Name: mesoscopic optical imaging of whole mouse heart
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00
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Dieses Projekt erhielt Mittel aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 952166 (REPAIR), MUR im Rahmen des FISR-Programms, Projekt FISR2019_00320 und Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-Projekt.

Alle Tierbehandlungen und -verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere durchgeführt und entsprachen den Grundsätzen und Vorschriften des italienischen Gesundheitsministeriums. Das Versuchsprotokoll wurde vom italienischen Gesundheitsministerium genehmigt (Protokollnummer 647/2015-PR). Alle Tiere wurden von ENVIGO, Italien, zur Verfügung gestellt. Für diese Experimente wurden 5 männliche ...

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	<li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li><li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy:+genetic+basis,+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death.">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li><li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function.">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li><li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation.">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+of+fixed+tissue:+a+review+from+a+microscopist's+perspective.">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers.">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart.">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).</li><li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls.">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li><li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery.">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li><li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles.">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li><li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue.">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808 (2015).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes.">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).</li><li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvessel+prediction+in+H&amp;E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks.">Microvessel prediction in H&amp;E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+whole-organ/body+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues.">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).</li></ol>

In dieser Arbeit wurde ein erfolgreicher Ansatz vorgestellt, um ein ganzes Mausherz in hoher Auflösung zu klären, zu färben und abzubilden. Zunächst wurde ein Gewebetransformationsprotokoll (CLARITY) optimiert und durchgeführt, leicht modifiziert für seine Anwendung auf das Herzgewebe. Um eine effiziente Rekonstruktion eines ganzen Herzens in 3D zu erhalten, ist es wichtig, das Phänomen der Lichtstreuung zu verhindern. Die CLARITY-Methodik ermöglicht es uns, ein hochtransparentes intaktes Herz zu erhalten, erford...

Strukturumbau im Zusammenhang mit Herzerkrankungen kann die elektrische Leitung beeinträchtigen und elektromechanische Funktionsstörungen des Organs 1,2 verursachen. Aktuelle Ansätze zur Vorhersage funktioneller Veränderungen verwenden häufig MRT und DT-MRT, um eine Gesamtrekonstruktion der Fibroseablagerung, des Gefäßbaums und der Faserverteilung des Herzens zu erhalten, und sie werden verwendet, um APP-Pfade (Preferential Action Potential Propagation) über das Organ 3,4 zu modellieren. Diese Strategien können einen schönen Überblick über die Herzorganisation geben. Ihre räumliche Auflösung reicht jedoch nicht aus, um die Auswirkungen des strukturellen Umbaus auf die Herzfunktion auf zellulärer Ebene zu untersuchen.
Es ist eine Herausforderung, dieses Framework in einer anderen Größenordnung zu platzieren, in der einzelne Zellen individuelle Rollen bei der Ausbreitung des Aktionspotentials spielen können. Die Haupteinschränkung ist die Ineffizienz von Standard-Bildgebungsmethoden zur Durchführung hochauflösender Bildgebung (mikrometrische Auflösung) in massiven (zentimetergroßen) Geweben. Tatsächlich ist die Abbildung biologischer Gewebe in 3D mit hoher Auflösung aufgrund der Undurchsichtigkeit des Gewebes sehr kompliziert. Der gebräuchlichste Ansatz zur Durchführung von 3D-Rekonstruktionen in ganzen Organen ist die Vorbereitung von Dünnschnitten. Präzises Schneiden, Zusammensetzen und Abbilden erfordern jedoch erheblichen Aufwand und Zeit. Ein alternativer Ansatz, bei dem die Probe nicht geschnitten werden muss, besteht darin, ein transparentes Gewebe zu erzeugen. In den letzten Jahren wurden mehrere Methoden zur Klärung von Geweben vorgeschlagen 5,6,7,8. Die Herausforderung, massive, transparente und fluoreszenzmarkierte Gewebe herzustellen, wurde kürzlich durch die Entwicklung echter Gewebetransformationsansätze (CLARITY9, SHIELD10) erreicht. Insbesondere basiert die CLARITY-Methode auf der Umwandlung eines intakten Gewebes in eine nanoporöse, hydrogel-hybridisierte, lipidfreie Form, die es ermöglicht, durch die selektive Entfernung von Membranlipiddoppelschichten eine hohe Transparenz zu verleihen. Bemerkenswerterweise hat sich diese Methode auch in der Herzvorbereitung als erfolgreich erwiesen 11,12,13,14. Da das Herz jedoch zu zerbrechlich ist, um für eine aktive Klärung geeignet zu sein, muss es mit dem passiven Ansatz gereinigt werden, der lange Zeit benötigt, um vollständige Transparenz zu verleihen.
In Kombination mit fortschrittlichen bildgebenden Verfahren wie der Lichtblattmikroskopie hat CLARITY das Potenzial, massives 3D-Herzgewebe mit mikrometrischer Auflösung abzubilden. In der Lichtblattmikroskopie wird die Beleuchtung der Probe mit einer dünnen Lichtschicht durchgeführt, die in der Brennebene des Detektionsobjektivs eingeschlossen ist. Die Fluoreszenzemission wird entlang einer Achse senkrecht zur Beleuchtungsebene15 gesammelt. Die Detektionsarchitektur ähnelt der Weitfeldmikroskopie, wodurch die Erfassung viel schneller ist als bei Laserscanning-Mikroskopen. Das Bewegen der Probe durch die Lichtschicht ermöglicht eine vollständige Tomographie von großen Proben, bis zu zentimetergroßen Proben. Aufgrund der intrinsischen Eigenschaften des Gaußstrahls ist es jedoch möglich, ein sehr dünnes (in der Größenordnung von wenigen Mikrometern) Lichtblatt nur für eine begrenzte räumliche Ausdehnung zu erhalten, wodurch das Sichtfeld (FoV) drastisch eingeschränkt wird. Vor kurzem wurde ein neuartiges Anregungsschema eingeführt, um diese Einschränkung zu überwinden, und für die Bildgebung des Gehirns angewendet, was 3D-Rekonstruktionen mit isotroper Auflösung ermöglicht16.
In diesem Beitrag wird ein passiver Clearingansatz vorgestellt, der eine signifikante Reduzierung des vom CLARITY-Protokoll benötigten Clearing-Timings ermöglicht. Der hier beschriebene methodische Rahmen erlaubt es, ein ganzes Mausherz mit mikrometrischer Auflösung in einem einzigen tomographischen Scan mit einer Erfassungszeit in der Größenordnung von Minuten zu rekonstruieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-2&#8217; Thiodiethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>166782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>61-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AV-044 Initiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>AVP5874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca flash 4.0 v3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HC Image</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimating lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection arm</td>
			<td>Integrated optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>91863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extera&#236;nal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fold mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BBE1-E02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometric mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS211/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>4.6.1.19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser source</td>
			<td>Integrated Optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long-pass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KB25/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>CI-1316-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized traslator</td>
			<td>Physisk Instrument</td>
			<td>M-122.2DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TL2X-SAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycap AS</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>2606T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relay lens</td>
			<td>Qioptiq</td>
			<td>G063200000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACT508-200-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable lens</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>KNF Neuberger Inc</td>
			<td>N86KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WTB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesoscopic optical imaging of whole mouse heart

Sowohl genetische als auch nicht-genetische Herzerkrankungen können schwere Umbauprozesse im Herzen verursachen. Strukturelle Umbauten, wie Kollagenablagerung (Fibrose) und zelluläre Fehlausrichtung, können die elektrische Leitung beeinträchtigen, elektromechanische Funktionsstörungen verursachen und schließlich zu Arrhythmien führen. Aktuelle Vorhersagemodelle dieser funktionellen Veränderungen basieren auf nicht integrierten und niedrig aufgelösten Strukturinformationen. Diesen Rahmen auf eine andere Größenordnung zu legen, ist aufgrund der Unwirksamkeit von Standard-Bildgebungsmethoden bei der Durchführung hochauflösender Bildgebung in massivem Gewebe eine Herausforderung. In dieser Arbeit beschreiben wir einen methodischen Rahmen, der die Abbildung ganzer Mausherzen mit mikrometrischer Auflösung ermöglicht. Die Erreichung dieses Ziels erforderte eine technologische Anstrengung, bei der Fortschritte bei der Gewebetransformation und bildgebenden Verfahren kombiniert wurden. Zunächst beschreiben wir ein optimiertes CLARITY-Protokoll, das in der Lage ist, ein intaktes Herz in eine nanoporöse, hydrogelhybridisierte, lipidfreie Form umzuwandeln, die eine hohe Transparenz und tiefe Färbung ermöglicht. Dann wird ein Fluoreszenz-Lichtblattmikroskop beschrieben, das in der Lage ist, schnell Bilder eines mesoskopischen Sichtfeldes (mm-Skala) mit der Auflösung im Mikrometerbereich aufzunehmen. Im Anschluss an das mesoSPIM-Projekt ermöglicht das konzipierte Mikroskop die Rekonstruktion des gesamten Mausherzens mit mikrometrischer Auflösung in einem einzigen tomographischen Scan. Wir glauben, dass dieser methodische Rahmen es ermöglichen wird, die Beteiligung der Zytoarchitektur an den elektrischen Dysfunktionen zu klären und den Weg für ein umfassendes Modell zu ebnen, das sowohl die funktionellen als auch die strukturellen Daten berücksichtigt und so eine einheitliche Untersuchung der strukturellen Ursachen ermöglicht, die zu elektrischen und mechanischen Veränderungen nach dem Gewebeumbau führen.

Das entwickelte passive Clearing-Setup ermöglicht es, in etwa 3 Monaten ein freies erwachsenes Mausherz (mit einer Dimension der Größenordnung von 10 mm x 6 mm x 6 mm) zu erhalten. Alle Komponenten des Setups sind wie in Abbildung 1 dargestellt montiert. Der vernachlässigbare Temperaturgradient zwischen den einzelnen Räumkammern (in der Größenordnung von 3 °C) ermöglicht es, die Temperatur in einem angemessenen Bereich über alle Kammern hinweg zu halten.
<p class="jove_content"...

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Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Wir berichten über eine Methode zur mesoskopischen Rekonstruktion des gesamten Mausherzens durch die Kombination neuer Fortschritte in der Gewebetransformation und Färbung mit der Entwicklung eines axial gescannten Lichtblattmikroskops.

Mesoskopische optische Bildgebung des ganzen Mausherzens

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Diese Methodik kombiniert die Verbesserung des Clearing-Protokolls mit der Augenfähigkeit des optischen Schnitts der Mesos PIM-Technologie, so dass wir mesoskopische Rekonstruktionen mit mikrometrischer Auflösung durchführen können. Es bietet die Möglichkeit, massives Herzgewebe oder ganze Mausherzen in einem einzigen Scan abzubilden, ohne die ursprüngliche dreidimensionale Gewebeorganisation zu verlieren. Nachdem das Herz durch proximale Aorta in Tyrolösung gewaschen und in 4% Paraformaldehyd in 0,01 molar PBS fixiert wurde, ist es bereit, das Clearing-Protokoll zu starten.Waschen Sie das Herz dreimal in 0,01 molaren PBS bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Nach diesem Schritt kann das Herz in PBS und 0,01% Natriumazid bei vier Grad Celsius für mehrere Monate gelagert werden. Inkubieren Sie das Herz in 20 Milliliter Hydrogellösung in Schüttelzustand bei 15 U/min für drei Tage bei vier Grad Celsius.Entgasen Sie die Probe bei Raumtemperatur mit einem Trockner, einer Vakuumpumpe und einem Schlauchsystem, das den Trockner sowohl mit dem Pumpband als auch mit der Stickstoffleitung verbindet. Legen Sie die Probe in den Trockner und öffnen Sie die Durchstechflasche, wobei Sie die Kappe darauf halten. Schließen Sie den Trockner und entfernen Sie den Sauerstoff aus dem Rohr, indem Sie die Stickstoffleitung öffnen.Schalten Sie die Vakuumpumpe ein, um den Sauerstoff für 10 Minuten aus dem Trockner zu entfernen. Schalten Sie die Pumpe aus und öffnen Sie den Knopf des Trockners zur Stickstoffleitung. Öffnen Sie dann den Stickstoffhahn.Sobald der Druck dem atmosphärischen Druck entspricht, öffnen Sie den Trockner vorsichtig und schließen Sie die Durchstechflasche schnell. Halten Sie das Herz in der entgasten Hydrogellösung bei 37 Grad Celsius für etwa drei Stunden in Ruhe. Wenn das Hydrogel richtig polymerisiert ist und vollständig gallertartig erscheint, entfernen Sie vorsichtig das Herz davon und legen Sie es in eine klärende Lösung in die Durchstechflasche mit Reinigungslösung.Wechseln Sie die Clearing-Lösung in der Durchstechflasche alle drei Tage, um den Klärungsprozess zu beschleunigen. Sobald das Herz vollständig geklärt erscheint, nehmen Sie es aus der Durchstechflasche und waschen Sie es in 50 Milliliter aufgewärmtem PBS für 24 Stunden im Schüttelzustand. Erneut in 50 Milliliter eines X PBS T für 24 Stunden im Schüttelzustand waschen.Inkubieren Sie die Probe in 0,01 Milligramm pro Milliliter Weizenkeim-Aglutinin Alexa Boden 633 in drei Milliliter eines X PBS T in schüttelndem Zustand bei 50 U/min bei Raumtemperatur für sieben Tage. Nach der siebentägigen Inkubation waschen Sie die Probe in 50 Milliliter eines X PBS T bei Raumtemperatur unter Schütteln für 24 Stunden. Inkubieren Sie die Probe in 4% PFA für 15 Minuten und waschen Sie sie dann dreimal in 0,01 molaren PBS für jeweils fünf Minuten.Inkubieren Sie das Herz nacheinander in 20 und 47% TDE in 0,01 molaren PBS für jeweils acht Stunden. Und schließlich bei 68% TDE in 0,01 molaren PBS, um den erforderlichen Brechungsindex von 1,46 zu liefern. Füllen Sie vorsichtig etwa 80% des äußeren Quarzquvets mit dem Brechungsindexmedium.Füllen Sie den inneren Quarzquavet mit dem gleichen Brechungsindexmedium. Tauchen Sie die Probe in den inneren Quvet. Bewegen Sie die Probe vorsichtig mit einer dünnen Pinzette auf den Boden des Quvets und ordnen Sie das Herz mit seiner Längsachse parallel zur Hauptachse des Quvets an, um den Anregungslichtweg über das Gewebe während des Scannens zu minimieren.Befestigen Sie den maßgeschneiderten Stecker vorsichtig mit zwei Schrauben über dem internen Quvet. Montieren Sie die Probe mit Magneten auf dem Mikroskoptisch. Übersetzen Sie den vertikalen Probentisch manuell, um den internen Quvet in den externen einzutauchen.Schalten Sie die Anregungslichtquelle mit einer Wellenlänge von 638 Nanometern ein und stellen Sie sie auf niedrige Leistung in der Größenordnung von drei Milliwatt ein. Bewegen Sie die Probe mit dem motorisierten Übersetzer, um eine innere Platte des Gewebes zu beleuchten. Schalten Sie die HC Image Live-Kamerasoftware ein und stellen Sie den Kameraauslöser auf den externen Randauslöser-Lichtblattmodus ein, um den Erfassungsauslöser der Kamera durch die benutzerdefinierte Software zu steuern, die das gesamte Setup steuert.Aktivieren Sie die automatische Speicherung in der Kamerasoftware und legen Sie den Ausgabeordner fest, in dem die Bilder gespeichert werden sollen. Passen Sie die Probenposition in der X-Y-Ebene manuell mit den linearen Übersetzern an, um die Probe in die Mitte des Sichtfelds des Kamerasensors zu bewegen. Bewegen Sie die Probe mit dem linearen motorisierten Übersetzer entlang der Z-Achse, um Herzgrenzen für die tomographische Rekonstruktion zu identifizieren.Erhöhen Sie die Laserleistung auf ca. 20 Milliwatt, bevor Sie mit der Bildgebungssitzung beginnen. Starten Sie die tomographische Erfassung, indem Sie auf die Schaltfläche Start im Erfassungsbereich der Bildgebungssoftware klicken, und beginnen Sie gleichzeitig, die Probe mit der konstanten Geschwindigkeit von sechs Mikrometern pro Sekunde mit dem motorisierten Übersetzer entlang der Z-Achse zu bewegen. Die Kombination der Klarheitsmethodik mit TDE als Brechungsindexmedium verändert weder signifikant das Endvolumen der Probe noch führt sie zu einer isotropen Verformung der Probe.Die Anregungsoptik erzeugte eine Lichtschicht mit einem minimalen Abfall von etwa sechs Mikrometern, die am Rand des Sichtfeldes bis zu 175 Mikrometer divergierte. Die Synchronisation des Kamera-Rolling-Shutters mit dem axialen Scan des Lichtblattabfalls stellte sicher, dass das Emissionssignal nur in dem Probenteil erfasst wurde, der mit dem Abfall des Lichtblattes angeregt wurde, was zu einem durchschnittlichen F W H M von etwa 6,7 Mikrometern über das gesamte Sichtfeld führte. Die Z-Punkt-Spreizungsfunktion des Mikroskops wurde ebenfalls durch eine tomographische Rekonstruktion der fluoreszierenden Nanokugel geschätzt und ein F W H M von 6,4 Mikrometern durch die Anpassung geschätzt.Die Möglichkeit des Systems, einzellige Membranen dreidimensional mit einem ausreichenden Signal-Rausch-Verhältnis im gesamten Organ aufzulösen, wurde ebenfalls bestätigt. Das Entgasungsverfahren ist der kritischste Schritt des Protokolls. Wenn es nicht richtig durchgeführt wird, kann das Gewebe während der Inkubation in einer Reinigungslösung auf Schäden hinweisen.Das vorgestellte Protokoll kann mit einem Multi-Färbeprotokoll kombiniert werden, um eine vollständige Organrekonstruktion zu erreichen, die verschiedene biologische Strukturen integriert, und kann zur Untersuchung pathologischer Modelle angewendet werden.

mesoscopic-optical-imaging-of-whole-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

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Richtige Pflege und Reinigung des Mikroskops

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Forschung

Biologie

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

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Wesentliche Komponenten des Lichtmikroskops

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Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phasenkontrast und Differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

Geboren Normalisierung für Fluoreszenz-Optical Projection Tomographie für ganzem Herzen Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Semi-automatische optische Heartbeat-Analyse von kleinen Herzen

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Verfahren zur embryonalen Maus Herz

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Und Transmembranpotential in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Vorbereitung und Longitudinal Imaging der Herzfunktion in vivo unter Verwendung optischer Kohärenzmikroskopie (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...