Name: mesoscopic optical imaging of whole mouse heart
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00
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Este projeto recebeu financiamentos do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do contrato de subvenção n.º 952166 (REPAIR), MUR no âmbito do programa FISR, projeto FISR2019_00320 e Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, projeto PERCARE.

Todos os manuseamentos e procedimentos de animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos e em conformidade com os princípios e regulamentos do Ministério da Saúde italiano. O protocolo experimental foi aprovado pelo Ministério da Saúde italiano (protocolo número 647/2015-PR). Todos os animais foram fornecidos pela ENVIGO, Itália. Para esses experimentos, foram utilizados 5 camundongos machos C57B...

<ol>
	<li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li><li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy:+genetic+basis,+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death.">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li><li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function.">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li><li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation.">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+of+fixed+tissue:+a+review+from+a+microscopist's+perspective.">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers.">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart.">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).</li><li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls.">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li><li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery.">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li><li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles.">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li><li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue.">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808 (2015).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes.">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).</li><li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvessel+prediction+in+H&amp;E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks.">Microvessel prediction in H&amp;E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+whole-organ/body+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues.">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).</li></ol>

Neste trabalho, uma abordagem bem-sucedida para limpar, manchar e visualizar todo o coração de um rato em alta resolução foi introduzida. Primeiramente, um protocolo de transformação tecidual (CLARITY) foi otimizado e realizado, levemente modificado para sua aplicação no tecido cardíaco. De fato, para obter uma reconstrução eficiente em 3D de todo um coração, é essencial evitar o fenômeno da dispersão da luz. A metodologia CLARITY permite-nos obter um coração intacto altamente transparente, mas requer l...

O remodelamento estrutural associado a doenças cardíacas pode afetar a condução elétrica e introduzir disfunções eletromecânicas do órgão 1,2. As abordagens atuais utilizadas para predizer alterações funcionais comumente empregam RM e DT-MRI para obter uma reconstrução geral da deposição de fibrose, árvore vascular e distribuição de fibras do coração, e são usadas para modelar caminhos de propagação do potencial de ação preferencial (APP) através do órgão 3,4. Essas estratégias podem fornecer uma bela visão geral da organização do coração. No entanto, sua resolução espacial é insuficiente para investigar o impacto do remodelamento estrutural na função cardíaca em nível celular.
Colocar essa estrutura em uma ordem diferente de magnitude, onde células individuais podem desempenhar papéis individuais na propagação do potencial de ação, é um desafio. A principal limitação é a ineficiência dos métodos de imagem padrão para realizar imagens de alta resolução (resolução micrométrica) em tecidos maciços (tamanho de centímetros). De fato, a imagem de tecidos biológicos em 3D em alta resolução é muito complicada devido à opacidade do tecido. A abordagem mais comum para realizar reconstruções 3D em órgãos inteiros é preparar seções finas. No entanto, o seccionamento, a montagem e a imagem precisos exigem esforço e tempo significativos. Uma abordagem alternativa que não exija o corte da amostra é gerar um tecido transparente. Nos últimos anos, diversas metodologias de clarificação de tecidos têm sido propostas 5,6,7,8. O desafio de produzir tecidos maciços, transparentes e marcados fluorescentemente foi recentemente alcançado através do desenvolvimento de verdadeiras abordagens de transformação de tecidos (CLARITY9, SHIELD10). Em particular, o método CLARITY baseia-se na transformação de um tecido intacto em uma forma nanoporosa, hibridizada em hidrogel e livre de lipídios que permite conferir alta transparência pela remoção seletiva de bicamadas lipídicas de membrana. Notavelmente, esse método tem sido bem sucedido também no preparo cardíaco 11,12,13,14. No entanto, uma vez que o coração é demasiado frágil para ser adequado para uma clareira activa, deve ser limpo utilizando a abordagem passiva, que requer muito tempo para conferir total transparência.
Em combinação com técnicas avançadas de imagem, como a microscopia de folha de luz, o CLARITY tem o potencial de visualizar tecidos cardíacos maciços em 3D em resolução micrométrica. Na microscopia de folha de luz, a iluminação da amostra é realizada com uma fina folha de luz confinada no plano focal do objetivo de detecção. A emissão de fluorescência é coletada ao longo de um eixo perpendicular ao plano de iluminação15. A arquitetura de detecção é semelhante à microscopia de campo amplo, tornando a aquisição muito mais rápida do que os microscópios de varredura a laser. Mover a amostra através da folha de luz permite obter uma tomografia completa de grandes espécimes, amostras de até centímetros. No entanto, devido às propriedades intrínsecas do feixe gaussiano, é possível obter uma folha de luz muito fina (da ordem de alguns mícrons) apenas para uma extensão espacial limitada, limitando drasticamente o campo de visão (FoV). Recentemente, um novo esquema de excitação foi introduzido para superar essa limitação e aplicado para imagens cerebrais, permitindo reconstruções 3D com resolução isotrópica16.
Neste artigo, uma abordagem de compensação passiva é apresentada, permitindo uma redução significativa do tempo de compensação necessário para o protocolo CLARITY. O referencial metodológico aqui descrito permite reconstruir todo um coração de camundongo com resolução micrométrica em uma única tomografia com tempo de aquisição na ordem de minutos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-2&#8217; Thiodiethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>166782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>61-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AV-044 Initiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>AVP5874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca flash 4.0 v3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HC Image</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimating lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection arm</td>
			<td>Integrated optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>91863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extera&#236;nal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fold mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BBE1-E02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometric mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS211/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>4.6.1.19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser source</td>
			<td>Integrated Optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long-pass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KB25/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>CI-1316-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized traslator</td>
			<td>Physisk Instrument</td>
			<td>M-122.2DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TL2X-SAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycap AS</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>2606T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relay lens</td>
			<td>Qioptiq</td>
			<td>G063200000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACT508-200-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable lens</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>KNF Neuberger Inc</td>
			<td>N86KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WTB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesoscopic optical imaging of whole mouse heart

Doenças cardíacas genéticas e não genéticas podem causar processos graves de remodelação no coração. O remodelamento estrutural, como a deposição de colágeno (fibrose) e o desalinhamento celular, pode afetar a condução elétrica, introduzir disfunções eletromecânicas e, eventualmente, levar à arritmia. Os modelos preditivos atuais dessas alterações funcionais são baseados em informações estruturais não integradas e de baixa resolução. Colocar essa estrutura em uma ordem diferente de magnitude é um desafio devido à ineficácia dos métodos de imagem padrão na realização de imagens de alta resolução em tecidos maciços. Neste trabalho, descrevemos um referencial metodológico que permite a imagem de corações inteiros de camundongos com resolução micrométrica. A consecução deste objetivo exigiu um esforço tecnológico onde os avanços na transformação de tecidos e métodos de imagem foram combinados. Primeiro, descrevemos um protocolo CLARITY otimizado capaz de transformar um coração intacto em uma forma nanoporosa, hibridizada em hidrogel e livre de lipídios que permite alta transparência e coloração profunda. Em seguida, um microscópio de folha de luz de fluorescência capaz de adquirir rapidamente imagens de um campo de visão mesoscópico (escala mm) com a resolução em escala mícron é descrito. Seguindo o projeto mesoSPIM, o microscópio concebido permite a reconstrução de todo o coração do rato com resolução micrométrica em uma única varredura tomográfica. Acreditamos que esse referencial metodológico permitirá esclarecer o envolvimento do desarranjo citoarquitetônico nas disfunções elétricas e abrir caminho para um modelo abrangente que considere tanto os dados funcionais quanto estruturais, possibilitando assim uma investigação unificada das causas estruturais que levam a alterações elétricas e mecânicas após o remodelamento tecidual.

A configuração de limpeza passiva desenvolvida permite obter um coração de rato adulto limpo (com uma dimensão da ordem 10 mm x 6 mm x 6 mm) em cerca de 3 meses. Todos os componentes da configuração são montados como mostrado na Figura 1. O gradiente de temperatura insignificante entre cada câmara de compensação (da ordem de 3 ° C) permite manter a temperatura em uma faixa adequada em todas as câmaras.
<img alt="Figure...

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Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Relatamos um método para reconstrução mesoscópica de todo o coração do rato, combinando novos avanços na transformação e coloração de tecidos com o desenvolvimento de um microscópio de folha de luz digitalizado axialmente.

Imagem óptica mesoscópica do coração de todo o rato

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Esta metodologia combina a melhoria do protocolo de limpeza com a capacidade ocular de seccionamento óptico da tecnologia Mesos PIM, permitindo-nos realizar reconstruções meso scópicas em resolução micrométrica. Ele fornece a possibilidade de visualizar tecidos cardíacos maciços ou toda a solução de corações de camundongos inteiros em uma única varredura sem perder a organização tridimensional original do tecido. Após o coração ter sido canulado por aorta proximal lavada em solução de tiro e fixada em aldeído 4% Paraform em PBS molar 0,01, está pronto para iniciar o protocolo de limpeza.Lave o coração três vezes em 0,01 molar PBS a quatro graus Celsius por 15 minutos. Após esta etapa, o coração pode ser armazenado em PBS e 0,01% de azida de sódio a quatro graus Celsius por vários meses. Incubar o coração em 20 mililitros de solução de hidrogel em condição de agitação a 15 RPM durante três dias a quatro graus Celsius.Desengaseifique a amostra à temperatura ambiente usando um secador, uma bomba de vácuo e um sistema de tubos que conecta o secador à banda da bomba e à tubulação de nitrogênio. Coloque a amostra no secador e abra o frasco para injetáveis mantendo a tampa sobre ele. Feche o secador e remova o oxigênio do tubo abrindo a tubulação de nitrogênio.Ligue a bomba de vácuo para remover o oxigênio do secador por 10 minutos. Desligue a bomba e abra o botão do secador para a tubulação de nitrogênio. Em seguida, abra a torneira de nitrogênio.Uma vez que a pressão seja igual à pressão atmosférica, abra cuidadosamente o secador e feche rapidamente o frasco para injetáveis. Mantenha o coração na solução de hidrogel desgaseificado a 37 graus Celsius por cerca de três horas em repouso. Quando o hidrogel estiver devidamente polimerizado e parecer inteiramente gelatinoso, retire cuidadosamente o coração dele e coloque-o numa solução de limpeza no frasco para injetáveis com solução de limpeza.Troque a solução de depuração no frasco para injetáveis uma vez de três em três dias para acelerar o procedimento de clarificação. Uma vez que o coração pareça completamente clarificado, retire-o do frasco para injetáveis e lave-o em 50 mililitros de PBS aquecido durante 24 horas em condições de agitação. Lave novamente em 50 mililitros de um X PBS T por 24 horas em condições de agitação.Incubar a amostra em 0,01 miligramas por mililitros de gérmen de trigo aglutinina Alexa piso 633 em três mililitros de um X PBS T em condição de agitação a 50 RPM à temperatura ambiente durante sete dias. Após a incubação de sete dias, lavar a amostra em 50 mililitros de um X PBS T à temperatura ambiente em agitação por 24 horas. Incubar a amostra em PFA a 4% durante 15 minutos e, em seguida, lavá-la três vezes em PBS 0,01 molar durante cinco minutos cada.Incubar o coração sucessivamente em 20 e 47%TDE em 0,01 molar PBS por oito horas cada. E, finalmente, a 68%TDE em 0,01 molar PBS para fornecer o índice de refração necessário de 1,46. Encha suavemente cerca de 80% do quvet de quartzo externo com o meio de índice de refração.Encha o quvet de quartzo interno com o mesmo meio de índice de refração. Mergulhe a amostra dentro do quvet interno. Mova suavemente a amostra para o fundo do quvet usando pinças finas e organize o coração com seu eixo longitudinal paralelo ao eixo principal do quvet para minimizar o caminho da luz de excitação através do tecido durante a digitalização.Fixe cuidadosamente o plugue sob medida acima do quvet interno com dois parafusos. Monte a amostra no estágio do microscópio usando ímãs. Traduza o estágio de amostra vertical manualmente para imergir o quvet interno no externo.Ligue a fonte de luz de excitação com um comprimento de onda de 638 nanômetros e defina-a em baixa potência na ordem de três miliwatts. Mova a amostra usando o tradutor motorizado para iluminar uma placa interna do tecido. Ligue o software da câmera ao vivo de imagem HC e defina o gatilho da câmera no modo de folha de luz do gatilho de borda externa para acionar o gatilho de aquisição da câmera pelo software personalizado que controla toda a configuração.Habilite o salvamento automático no software da câmera e defina a pasta de saída onde as imagens precisam ser salvas. Ajuste manualmente a posição da amostra no plano X Y com os tradutores lineares para mover a amostra para o centro do campo de visão do sensor da câmera. Mova a amostra ao longo do eixo Z usando o tradutor motorizado linear para identificar as bordas do coração para reconstrução tomográfica.Aumente a potência do laser para aproximadamente 20 miliwatts antes de começar a sessão de imagem. Inicie a aquisição tomográfica clicando no botão Iniciar no painel de captura do software de imagem e, ao mesmo tempo, comece a mover a amostra ao longo do eixo Z na velocidade constante de seis micrômetros por segundo usando o tradutor motorizado. A combinação da metodologia de clareza com TDE como meio de índice de refração não altera significativamente o volume final da amostra nem leva a uma deformação isotrópica do espécime.A óptica de excitação produziu uma folha de luz com um desperdício mínimo de cerca de seis micrômetros que divergiram até 175 micrômetros na borda do campo de visão. A sincronização do obturador de rolamento da câmera com a varredura axial dos resíduos da folha de luz garantiu a coleta do sinal de emissão apenas na porção da amostra excitada com o desperdício da folha de luz, resultando em uma média F W H M de cerca de 6,7 micrômetros ao longo de todo o campo de visão. A função de espalhamento do ponto Z do microscópio também foi estimada por uma reconstrução tomográfica da nanoesfera fluorescente e um F W H M de 6,4 micrômetros foi estimado pelo ajuste.A potencialidade do sistema para resolver membranas celulares únicas em três dimensões com uma relação sinal/ruído suficiente em todo o órgão também foi confirmada. O procedimento de desgaseificação é a etapa mais crítica do protocolo. Se não for realizado corretamente, o tecido pode encontrar danos indicando durante a incubação em uma solução de limpeza.O protocolo apresentado pode ser combinado com um protocolo de coloração múltipla para alcançar uma reconstrução de todo o órgão integrando diferentes estruturas biológicas e pode ser aplicado ao estudo de modelos patológicos.

mesoscopic-optical-imaging-of-whole-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Cuidados e limpeza do microscópio

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Biologia

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Componentes principais do microscópio de luz

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contraste de fase e de interferência diferencial Contrast Microscopy (DIC)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

Normalização nascido para Tomografia Projeção de fluorescência óptica para imagens de todo o coração

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Semi-automático de análise de pulsação óptica de pequenos corações

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de Cultura para o Rato coração embrionário

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Mapeamento óptica de Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E Potencial Transmembrane no Coração Langendorff-perfundidos

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Preparação e imagem longitudinal do coração Função In Vivo Usando Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...