Name: mesoscopic optical imaging of whole mouse heart
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00
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이 프로젝트는 보조금 계약 No 952166 (REPAIR), FISR 프로그램에 따른 MUR, 프로젝트 FISR2019_00320 및 Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE 프로젝트에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 지원 받았습니다.

모든 동물 취급 및 절차는 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 유럽 의회의 지침 2010/63/EU의 지침에 따라 수행되었으며 이탈리아 보건부의 원칙 및 규정을 준수했습니다. 실험 프로토콜은 이탈리아 보건부 (프로토콜 번호 647/2015-PR)의 승인을 받았습니다. 모든 동물은 이탈리아 ENVIGO에서 제공하였다. 이들 실험을 위해, 생후 6개월의 수컷 C57BL/6J 마우스 5마리를 사용하였다.
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<ol>
	<li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li><li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy:+genetic+basis,+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death.">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li><li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function.">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li><li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation.">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+of+fixed+tissue:+a+review+from+a+microscopist's+perspective.">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers.">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart.">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).</li><li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls.">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li><li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery.">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li><li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles.">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li><li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue.">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808 (2015).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes.">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).</li><li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvessel+prediction+in+H&amp;E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks.">Microvessel prediction in H&amp;E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+whole-organ/body+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues.">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).</li></ol>

이 작업에서는 고해상도로 전체 마우스 심장을 지우고, 염색하고, 이미지화하는 성공적인 접근 방식이 도입되었습니다. 먼저, 조직 변형 프로토콜 (CLARITY)을 최적화하고 수행했으며, 심장 조직에 적용하기 위해 약간 수정했습니다. 실제로, 전체 심장의 3D로 효율적인 재구성을 얻으려면 광산란 현상을 방지하는 것이 필수적입니다. CLARITY 방법론을 사용하면 매우 투명한 온전한 심장을 얻을 수 있지...

심장 질환과 관련된 구조적 리모델링은 전기 전도에 영향을 미치고 장기 1,2의 전기 기계적 기능 장애를 유발할 수 있습니다. 기능적 변화를 예측하는 데 사용되는 현재의 접근법은 일반적으로 MRI 및 DT-MRI를 사용하여 섬유증 침착, 혈관 트리 및 심장의 섬유 분포의 전반적인 재구성을 얻으며 장기 3,4를 가로 지르는 우선 활동 전위 전파 (APP) 경로를 모델링하는 데 사용됩니다. 이러한 전략은 심장 조직에 대한 아름다운 개요를 제공 할 수 있습니다. 그러나 공간 해상도는 세포 수준에서 심장 기능에 대한 구조적 리모델링의 영향을 조사하기에 충분하지 않습니다.
이 프레임워크를 단일 세포가 활동 전위 전파에서 개별 역할을 할 수 있는 다른 크기의 순서로 배치하는 것은 어려운 일입니다. 주요 한계는 거대한(센티미터 크기) 조직에서 고해상도 이미징(마이크로메트릭 해상도)을 수행하는 표준 이미징 방법의 비효율성입니다. 사실, 고해상도로 3D로 생물학적 조직을 이미징하는 것은 조직 불투명으로 인해 매우 복잡합니다. 전체 장기에서 3D 재구성을 수행하는 가장 일반적인 방법은 얇은 섹션을 준비하는 것입니다. 그러나 정밀한 절편, 조립 및 이미징에는 상당한 노력과 시간이 필요합니다. 샘플 절단을 요구하지 않는 대안적인 접근법은 투명한 조직을 생성하는 것입니다. 지난 몇 년 동안 조직을 명확히하기위한 몇 가지 방법론이 제안되었습니다 5,6,7,8. 거대하고 투명하며 형광 표지된 조직을 생산하는 과제는 최근 진정한 조직 변형 접근법(CLARITY9, SHIELD10)을 개발함으로써 달성되었습니다. 특히, CLARITY 방법은 손상되지 않은 조직을 막 지질 이중층의 선택적 제거에 의해 높은 투명성을 부여 할 수있는 나노 다공성, 하이드로 겔 혼성화, 지질이없는 형태로 변형시키는 것을 기반으로합니다. 특히,이 방법은 심장 준비11,12,13,14에서도 성공적으로 발견되었습니다. 그러나 심장은 너무 약해서 능동적 인 청소에 적합하지 않기 때문에 완전한 투명성을 부여하는 데 오랜 시간이 필요한 수동적 접근 방식을 사용하여 제거해야합니다.
라이트 시트 현미경과 같은 고급 이미징 기술과 결합된 CLARITY는 3D의 거대한 심장 조직을 마이크로메트릭 해상도로 이미징할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 라이트 시트 현미경에서 샘플의 조명은 검출 대물렌즈의 초점면에 제한된 얇은 라이트 시트로 수행됩니다. 형광 방출은 조명면(15)에 수직인 축을 따라 수집된다. 검출 아키텍처는 광시야 현미경과 유사하여 레이저 스캐닝 현미경보다 훨씬 빠르게 획득할 수 있습니다. 라이트 시트를 통해 샘플을 이동하면 최대 센티미터 크기의 샘플에 대한 큰 표본의 완전한 단층 촬영을 얻을 수 있습니다. 그러나 가우스 빔의 고유 특성으로 인해 제한된 공간 확장에 대해서만 매우 얇은 (수 미크론 정도의) 라이트 시트를 얻을 수 있으므로 시야 (FoV)가 크게 제한됩니다. 최근에는 이러한 한계를 극복하기 위해 새로운 여기 방식이 도입되어 뇌 영상에 적용되어 등방성 분해능16으로 3D 재구성이 가능합니다.
이 백서에서는 CLARITY 프로토콜에 필요한 청산 시기를 크게 줄일 수 있는 수동 청산 접근 방식을 제시합니다. 여기에 설명된 방법론적 프레임워크를 사용하면 단일 단층 촬영 스캔에서 마이크로메트릭 해상도로 전체 마우스 심장을 재구성할 수 있으며 획득 시간은 몇 분 정도입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-2&#8217; Thiodiethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>166782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>61-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AV-044 Initiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>AVP5874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca flash 4.0 v3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HC Image</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimating lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection arm</td>
			<td>Integrated optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>91863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extera&#236;nal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fold mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BBE1-E02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometric mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS211/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>4.6.1.19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser source</td>
			<td>Integrated Optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long-pass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KB25/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>CI-1316-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized traslator</td>
			<td>Physisk Instrument</td>
			<td>M-122.2DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TL2X-SAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycap AS</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>2606T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relay lens</td>
			<td>Qioptiq</td>
			<td>G063200000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACT508-200-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable lens</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>KNF Neuberger Inc</td>
			<td>N86KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WTB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesoscopic optical imaging of whole mouse heart

유전 적 및 비 유전 적 심장 질환 모두 심장에 심각한 리모델링 과정을 일으킬 수 있습니다. 콜라겐 침착 (섬유증) 및 세포 정렬 불량과 같은 구조적 리모델링은 전기 전도에 영향을 미치고 전기 기계적 기능 장애를 유발하며 결국 부정맥을 유발할 수 있습니다. 이러한 기능 변경에 대한 현재 예측 모델은 통합되지 않은 저해상도 구조 정보를 기반으로 합니다. 이 프레임워크를 다른 규모의 배열에 배치하는 것은 대규모 조직에서 고해상도 이미징을 수행하는 데 있어 표준 이미징 방법의 비효율성으로 인해 어렵습니다. 이 작업에서는 마이크로 메트릭 해상도로 전체 마우스 심장을 이미징 할 수있는 방법 론적 프레임 워크를 설명합니다. 이 목표를 달성하려면 조직 변형과 이미징 방법의 발전이 결합 된 기술적 노력이 필요했습니다. 먼저, 온전한 심장을 높은 투명성과 깊은 염색을 허용하는 나노다공성, 하이드로겔 하이브리드화, 지질이 없는 형태로 변환할 수 있는 최적화된 CLARITY 프로토콜을 설명합니다. 이어서, 미크론 스케일 해상도로 메조스코픽 시야(mm-scale)의 이미지를 신속하게 획득할 수 있는 형광 광시트 현미경이 설명된다. mesoSPIM 프로젝트에 따라 고안된 현미경을 사용하면 단일 단층 촬영 스캔에서 마이크로 메트릭 해상도로 전체 마우스 심장을 재구성 할 수 있습니다. 우리는이 방법 론적 프레임 워크가 전기 기능 장애에서 세포 구조 혼란의 개입을 명확히하고 기능적 및 구조적 데이터를 모두 고려한 포괄적 인 모델을위한 길을 열어 조직 리모델링 후 전기적 및 기계적 변화로 이어지는 구조적 원인에 대한 통합 조사를 가능하게한다고 믿습니다.

개발 된 패시브 클리어링 설정을 통해 약 3 개월 만에 제거 된 성인 마우스 심장 (10mm x 6mm x 6mm x 6mm 정도의 치수)을 얻을 수 있습니다. 설정의 모든 구성 요소는 그림 1과 같이 장착됩니다. 각 클리어링 챔버 사이의 무시할 수 있는 온도 구배(약 3°C)를 통해 모든 챔버에서 온도를 적절한 범위로 유지할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" cl...

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Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

우리는 조직 변형 및 염색의 새로운 발전과 축 방향 스캔 라이트 시트 현미경의 개발을 결합하여 전체 마우스 심장의 메조스코픽 재구성 방법을 보고합니다.

전체 마우스 심장의 메조스코픽 광학 이미징

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

이 방법론은 클리어링 프로토콜의 개선과 Mesos PIM 기술의 광학 절편의 눈 기능을 결합하여 마이크로미터 해상도에서 메조 스코픽 재구성을 수행할 수 있습니다. 원래의 3차원 조직 조직을 잃지 않고 한 번의 스캔으로 대규모 심장 조직 또는 전체 마우스 심장 전체 용액을 이미지화할 수 있는 가능성을 제공합니다. 심장이 근위 대동맥에 의해 캐뉼레이션되어 티로 용액으로 세척되고 0.01 몰 PBS의 4 % 파라 폼 알데히드로 고정 된 후 클리어링 프로토콜을 시작할 준비가되었습니다.섭씨 4도에서 0.01 몰 PBS로 15 분 동안 심장을 3 번 씻으십시오. 이 단계 후에 심장은 PBS와 0.01 % 나트륨 아 지드화물에 섭씨 4도에서 몇 달 동안 저장할 수 있습니다. 섭씨 4도에서 3 일 동안 15RPM의 흔들림 상태에서 20ml의 하이드로 겔 용액에서 심장을 배양하십시오.건조기를 사용하여 실온에서 샘플을 탈가스화하고, 진공 펌프, 및 건조기를 펌프 밴드 및 질소 파이프라인 모두에 연결하는 튜브 시스템을 포함한다. 샘플을 건조기에 넣고 캡을 유지하면서 바이알을 엽니 다. 건조기를 닫고 질소 파이프 라인을 열어 튜브에서 산소를 제거하십시오.진공 펌프를 켜서 건조기에서 산소를 10분 동안 제거합니다. 펌프를 끄고 건조기의 손잡이를 질소 파이프 라인으로여십시오. 그런 다음 질소 탭을여십시오.압력이 대기압과 같으면 건조기를 조심스럽게 열고 바이알을 빠르게 닫으십시오. 탈기 된 하이드로 겔 용액에 심장을 섭씨 37도에서 약 3 시간 동안 그대로 두십시오. 하이드로 겔이 적절하게 중합되어 완전히 젤라틴처럼 보이면 조심스럽게 심장을 제거하고 투명 용액이있는 바이알의 클리어링 용액에 넣으십시오.정화 절차를 가속화하기 위해 3 일에 한 번 바이알의 투명액을 교체하십시오. 심장이 완전히 정화 된 것처럼 보이면 바이알에서 꺼내어 흔들리는 상태에서 24 시간 동안 예열 된 PBS 50ml로 씻으십시오. 진탕 상태에서 24 시간 동안 하나의 X PBS T 50 밀리리터로 다시 세척하십시오.샘플을 7일 동안 실온에서 50 RPM에서 진탕 조건에서 1 X PBS T의 3 밀리리터 중 밀 배아 아글루티닌 알렉사 플로어 633 밀리리터당 0.01 밀리그램으로 인큐베이션한다. 7일간의 인큐베이션 후, 샘플을 실온에서 50 밀리리터의 X PBS T로 24시간 동안 진탕하면서 세척하였다. 샘플을 4% PFA에서 15분 동안 배양한 다음 0.01몰 PBS에서 각각 5분 동안 3회 세척합니다.심장을 각각 8시간 동안 0.01몰 PBS에서 20 및 47% TDE에서 연속적으로 배양합니다. 그런 다음 마지막으로 0.01몰 PBS에서 68%TDE에서 1.46의 필요한 굴절률을 제공합니다. 외부 석영 큐벳의 약 80%를 굴절률 매체로 부드럽게 채웁니다.내부 석영 큐벳을 동일한 굴절률 매체로 채웁니다. 샘플을 내부 큐벳 안에 담그십시오. 얇은 핀셋을 사용하여 샘플을 큐벳의 바닥으로 부드럽게 이동하고 세로 축이 큐벳의 주축과 평행하도록 심장을 배열하여 스캔하는 동안 조직을 가로지르는 여기광 경로를 최소화합니다.두 개의 나사로 내부 큐벳 위의 맞춤형 플러그를 조심스럽게 고정합니다. 자석을 사용하여 샘플을 현미경 스테이지에 장착합니다. 수직 샘플 스테이지를 수동으로 변환하여 내부 큐벳을 외부 큐벳에 담그십시오.파장이 638 나노 미터 인 여기 광원을 켜고 3 밀리 와트 정도의 저전력으로 설정하십시오. 전동 번역기를 사용하여 샘플을 이동하여 조직의 내부 플레이트를 비춥니다. HC 이미지 라이브 카메라 소프트웨어를 켜고 외부 에지 트리거 라이트 시트 모드에서 카메라 트리거를 설정하여 전체 설정을 제어하는 맞춤형 소프트웨어로 카메라의 획득 트리거를 구동합니다.카메라 소프트웨어에서 자동 저장을 활성화하고 이미지를 저장해야 하는 출력 폴더를 설정합니다. 선형 변환기로 XY 평면의 샘플 위치를 수동으로 조정하여 샘플을 카메라 센서의 시야 중심으로 이동합니다. 선형 전동 변환기를 사용하여 Z 축을 따라 샘플을 이동하여 단층 촬영 재구성을위한 심장 경계를 식별합니다.이미징 세션을 시작하기 전에 레이저 출력을 약 20밀리와트로 높입니다. 이미징 소프트웨어의 캡처 패널에서 시작 버튼을 클릭하여 단층 촬영 수집을 시작하고 동시에 전동 변환기를 사용하여 초당 6마이크로미터의 일정한 속도로 Z축을 따라 샘플을 이동하기 시작합니다. 투명도 방법론과 TDE를 굴절률 매질로 조합해도 샘플의 최종 부피가 크게 변경되지 않으며 시편의 등방성 변형이 발생하지 않습니다.여기 광학은 시야의 가장자리에서 최대 175 마이크로 미터까지 분기되는 약 6 마이크로 미터의 최소 폐기물을 가진 라이트 시트를 생성했습니다. 카메라 롤링 셔터와 라이트 시트 폐기물의 축 방향 스캔의 동기화는 전체 시야를 따라 약 6.7 마이크로미터의 평균 FW HM을 초래하는 라이트 시트의 폐기물과 여기된 샘플 부분에서만 방출 신호를 수집하는 것을 보장한다. 현미경의 Z 점 확산 기능은 또한 형광 나노스피어의 단층 촬영 재구성에 의해 추정되었고, 6.4 마이크로미터의 FW H M은 적합에 의해 추정되었다.전체 장기에서 충분한 신호 대 잡음비로 단일 세포막을 3 차원으로 분해하는 시스템의 잠재력도 확인되었습니다. 탈기 절차는 프로토콜의 가장 중요한 단계입니다. 제대로 수행되지 않으면 조직은 세척 용액에서 배양하는 동안 나타내는 손상에 직면할 수 있습니다.제시된 프로토콜은 다중 염색 프로토콜과 결합하여 다양한 생물학적 구조를 통합하는 전체 장기 재건을 달성하고 병리학 모델을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

mesoscopic-optical-imaging-of-whole-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

현미경의 올바른 관리 및 청소

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

연구

생물학

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

라이트 현미경의 주요 구성 요소

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

단계 대비 및 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

전체 심장 이미징에 대한 형광 광 프로젝션 Tomography에 대한 출생 정규화

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

작은 하트의 세미 - 자동 광학 도면 분석

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내</em개발> 이미징 Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑<sup&gt; 2 +</sup&gt;와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...