instrument</td>
			<td>M-122.2DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TL2X-SAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycap AS</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>2606T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relay lens</td>
			<td>Qioptiq</td>
			<td>G063200000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACT508-200-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable lens</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>KNF Neuberger Inc</td>
			<td>N86KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WTB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesoscopic optical imaging of whole mouse heart

Les maladies cardiaques génétiques et non génétiques peuvent provoquer de graves processus de remodelage dans le cœur. Le remodelage structurel, tel que le dépôt de collagène (fibrose) et le désalignement cellulaire, peut affecter la conduction électrique, introduire des dysfonctionnements électromécaniques et, éventuellement, conduire à une arythmie. Les modèles prédictifs actuels de ces altérations fonctionnelles sont basés sur des informations structurelles non intégrées et à faible résolution. Il est difficile de placer ce cadre dans un ordre de grandeur différent en raison de l’inefficacité des méthodes d’imagerie standard pour effectuer une imagerie à haute résolution dans des tissus massifs. Dans ce travail, nous décrivons un cadre méthodologique qui permet l’imagerie de cœurs de souris entiers avec une résolution micrométrique. La réalisation de cet objectif a nécessité un effort technologique où les progrès de la transformation tissulaire et des méthodes d’imagerie ont été combinés. Tout d’abord, nous décrivons un protocole CLARITY optimisé capable de transformer un cœur intact en une forme nanoporeuse, hybride d’hydrogel, sans lipides qui permet une transparence élevée et une coloration profonde. Ensuite, un microscope à feuille de lumière à fluorescence capable d’acquérir rapidement des images d’un champ de vision mésoscopique (échelle mm) avec une résolution à l’échelle du micron est décrit. Suite au projet mesoSPIM, le microscope conçu permet la reconstruction de l’ensemble du cœur de souris avec une résolution micrométrique en un seul balayage tomographique. Nous pensons que ce cadre méthodologique permettra de clarifier l’implication du désarroi de la cytoarchitecture dans les dysfonctionnements électriques et d’ouvrir la voie à un modèle complet qui prend en compte à la fois les données fonctionnelles et structurelles, permettant ainsi une étude unifiée des causes structurelles qui conduisent à des altérations électriques et mécaniques après le remodelage tissulaire.

La configuration de nettoyage passif développée permet d’obtenir un cœur de souris adulte dégagé (avec une dimension de l’ordre de 10 mm x 6 mm x 6 mm) en environ 3 mois. Tous les composants de la configuration sont montés comme illustré à la Figure 1. Le gradient de température négligeable entre chaque chambre de dégagement (de l’ordre de 3°C) permet de maintenir la température dans une plage appropriée dans toutes les chambres.
<p class="jove_content" fo:keep-togeth...

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Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Nous rapportons une méthode de reconstruction mésoscopique de l’ensemble du cœur de souris en combinant de nouvelles avancées dans la transformation tissulaire et la coloration avec le développement d’un microscope à feuille de lumière à balayage axial.

Imagerie optique mésoscopique du cœur entier de souris

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Cette méthodologie combine l’amélioration du protocole de dégagement avec la capacité oculaire de sectionnement optique de la technologie Mesos PIM nous permettant d’effectuer des reconstructions mésoscopiques à résolution micrométrique. Il offre la possibilité d’imager des tissus cardiaques massifs ou des cœurs entiers de souris en une seule analyse sans perdre l’organisation tissulaire tridimensionnelle d’origine. Une fois que le cœur a été canulé par l’aorte proximale lavée dans une solution tyro et fixée dans de l’aldéhyde paraforme à 4% dans du PBS 0,01 molaire, il est prêt à commencer le protocole de nettoyage.Lavez le cœur trois fois dans 0,01 molaire PBS à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Après cette étape, le cœur peut être stocké dans du PBS et de l’azoture de sodium à 0,01% à quatre degrés Celsius pendant plusieurs mois. Incuber le cœur dans 20 millilitres de solution d’hydrogel en état d’agitation à 15 RPM pendant trois jours à quatre degrés Celsius.Dégazer l’échantillon à température ambiante à l’aide d’un sécheur, d’une pompe à vide et d’un système de tubes qui relie le sécheur à la bande de pompe et au pipeline d’azote. Placez l’échantillon dans le séchoir et ouvrez le flacon en gardant le capuchon dessus. Fermez le séchoir et retirez l’oxygène du tube en ouvrant la canalisation d’azote.Allumez la pompe à vide pour retirer l’oxygène de la sécheuse pendant 10 minutes. Éteignez la pompe et ouvrez le bouton de la sécheuse jusqu’à la canalisation d’azote. Ouvrez ensuite le robinet d’azote.Une fois que la pression est égale à la pression atmosphérique, ouvrez soigneusement le séchoir et fermez rapidement le flacon. Gardez le cœur dans la solution d’hydrogel dégazée à 37 degrés Celsius pendant environ trois heures au repos. Lorsque l’hydrogel est correctement polymérisé et semble entièrement gélatineux, retirez-en soigneusement le cœur et placez-le dans une solution de clairance dans le flacon avec solution de clairage.Changez la solution de nettoyage dans le flacon une fois tous les trois jours pour accélérer la procédure de clarification. Une fois que le cœur semble complètement clarifié, retirez-le du flacon et lavez-le dans 50 millilitres de PBS réchauffé pendant 24 heures en état de tremblement. Laver à nouveau dans 50 millilitres d’un X PBS T pendant 24 heures en état d’agitation.Incuber l’échantillon dans 0,01 milligrammes par millilitres de germe de blé aglutinine Alexa plancher 633 dans trois millilitres d’un X PBS T en état d’agitation à 50 RPM à température ambiante pendant sept jours. Après l’incubation de sept jours, laver l’échantillon dans 50 millilitres d’un X PBS T à température ambiante en agitant pendant 24 heures. Incuber l’échantillon dans 4% PFA pendant 15 minutes, puis le laver trois fois dans 0,01 molaire PBS pendant cinq minutes chacun.Incuber le cœur successivement dans 20 et 47% de TDE dans 0,01 molaire PBS pendant huit heures chacun. Et enfin à 68%TDE dans 0,01 molaire PBS pour fournir l’indice de réfraction requis de 1,46. Remplissez doucement environ 80% de la couvette de quartz externe avec le milieu d’indice de réfraction.Remplissez le quvet de quartz interne avec le même milieu d’indice de réfraction. Immergez l’échantillon dans le quvet interne. Déplacez doucement l’échantillon vers le bas de la pince à épiler à l’aide d’une fine pince à épiler et disposez le cœur avec son axe longitudinal parallèle à l’axe principal du quvet pour minimiser le trajet de la lumière d’excitation à travers le tissu pendant le balayage.Fixez soigneusement la fiche sur mesure au-dessus de la quvet interne avec deux vis. Montez l’échantillon sur l’étage du microscope à l’aide d’aimants. Traduisez manuellement l’étape d’échantillonnage verticale pour immerger le quet interne dans le quet externe.Allumez la source lumineuse d’excitation avec une longueur d’onde de 638 nanomètres et réglez-la à faible puissance de l’ordre de trois milliwatts. Déplacez l’échantillon à l’aide du traducteur motorisé pour éclairer une plaque interne du tissu. Allumez le logiciel de la caméra en direct de l’image HC et réglez le déclencheur de la caméra sur le mode feuille de lumière du déclencheur de bord externe pour piloter le déclencheur d’acquisition de la caméra par le logiciel personnalisé contrôlant l’ensemble de la configuration.Activez l’enregistrement automatique dans le logiciel de l’appareil photo et définissez le dossier de sortie dans lequel les images doivent être enregistrées. Ajustez manuellement la position de l’échantillon dans le plan X Y avec les traducteurs linéaires pour déplacer l’échantillon vers le centre du champ de vision du capteur de la caméra. Déplacez l’échantillon le long de l’axe Z à l’aide du traducteur motorisé linéaire pour identifier les bordures cardiaques pour la reconstruction tomographique.Augmentez la puissance laser à environ 20 milliwatts avant de commencer la séance d’imagerie. Démarrez l’acquisition tomographique en cliquant sur le bouton de démarrage dans le panneau de capture du logiciel d’imagerie, et en même temps commencez à déplacer l’échantillon le long de l’axe Z à la vitesse constante de six micromètres par seconde à l’aide du traducteur motorisé. La combinaison de la méthodologie de clarté avec le TDE comme milieu d’indice de réfraction ne modifie pas de manière significative le volume final de l’échantillon et n’entraîne pas de déformation isotrope de l’échantillon.L’optique d’excitation a produit une feuille de lumière avec un minimum de déchets d’environ six micromètres qui ont divergé jusqu’à 175 micromètres au bord du champ de vision. La synchronisation de l’obturateur roulant de la caméra avec le balayage axial des déchets de la feuille lumineuse a permis de collecter le signal d’émission uniquement dans la partie échantillon excitée par les déchets de la feuille lumineuse, ce qui a donné une moyenne de F W H M d’environ 6,7 micromètres sur tout le champ de vision. La fonction d’étalement du point Z du microscope a également été estimée par une reconstruction tomographique de la nanosphère fluorescente et un F W H M de 6,4 micromètres a été estimé par l’ajustement.La capacité du système à résoudre des membranes cellulaires uniques en trois dimensions avec un rapport signal sur bruit suffisant dans l’ensemble de l’organe a également été confirmée. La procédure de dégazage est l’étape la plus critique du protocole. Si elle n’est pas effectuée correctement, le tissu pourrait subir des dommages indiquant pendant l’incubation dans une solution de nettoyage.Le protocole présenté peut être combiné avec un protocole de coloration multiple pour réaliser une reconstruction d’organe entier intégrant différentes structures biologiques et peut être appliqué à l’étude de modèles pathologiques.

mesoscopic-optical-imaging-of-whole-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

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Entretien et nettoyage du microscope

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Recherche

Biologie

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

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Principales composantes d&#39;un microscope optique

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contraste de phase et les interférences de contraste différentiel (DIC) Microscopie

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

Normalisation Né pour tomographie par fluorescence de projection optique pour l&#39;imagerie cardiaque entier

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Analyse semi-automatisée Heartbeat optique de petits coeurs

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mésoscopique fluorescence tomographie pour In vivo L&#39;imagerie du développement Drosophile</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

L&#39;imagerie in vivo et des traitements thérapeutiques dans un modèle de souris orthotopique de cancer des ovaires

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Méthode de la culture pour le embryonnaire Souris Coeur

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Cartographie optique du commerce intra-réticulum sarcoplasmique Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Et potentiel transmembranaire dans le Lapin Coeur Langendorff perfusé

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Préparation et imagerie longitudinale de la fonction cardiaque in vivo en utilisant cohérence optique Microscopie (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...