Name: mesoscopic optical imaging of whole mouse heart
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00
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Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito della convenzione di sovvenzione n. 952166 (REPAIR), MUR nell'ambito del programma FISR, progetto FISR2019_00320 e Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, progetto PERCARE.

Tutte le manipolazioni e le procedure degli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida della Direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e conformi ai principi e ai regolamenti del Ministero della Salute italiano. Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Ministero della Salute italiano (numero di protocollo 647/2015-PR). Tutti gli animali sono stati forniti da ENVIGO, Italia. Per questi esperimenti, sono stati utilizzati 5 topi mas...

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	<li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li><li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy:+genetic+basis,+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death.">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li><li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function.">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li><li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation.">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+of+fixed+tissue:+a+review+from+a+microscopist's+perspective.">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers.">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart.">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).</li><li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls.">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li><li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery.">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li><li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles.">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li><li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue.">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808 (2015).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes.">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).</li><li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvessel+prediction+in+H&amp;E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks.">Microvessel prediction in H&amp;E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+whole-organ/body+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues.">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).</li></ol>

In questo lavoro, è stato introdotto un approccio di successo per chiarire, colorare e visualizzare un intero cuore di topo ad alta risoluzione. In primo luogo, è stato ottimizzato ed eseguito un protocollo di trasformazione tissutale (CLARITY), leggermente modificato per la sua applicazione sul tessuto cardiaco. Infatti, per ottenere un'efficace ricostruzione in 3D di un cuore intero, è fondamentale prevenire il fenomeno della diffusione della luce. La metodologia CLARITY ci permette di ottenere un cuore intatto alta...

Il rimodellamento strutturale associato a malattie cardiache può influenzare la conduzione elettrica e introdurre disfunzioni elettromeccaniche dell'organo 1,2. Gli attuali approcci utilizzati per prevedere le alterazioni funzionali impiegano comunemente MRI e DT-MRI per ottenere una ricostruzione complessiva della deposizione di fibrosi, dell'albero vascolare e della distribuzione delle fibre del cuore e sono utilizzati per modellare percorsi di propagazione del potenziale di azione preferenziale (APP) attraverso l'organo 3,4. Queste strategie possono fornire una bella panoramica dell'organizzazione del cuore. Tuttavia, la loro risoluzione spaziale è insufficiente per studiare l'impatto del rimodellamento strutturale sulla funzione cardiaca a livello cellulare.
Collocare questo quadro a un diverso ordine di grandezza, in cui le singole cellule possono svolgere ruoli individuali sulla propagazione del potenziale d'azione, è impegnativo. La limitazione principale è l'inefficienza dei metodi di imaging standard per eseguire immagini ad alta risoluzione (risoluzione micrometrica) in tessuti massicci (centimetrici). In effetti, l'imaging dei tessuti biologici in 3D ad alta risoluzione è molto complicato a causa dell'opacità dei tessuti. L'approccio più comune per eseguire ricostruzioni 3D in interi organi è quello di preparare sezioni sottili. Tuttavia, il sezionamento, l'assemblaggio e l'imaging precisi richiedono uno sforzo e un tempo significativi. Un approccio alternativo che non richiede il taglio del campione è quello di generare un tessuto trasparente. Negli ultimi anni sono state proposte diverse metodologie per la chiarificazione dei tessuti 5,6,7,8. La sfida di produrre tessuti massicci, trasparenti e marcati con fluorescenza è stata recentemente raggiunta sviluppando veri approcci di trasformazione tissutale (CLARITY9, SHIELD10). In particolare, il metodo CLARITY si basa sulla trasformazione di un tessuto intatto in una forma nanoporosa, ibridata con idrogel, priva di lipidi che consente di conferire un'elevata trasparenza mediante la rimozione selettiva dei doppi strati lipidici di membrana. In particolare, questo metodo è stato trovato efficace anche nella preparazione cardiaca11,12,13,14. Tuttavia, poiché il cuore è troppo fragile per essere adatto a una compensazione attiva, deve essere eliminato utilizzando l'approccio passivo, che richiede molto tempo per conferire completa trasparenza.
In combinazione con tecniche di imaging avanzate come la microscopia a foglio di luce, CLARITY ha il potenziale per visualizzare tessuti cardiaci massicci 3D a risoluzione micrometrica. Nella microscopia a foglio di luce, l'illuminazione del campione viene eseguita con un sottile foglio di luce confinato nel piano focale dell'obiettivo di rilevamento. L'emissione di fluorescenza viene raccolta lungo un asse perpendicolare al piano di illuminazione15. L'architettura di rilevamento è simile alla microscopia a campo largo, rendendo l'acquisizione molto più veloce rispetto ai microscopi a scansione laser. Lo spostamento del campione attraverso il foglio luminoso consente di ottenere una tomografia completa di campioni di grandi dimensioni, fino a campioni di dimensioni centimetriche. Tuttavia, a causa delle proprietà intrinseche del fascio gaussiano è possibile ottenere un foglio di luce molto sottile (dell'ordine di pochi micron) solo per una limitata estensione spaziale, limitando così drasticamente il campo visivo (FoV). Recentemente, è stato introdotto un nuovo schema di eccitazione per superare questa limitazione e applicato per l'imaging cerebrale, consentendo ricostruzioni 3d con risoluzione isotropa16.
In questo documento, viene presentato un approccio di compensazione passiva, che consente una significativa riduzione dei tempi di compensazione necessari per il protocollo CLARITY. Il quadro metodologico qui descritto permette di ricostruire un cuore intero di topo con risoluzione micrometrica in un'unica scansione tomografica con un tempo di acquisizione nell'ordine dei minuti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-2&#8217; Thiodiethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>166782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>61-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AV-044 Initiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>AVP5874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca flash 4.0 v3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HC Image</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimating lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection arm</td>
			<td>Integrated optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>91863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extera&#236;nal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fold mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BBE1-E02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometric mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS211/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>4.6.1.19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser source</td>
			<td>Integrated Optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long-pass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KB25/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>CI-1316-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized traslator</td>
			<td>Physisk Instrument</td>
			<td>M-122.2DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TL2X-SAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycap AS</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>2606T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relay lens</td>
			<td>Qioptiq</td>
			<td>G063200000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACT508-200-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable lens</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>KNF Neuberger Inc</td>
			<td>N86KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WTB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesoscopic optical imaging of whole mouse heart

Sia le malattie cardiache genetiche che quelle non genetiche possono causare gravi processi di rimodellamento nel cuore. Il rimodellamento strutturale, come la deposizione di collagene (fibrosi) e il disallineamento cellulare, può influenzare la conduzione elettrica, introdurre disfunzioni elettromeccaniche e, infine, portare ad aritmia. Gli attuali modelli predittivi di queste alterazioni funzionali si basano su informazioni strutturali non integrate e a bassa risoluzione. Collocare questo quadro su un diverso ordine di grandezza è difficile a causa dell'inefficacia dei metodi di imaging standard nell'esecuzione di immagini ad alta risoluzione in tessuti massicci. In questo lavoro, descriviamo un quadro metodologico che consente l'imaging di interi cuori di topo con risoluzione micrometrica. Il raggiungimento di questo obiettivo ha richiesto uno sforzo tecnologico in cui sono stati combinati i progressi nella trasformazione dei tessuti e nei metodi di imaging. In primo luogo, descriviamo un protocollo CLARITY ottimizzato in grado di trasformare un cuore intatto in una forma nanoporosa, ibridata con idrogel e priva di lipidi che consente un'elevata trasparenza e una colorazione profonda. Quindi, viene descritto un microscopio a foglio di luce a fluorescenza in grado di acquisire rapidamente immagini di un campo visivo mesoscopico (scala mm) con la risoluzione su scala micron. A seguito del progetto mesoSPIM, il microscopio concepito permette la ricostruzione dell'intero cuore del topo con risoluzione micrometrica in un'unica scansione tomografica. Riteniamo che questo quadro metodologico consentirà di chiarire il coinvolgimento del disordine citoarchitettonico nelle disfunzioni elettriche e aprirà la strada a un modello completo che consideri sia i dati funzionali che strutturali, consentendo così un'indagine unificata delle cause strutturali che portano ad alterazioni elettriche e meccaniche dopo il rimodellamento tissutale.

La configurazione di compensazione passiva sviluppata consente di ottenere un cuore di topo adulto cancellato (con una dimensione dell'ordine 10 mm x 6 mm x 6 mm) in circa 3 mesi. Tutti i componenti della configurazione sono montati come illustrato nella Figura 1. Il gradiente di temperatura trascurabile tra ciascuna camera di compensazione (dell'ordine di 3 °C) consente di mantenere la temperatura in un intervallo adeguato in tutte le camere.
<p class="jove_content" fo:keep-together.wi...

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Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Riportiamo un metodo per la ricostruzione mesoscopica dell'intero cuore del topo combinando nuovi progressi nella trasformazione e colorazione dei tessuti con lo sviluppo di un microscopio a foglio di luce a scansione assiale.

Imaging ottico mesoscopico dell'intero cuore del topo

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Questa metodologia combina il miglioramento del protocollo di clearing con la capacità oculare di sezionamento ottico della tecnologia PIM Mesos permettendoci di eseguire ricostruzioni meso scopiche a risoluzione micrometrica. Offre la possibilità di visualizzare tessuti cardiaci massicci o interi cuori di topo intera soluzione in un'unica scansione senza perdere l'organizzazione tridimensionale originale del tessuto. Dopo che il cuore è stato incannulato mediante aorta prossimale lavata in soluzione di tiro e fissata in aldeide paraforme al 4% in PBS molare 0,01 è pronto per iniziare il protocollo di pulizia.Lavare il cuore tre volte in 0,01 molare PBS a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Dopo questo passaggio, il cuore può essere conservato in PBS e 0,01% azide di sodio a quattro gradi Celsius per diversi mesi. Incubare il cuore in 20 millilitri di soluzione di idrogel in condizioni di agitazione a 15 RPM per tre giorni a quattro gradi Celsius.Degassare il campione a temperatura ambiente utilizzando un essiccatore, una pompa per vuoto e un sistema di tubi che collega l'essiccatore sia alla banda della pompa che alla tubazione dell'azoto. Introdurre il campione nell'essiccatore e aprire il flaconcino mantenendo il tappo su di esso. Chiudere l'essiccatore e rimuovere l'ossigeno dal tubo aprendo la tubazione dell'azoto.Accendere la pompa per vuoto per rimuovere l'ossigeno dall'essiccatore per 10 minuti. Spegnere la pompa e aprire la manopola dell'essiccatore alla tubazione dell'azoto. Quindi aprire il rubinetto dell'azoto.Una volta che la pressione è uguale alla pressione atmosferica, aprire con attenzione l'essiccatore e chiudere rapidamente il flaconcino. Mantenere il cuore nella soluzione di idrogel degasato a 37 gradi Celsius per circa tre ore a riposo. Quando l'idrogel è correttamente polimerizzato e appare interamente gelatinoso, rimuovere con cura il cuore da esso e metterlo in una soluzione di compensazione nella fiala con soluzione di pulizia.Cambiare la soluzione di pulizia nel flaconcino una volta ogni tre giorni per accelerare la procedura di chiarificazione. Una volta che il cuore appare completamente chiarito, rimuoverlo dalla fiala e lavarlo in 50 millilitri di PBS riscaldato per 24 ore in condizioni di agitazione. Lavare nuovamente in 50 millilitri di un X PBS T per 24 ore in condizioni di agitazione.Incubare il campione in 0,01 milligrammi per millilitri di germe di grano aglutinina Alexa piano 633 in tre millilitri di un X PBS T in condizioni di agitazione a 50 RPM a temperatura ambiente per sette giorni. Dopo l'incubazione di sette giorni, lavare il campione in 50 millilitri di un X PBS T a temperatura ambiente agitando per 24 ore. Incubare il campione in 4% PFA per 15 minuti e poi lavarlo tre volte in 0,01 molare PBS per cinque minuti ciascuno.Incubare il cuore successivamente in 20 e 47% TDE in 0,01 molare PBS per otto ore ciascuno. E infine al 68% TDE in 0,01 molari PBS per fornire l'indice di rifrazione richiesto di 1,46. Riempire delicatamente circa l'80% del quvet di quarzo esterno con il mezzo dell'indice di rifrazione.Riempire il quvet di quarzo interno con lo stesso mezzo di indice di rifrazione. Immergere il campione all'interno del quvet interno. Spostare delicatamente il campione sul fondo del quvet usando una pinzetta sottile e disporre il cuore con il suo asse longitudinale parallelo all'asse principale del quvet per ridurre al minimo il percorso della luce di eccitazione attraverso il tessuto durante la scansione.Fissare con cura il tappo su misura sopra il quvet interno con due viti. Montare il campione sullo stadio del microscopio usando i magneti. Traslare manualmente lo stadio di campionamento verticale per immergere il quvet interno in quello esterno.Accendere la sorgente luminosa di eccitazione con una lunghezza d'onda di 638 nanometri e impostarla a bassa potenza nell'ordine di tre milliwatt. Spostare il campione utilizzando il traduttore motorizzato per illuminare una piastra interna del tessuto. Accendere il software della telecamera live dell'immagine HC e impostare il trigger della telecamera sulla modalità foglio luminoso del trigger del bordo esterno per pilotare il trigger di acquisizione della telecamera tramite il software personalizzato che controlla l'intera configurazione.Abilitare il salvataggio automatico nel software della fotocamera e impostare la cartella di output in cui è necessario salvare le immagini. Regolare manualmente la posizione del campione nel piano X Y con i traslatori lineari per spostare il campione al centro del campo visivo del sensore della fotocamera. Spostare il campione lungo l'asse Z utilizzando il traduttore motorizzato lineare per identificare i bordi del cuore per la ricostruzione tomografica.Aumentare la potenza del laser a circa 20 milliwatt prima di iniziare la sessione di imaging. Avviare l'acquisizione tomografica facendo clic sul pulsante Start nel pannello di acquisizione del software di imaging e allo stesso tempo iniziare a spostare il campione lungo l'asse Z alla velocità costante di sei micrometri al secondo utilizzando il traduttore motorizzato. La combinazione della metodologia di chiarezza con TDE come mezzo di indice di rifrazione non modifica significativamente il volume finale del campione né porta a una deformazione isotropa del campione.L'ottica di eccitazione ha prodotto un foglio luminoso con uno spreco minimo di circa sei micrometri che divergeva fino a 175 micrometri ai margini del campo visivo. La sincronizzazione della telecamera rolling shutter con la scansione assiale degli scarti del foglio luminoso ha permesso di raccogliere il segnale di emissione solo nella porzione di campione eccitata con lo scarto del foglio luminoso risultando in una media F W H M di circa 6,7 micrometri lungo tutto il campo visivo. La funzione di diffusione del punto Z del microscopio è stata stimata anche da una ricostruzione tomografica della nanosfera fluorescente e un F W H M di 6,4 micrometri è stato stimato dal fit.È stata inoltre confermata la potenzialità del sistema di risolvere singole membrane cellulari in tre dimensioni con un sufficiente rapporto segnale/rumore nell'intero organo. La procedura di degassamento è la fase più critica del protocollo. Se non viene eseguito correttamente, il tessuto potrebbe subire danni durante l'incubazione in una soluzione detergente.Il protocollo presentato può essere combinato con un protocollo multi colorazione per ottenere una ricostruzione dell'intero organo integrando diverse strutture biologiche e può essere applicato allo studio di modelli patologici.

mesoscopic-optical-imaging-of-whole-mouse-heart

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The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contrasto di fase e interferenza differenziale contrasto (DIC) Microscopia

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

La normalizzazione nata per fluorescenza Tomografia Ottica proiezione per l&#39;imaging tutto il cuore

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Semiautomatici Analisi Heartbeat ottica di piccoli cuori

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

Imaging in vivo e trattamenti terapeutici in un modello di mouse ortotopico di cancro ovarico

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metodo di Cultura per il mouse embrionale del cuore

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Mappatura ottica di Intra-reticolo sarcoplasmatico Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E transmembrana potenziale nel Rabbit Heart Langendorff-perfuso

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila preparazione e imaging longitudinale della funzione cardiaca in vivo utilizzando Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...