Name: mesoscopic optical imaging of whole mouse heart
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart at JoVE.com

Dette prosjektet har mottatt finansiering fra EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under tilskuddsavtale No 952166 (REPAIR), MUR under FISR-programmet, prosjekt FISR2019_00320 og Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-prosjektet.

All dyrehåndtering og prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjene fra europaparlamentsdirektiv 2010/63/EU om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål og i samsvar med prinsippene og forskriftene fra det italienske helsedepartementet. Den eksperimentelle protokollen ble godkjent av det italienske helsedepartementet (protokollnummer 647/2015-PR). Alle dyrene ble levert av ENVIGO, Italia. For disse forsøkene ble 5 mannlige C57BL / 6J mus på 6 måneders alder brukt.
1. Op...

<ol>
	<li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li><li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy:+genetic+basis,+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death.">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li><li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function.">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li><li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation.">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+of+fixed+tissue:+a+review+from+a+microscopist's+perspective.">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers.">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart.">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).</li><li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls.">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li><li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery.">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li><li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles.">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li><li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue.">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808 (2015).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes.">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).</li><li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvessel+prediction+in+H&amp;E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks.">Microvessel prediction in H&amp;E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+whole-organ/body+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues.">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).</li></ol>

I dette arbeidet ble en vellykket tilnærming til å fjerne, flekke og avbilde et helt musehjerte i høy oppløsning introdusert. Først ble en vevstransformasjonsprotokoll (CLARITY) optimalisert og utført, litt modifisert for anvendelse på hjertevevet. Faktisk, for å oppnå en effektiv rekonstruksjon i 3D av et helt hjerte, er det viktig å forhindre fenomenet lysspredning. CLARITY-metoden lar oss oppnå et svært gjennomsiktig intakt hjerte, men det krever lange inkubasjonstider når det utføres passivt (ca. 5 mån...

Strukturell ombygging forbundet med hjertesykdommer kan påvirke elektrisk ledning og introdusere elektromekaniske dysfunksjoner av orgelet 1,2. Nåværende tilnærminger som brukes til å forutsi funksjonelle endringer, bruker ofte MR og DT-MR for å oppnå en generell rekonstruksjon av fibroseavsetning, vaskulær tre og fiberfordeling av hjertet, og de brukes til å modellere fortrinnsrett til handlingspotensial forplantning (APP) -baner over orgelet 3,4. Disse strategiene kan gi en vakker oversikt over hjerteorganisasjonen. Imidlertid er deres romlige oppløsning utilstrekkelig til å undersøke virkningen av strukturell ombygging på hjertefunksjonen på mobilnivå.
Å plassere dette rammeverket i en annen størrelsesorden, hvor enkeltceller kan spille individuelle roller på handlingspotensialutbredelse, er utfordrende. Hovedbegrensningen er ineffektiviteten til standard bildebehandlingsmetoder for å utføre høyoppløselig bildebehandling (mikrometrisk oppløsning) i massive (centimeterstore) vev. Faktisk er avbildning av biologisk vev i 3D ved høy oppløsning svært komplisert på grunn av vevs ugjennomsiktighet. Den vanligste tilnærmingen til å utføre 3D-rekonstruksjoner i hele organer er å forberede tynne seksjoner. Presis seksjonering, montering og bildebehandling krever imidlertid betydelig innsats og tid. En alternativ tilnærming som ikke krever kutting av prøven, er å generere et gjennomsiktig vev. I løpet av de siste årene har flere metoder for å avklare vev blitt foreslått 5,6,7,8. Utfordringen med å produsere massivt, gjennomsiktig og fluorescerende merket vev har nylig blitt oppnådd ved å utvikle sanne vevstransformasjonsmetoder (CLARITY9, SHIELD10). Spesielt er CLARITY-metoden basert på transformasjon av et intakt vev til en nanoporøs, hydrogelhybridisert, lipidfri form som gjør det mulig å gi høy gjennomsiktighet ved selektiv fjerning av membranlipid-dobbeltlag. Spesielt har denne metoden blitt funnet vellykket også i hjertepreparasjon11,12,13,14. Men siden hjertet er for skjørt til å være egnet for en aktiv rydding, må det ryddes ved hjelp av passiv tilnærming, noe som krever lang tid å gi fullstendig gjennomsiktighet.
I kombinasjon med avanserte bildebehandlingsteknikker som lysarkmikroskopi, har CLARITY potensialet til å avbilde 3D massive hjertevev ved mikrometrisk oppløsning. Ved lysarkmikroskopi utføres belysningen av prøven med et tynt lysark begrenset i fokusplanet til deteksjonsmålet. Fluorescensutslippet samles langs en akse vinkelrett på belysningsplanet15. Deteksjonsarkitekturen ligner bredfeltsmikroskopi, noe som gjør oppkjøpet mye raskere enn laserskanningsmikroskoper. Ved å flytte prøven gjennom lysarket kan du oppnå en fullstendig tomografi av store prøver, opp til centimeterstore prøver. På grunn av de iboende egenskapene til Gaussian-strålen er det imidlertid mulig å oppnå et veldig tynt (i størrelsesorden noen få mikron) lysark bare for en begrenset romlig utvidelse, og dermed drastisk begrense synsfeltet (FoV). Nylig har en ny eksitasjonsordning blitt introdusert for å overvinne denne begrensningen og søkt om hjerneavbildning, noe som tillater 3d-rekonstruksjoner med isotropisk oppløsning16.
I denne artikkelen presenteres en passiv clearing-tilnærming, noe som muliggjør en betydelig reduksjon av clearingtidspunktet som CLARITY-protokollen trenger. Det metodologiske rammeverket som er beskrevet her, gjør det mulig å rekonstruere et helt musehjerte med mikrometrisk oppløsning i en enkelt tomografisk skanning med en oppkjøpstid i størrelsesorden minutter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-2&#8217; Thiodiethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>166782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>61-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AV-044 Initiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>AVP5874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca flash 4.0 v3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HC Image</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimating lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection arm</td>
			<td>Integrated optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>91863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extera&#236;nal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fold mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BBE1-E02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometric mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS211/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>4.6.1.19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser source</td>
			<td>Integrated Optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long-pass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KB25/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>CI-1316-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized traslator</td>
			<td>Physisk Instrument</td>
			<td>M-122.2DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TL2X-SAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycap AS</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>2606T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relay lens</td>
			<td>Qioptiq</td>
			<td>G063200000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACT508-200-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable lens</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>KNF Neuberger Inc</td>
			<td>N86KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WTB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesoscopic optical imaging of whole mouse heart

Både genetiske og ikke-genetiske hjertesykdommer kan forårsake alvorlige remodeling prosesser i hjertet. Strukturell ombygging, som kollagenavsetning (fibrose) og cellulær feiljustering, kan påvirke elektrisk ledning, introdusere elektromekaniske dysfunksjoner og til slutt føre til arytmi. Nåværende prediktive modeller av disse funksjonelle endringene er basert på ikke-integrert og lavoppløselig strukturell informasjon. Å plassere dette rammeverket på en annen størrelsesorden er utfordrende på grunn av ineffektiviteten til standard bildebehandlingsmetoder ved å utføre høyoppløselig avbildning i massivt vev. I dette arbeidet beskriver vi et metodologisk rammeverk som tillater avbildning av hele musehjerter med mikrometrisk oppløsning. Oppnåelsen av dette målet har krevd en teknologisk innsats der fremskritt innen vevstransformasjon og avbildningsmetoder har blitt kombinert. Først beskriver vi en optimalisert CLARITY-protokoll som er i stand til å transformere et intakt hjerte til en nanoporøs, hydrogelhybridisert, lipidfri form som gir høy gjennomsiktighet og dyp farging. Deretter beskrives et fluorescenslysmikroskop som raskt kan skaffe bilder av et mesoskopisk synsfelt (mm-skala) med mikronskalaoppløsningen. Etter mesoSPIM-prosjektet tillater det unnfangede mikroskopet rekonstruksjon av hele musehjertet med mikrometrisk oppløsning i en enkelt tomografisk skanning. Vi tror at dette metodologiske rammeverket vil gjøre det mulig å avklare involveringen av cytoarkitektur-uorden i de elektriske dysfunksjonene og bane vei for en omfattende modell som vurderer både funksjonelle og strukturelle data, og dermed muliggjøre en enhetlig undersøkelse av de strukturelle årsakene som fører til elektriske og mekaniske endringer etter vevsremodelleringen.

Det utviklede passive clearingoppsettet gjør det mulig å oppnå et ryddet voksent musehjerte (med en dimensjon på 10 mm x 6 mm x 6 mm) på ca. 3 måneder. Alle komponentene i oppsettet er montert som vist i figur 1. Den ubetydelige temperaturgradienten mellom hvert clearingkammer (i størrelsesorden 3 °C) gjør det mulig å opprettholde temperaturen i et riktig område på tvers av alle kamre.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg...

Watch this Scientific Journal Video about Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart at JoVE.com

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Vi rapporterer en metode for mesoskopisk rekonstruksjon av hele musehjertet ved å kombinere nye fremskritt i vevstransformasjon og farging med utvikling av et aksialt skannet lysarkmikroskop.

Mesoskopisk optisk avbildning av hele musehjertet

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Denne metoden kombinerer forbedring av clearingprotokollen med øyekapasiteten til optisk seksjonering av Mesos PIM-teknologien, slik at vi kan utføre en meso scopic rekonstruksjoner ved mikrometrisk oppløsning. Det gir muligheten til å avbilde massive hjertevev eller hele musehjerter hele løsningen i en enkelt skanning uten å miste den opprinnelige tredimensjonale vevsorganisasjonen. Etter at hjertet har blitt kanylert av proksimal aorta vasket i tyrooppløsning og festet i 4% paraformaldehyd i 0,01 molar PBS, er den klar til å starte clearingprotokollen.Vask hjertet tre ganger i 0,01 molar PBS ved fire grader Celsius i 15 minutter. Etter dette trinnet kan hjertet lagres i PBS og 0,01% natriumazid ved fire grader Celsius i flere måneder. Inkuber hjertet i 20 milliliter hydrogelløsning i risting ved 15 o / min i tre dager ved fire grader Celsius.Avgass prøven ved romtemperatur ved hjelp av en tørketrommel, en vakuumpumpe og et rørsystem som kobler tørketrommelen til både pumpebåndet og nitrogenrørledningen. Plasser prøven i tørketrommelen og åpne hetteglasset med hetten på. Lukk tørketrommelen og fjern oksygenet fra røret ved å åpne nitrogenrørledningen.Slå på vakuumpumpen for å fjerne oksygen fra tørketrommelen i 10 minutter. Slå av pumpen og åpne knappen på tørketrommelen til nitrogenrørledningen. Åpne deretter nitrogenkranen.Når trykket er lik atmosfæretrykket, åpner du tørketrommelen forsiktig og lukker hetteglasset raskt. Hold hjertet i De-gasset hydrogel løsning ved 37 grader Celsius i ca tre timer i ro. Når hydrogelen er riktig polymerisert og virker helt gelatinøs, fjern forsiktig hjertet fra det og legg det i en ryddeløsning i hetteglasset med clearingoppløsning.Bytt clearingoppløsningen i hetteglasset én gang hver tredje dag for å fremskynde klaringsprosedyren. Når hjertet virker helt avklart, fjern det fra hetteglasset og vask det i 50 milliliter oppvarmet PBS i 24 timer i ristingstilstand. Vask igjen i 50 milliliter av en X PBS T i 24 timer i ristingstilstand.Inkuber prøven i 0,01 milligram per milliliter hvetekim aglutinin Alexa gulv 633 i tre milliliter av en X PBS T i risting tilstand ved 50 RPM ved romtemperatur i syv dager. Etter syv dagers inkubasjon, vask prøven i 50 milliliter av en X PBS T ved romtemperatur ved risting i 24 timer. Inkuber prøven i 4% PFA i 15 minutter og vask den deretter tre ganger i 0,01 molar PBS i fem minutter hver.Inkuber hjertet suksessivt i 20 og 47% TDE i 0,01 molar PBS i åtte timer hver. Og så til slutt på 68% TDE i 0,01 molar PBS for å gi den nødvendige brytningsindeksen på 1,46. Fyll forsiktig ca 80% av den eksterne kvarts quvet med brytningsindeksmediet.Fyll den indre kvarts quvet med samme brytningsindeksmedium. Senk prøven inne i den interne quvet. Flytt prøven forsiktig til bunnen av quvet ved hjelp av tynn pinsett og ordne hjertet med sin langsgående akse parallelt med quvets hovedakse for å minimere eksitasjonslysbanen over vevet under skanningen.Fest den skreddersydde pluggen forsiktig over den indre quvet med to skruer. Monter prøven til mikroskopstadiet ved hjelp av magneter. Oversett det vertikale prøvetrinnet manuelt for å fordype den interne quvet i den eksterne.Slå på eksitasjonslyskilden med en bølgelengde på 638 nanometer og sett den med lav effekt i størrelsesorden tre milliwatt. Flytt prøven ved hjelp av den motoriserte oversetteren for å belyse en indre plate av vevet. Slå på HC image live camera-programvaren og sett kamerautløseren på ekstern kantutløserlysarkmodus for å drive anskaffelsesutløseren til kameraet ved hjelp av den tilpassede programvaren som styrer hele oppsettet.Aktiver automatisk lagring i kameraprogramvaren og angi utdatamappen der bildene må lagres. Juster prøveposisjonen manuelt i X Y-planet med de lineære oversetterne for å flytte prøven til midten av kamerasensorens synsfelt. Flytt prøven langs Z-aksen ved hjelp av den lineære motoriserte oversetteren for å identifisere hjertegrenser for tomografisk rekonstruksjon.Øk lasereffekten til omtrent 20 milliwatt før du begynner på bildeøkten. Start det tomografiske oppkjøpet ved å klikke på startknappen i opptakspanelet til bildebehandlingsprogramvaren, og begynn samtidig å flytte prøven langs Z-aksen med konstant hastighet på seks mikrometer per sekund ved hjelp av den motoriserte oversetteren. Kombinasjonen av klarhetsmetodikken med TDE som brytningsindeksmedium endrer ikke prøvens endelige volum signifikant og fører heller ikke til en isotrop deformasjon av prøven.Eksitasjonsoptikken produserte et lysark med et minimum avfall på omtrent seks mikrometer som divergerte opp til 175 mikrometer ved kanten av synsfeltet. Synkroniseringen av kameraets rullende lukker med den aksiale skanningen av lysplateavfallet sørget for å samle utslippssignalet bare i prøvedelen begeistret med avfallet fra lysarket, noe som resulterte i en gjennomsnittlig F W H M på ca. 6,7 mikrometer langs hele synsfeltet. Z-punktspredningsfunksjonen til mikroskopet ble også estimert ved en tomografisk rekonstruksjon av den fluorescerende nanosfæren, og en F W H M på 6, 4 mikrometer ble estimert av passformen.Systemets potensialitet for å løse enkeltcellemembraner i tre dimensjoner med tilstrekkelig signal / støyforhold i hele orgelet ble også bekreftet. Avgassingsprosedyren er det mest kritiske trinnet i protokollen. Hvis det ikke utføres riktig, kan vevet støte på skader som indikerer under inkubasjonen i en rengjøringsløsning.Den presenterte protokollen kan kombineres med en multifargingsprotokoll for å oppnå en hel organrekonstruksjon som integrerer forskjellige biologiske strukturer og kan brukes til å studere patologiske modeller.

mesoscopic-optical-imaging-of-whole-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Metode for den embryonale mus Hjerte

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Optisk Kartlegging av Intra-sarkoplasmatisk retikulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Og transmembranpotensiale i Langendorff-perfusert Rabbit Hjerte

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Utarbeidelse og Longitudinal Imaging av hjertefunksjonen in vivo ved hjelp Optical Coherence Mikroskopi (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...