Name: mesoscopic optical imaging of whole mouse heart
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart at JoVE.com

Detta projekt har fått finansiering från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt bidragsavtal nr 952166 (REPAIR), MUR under FISR-programmet, projekt FISR2019_00320 och Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-projektet.

All djurhantering och alla försök utfördes i enlighet med riktlinjerna från Europaparlamentets direktiv 2010/63/EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål och överensstämde med principerna och bestämmelserna från det italienska hälsoministeriet. Det experimentella protokollet godkändes av det italienska hälsoministeriet (protokollnummer 647/2015-PR). Alla djuren tillhandahölls av ENVIGO, Italien. För dessa experiment användes 5 manliga C57BL/6J-möss med 6 månaders ålder.
<p class="...

<ol>
	<li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li><li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy:+genetic+basis,+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death.">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li><li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function.">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li><li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation.">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+of+fixed+tissue:+a+review+from+a+microscopist's+perspective.">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers.">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart.">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).</li><li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls.">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li><li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery.">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li><li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles.">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li><li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue.">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808 (2015).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes.">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).</li><li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvessel+prediction+in+H&amp;E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks.">Microvessel prediction in H&amp;E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+whole-organ/body+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues.">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).</li></ol>

I detta arbete introducerades ett framgångsrikt tillvägagångssätt för att rensa, fläcka och avbilda ett helt mushjärta med hög upplösning. Först optimerades och utfördes ett vävnadstransformationsprotokoll (CLARITY), något modifierat för dess applicering på hjärtvävnaden. För att få en effektiv rekonstruktion i 3D av ett helt hjärta är det faktiskt viktigt att förhindra fenomenet ljusspridning. CLARITY-metoden gör det möjligt för oss att få ett mycket transparent intakt hjärta, men det kräver ...

Strukturell ombyggnad i samband med hjärtsjukdomar kan påverka elektrisk ledning och införa elektromekaniska dysfunktioner i organet 1,2. Nuvarande metoder som används för att förutsäga funktionella förändringar använder vanligtvis MR och DT-MRI för att erhålla en övergripande rekonstruktion av fibrosavsättning, vaskulärt träd och fiberfördelning av hjärtat, och de används för att modellera APP-vägar (Preferential Action Potential Propagation) över organet 3,4. Dessa strategier kan ge en vacker översikt över hjärtorganisationen. Deras rumsliga upplösning är dock otillräcklig för att undersöka effekterna av strukturell ombyggnad på hjärtfunktionen på cellnivå.
Att placera detta ramverk i en annan storleksordning, där enskilda celler kan spela individuella roller på handlingspotentialutbredning, är utmanande. Huvudbegränsningen är ineffektiviteten hos standardavbildningsmetoder för att utföra högupplöst avbildning (mikrometrisk upplösning) i massiva (centimeterstora) vävnader. Faktum är att avbildning av biologiska vävnader i 3D vid hög upplösning är mycket komplicerat på grund av vävnadsogenomskinlighet. Det vanligaste sättet att utföra 3D-rekonstruktioner i hela organ är att förbereda tunna sektioner. Exakt sektionering, montering och avbildning kräver dock betydande ansträngning och tid. Ett alternativt tillvägagångssätt som inte kräver att provet skärs är att generera en transparent vävnad. Under de senaste åren har flera metoder för att klargöra vävnader föreslagits 5,6,7,8. Utmaningen att producera massiva, transparenta och fluorescerande märkta vävnader har nyligen uppnåtts genom att utveckla sanna vävnadstransformationsmetoder (CLARITY9, SHIELD10). I synnerhet är CLARITY-metoden baserad på omvandlingen av en intakt vävnad till en nanoporös, hydrogelhybridiserad, lipidfri form som gör det möjligt att ge hög transparens genom selektivt avlägsnande av membranlipid-dubbelskikt. I synnerhet har denna metod visat sig framgångsrik även i hjärtpreparat11,12,13,14. Men eftersom hjärtat är för bräckligt för att vara lämpligt för en aktiv röjning, måste det rensas med det passiva tillvägagångssättet, vilket kräver lång tid för att ge fullständig transparens.
I kombination med avancerade bildtekniker som ljusarkmikroskopi har CLARITY potential att avbilda massiva 3D-hjärtvävnader med mikrometrisk upplösning. I ljusarkmikroskopi utförs belysningen av provet med ett tunt ljusark begränsat i detektionsmålets fokalplan. Fluorescensemissionen samlas upp längs en axel vinkelrätt mot belysningsplanet15. Detektionsarkitekturen liknar widefieldmikroskopi, vilket gör förvärvet mycket snabbare än laserskanningsmikroskop. Genom att flytta provet genom ljusarket kan man få en fullständig tomografi av stora prover, upp till centimeterstora prover. På grund av de inneboende egenskaperna hos den gaussiska strålen är det emellertid möjligt att erhålla ett mycket tunt (i storleksordningen några mikron) ljusark endast för en begränsad rumslig förlängning, vilket drastiskt begränsar synfältet (FoV). Nyligen har ett nytt excitationsschema introducerats för att övervinna denna begränsning och tillämpas för hjärnavbildning, vilket möjliggör 3d-rekonstruktioner med isotrop upplösning16.
I detta dokument presenteras en passiv clearingmetod som möjliggör en betydande minskning av den clearingtid som krävs enligt CLARITY-protokollet. Den metodologiska ramen som beskrivs här möjliggör rekonstruktion av ett helt mushjärta med mikrometrisk upplösning i en enda tomografisk skanning med en förvärvstid i storleksordningen minuter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-2&#8217; Thiodiethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>166782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>61-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AV-044 Initiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>AVP5874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca flash 4.0 v3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HC Image</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimating lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection arm</td>
			<td>Integrated optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>91863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extera&#236;nal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fold mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BBE1-E02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometric mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS211/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>4.6.1.19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser source</td>
			<td>Integrated Optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long-pass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KB25/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>CI-1316-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized traslator</td>
			<td>Physisk Instrument</td>
			<td>M-122.2DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TL2X-SAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycap AS</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>2606T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relay lens</td>
			<td>Qioptiq</td>
			<td>G063200000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACT508-200-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable lens</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>KNF Neuberger Inc</td>
			<td>N86KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WTB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesoscopic optical imaging of whole mouse heart

Både genetiska och icke-genetiska hjärtsjukdomar kan orsaka allvarliga ombyggnadsprocesser i hjärtat. Strukturell ombyggnad, såsom kollagenavsättning (fibros) och cellulär felinriktning, kan påverka elektrisk ledning, införa elektromekaniska dysfunktioner och så småningom leda till arytmi. Nuvarande prediktiva modeller av dessa funktionella förändringar är baserade på icke-integrerad och lågupplöst strukturell information. Att placera detta ramverk i en annan storleksordning är utmanande på grund av ineffektiviteten hos standardavbildningsmetoder för att utföra högupplöst avbildning i massiv vävnad. I detta arbete beskriver vi ett metodiskt ramverk som möjliggör avbildning av hela mushjärtan med mikrometrisk upplösning. För att uppnå detta mål har det krävts en teknisk insats där framsteg inom vävnadsomvandling och avbildningsmetoder har kombinerats. Först beskriver vi ett optimerat CLARITY-protokoll som kan omvandla ett intakt hjärta till en nanoporös, hydrogelhybridiserad, lipidfri form som möjliggör hög transparens och djup färgning. Därefter beskrivs ett fluorescensljusarkmikroskop som snabbt kan förvärva bilder av ett mesoskopiskt synfält (mm-skala) med mikronskalans upplösning. Efter mesoSPIM-projektet möjliggör det tänkta mikroskopet rekonstruktion av hela mushjärtat med mikrometrisk upplösning i en enda tomografisk skanning. Vi tror att denna metodologiska ram kommer att göra det möjligt att klargöra involveringen av cytoarkitekturens oordning i de elektriska dysfunktionerna och bana väg för en omfattande modell som tar hänsyn till både funktionella och strukturella data, vilket möjliggör en enhetlig undersökning av de strukturella orsakerna som leder till elektriska och mekaniska förändringar efter vävnadsombyggnad.

Den utvecklade passiva röjningsinställningen gör det möjligt att få ett rensat vuxet mushjärta (med en dimension av ordningen 10 mm x 6 mm x 6 mm) på cirka 3 månader. Alla komponenter i installationen är monterade som visas i figur 1. Den försumbara temperaturgradienten mellan varje röjningskammare (i storleksordningen 3 °C) gör det möjligt att hålla temperaturen inom ett lämpligt intervall över alla kammare.
<img ...

Watch this Scientific Journal Video about Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart at JoVE.com

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Vi rapporterar en metod för mesoskopisk rekonstruktion av hela mushjärtat genom att kombinera nya framsteg inom vävnadstransformation och färgning med utvecklingen av ett axiellt skannat ljusarkmikroskop.

Mesoskopisk optisk avbildning av hela mushjärtat

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Denna metod kombinerar förbättring av clearingprotokoll med ögonförmågan för optisk sektionering av Mesos PIM-tekniken så att vi kan utföra en meso-skopisk rekonstruktion med mikrometrisk upplösning. Det ger möjlighet att avbilda massiva hjärtvävnader eller hela mushjärtan hela lösningen i en enda skanning utan att förlora den ursprungliga tredimensionella vävnadsorganisationen. Efter att hjärtat har kannulerats av proximal aorta tvättad i tyrolösning och fixerad i 4% Paraformaldehyd i 0,01 molar PBS är det redo att starta clearingprotokollet.Tvätta hjärtat tre gånger i 0,01 molar PBS vid fyra grader Celsius i 15 minuter. Efter detta steg kan hjärtat lagras i PBS och 0,01% natriumazid vid fyra grader Celsius i flera månader. Inkubera hjärtat i 20 ml hydrogellösning i skakningstillstånd vid 15 varv / min i tre dagar vid fyra grader Celsius.Avgasa provet vid rumstemperatur med hjälp av en torktumlare, en vakuumpump och ett rörsystem som ansluter torken till både pumpbandet och kväveledningen. Placera provet i torktumlaren och öppna injektionsflaskan och håll locket på. Stäng torken och ta bort syret från röret genom att öppna kväveledningen.Slå på vakuumpumpen för att ta bort syret från torken i 10 minuter. Stäng av pumpen och öppna torkens ratt till kväveledningen. Öppna sedan kvävekranen.När trycket är lika med atmosfärstrycket öppnar du försiktigt torken och stänger snabbt injektionsflaskan. Håll hjärtat i den avgasade hydrogellösningen vid 37 grader Celsius i cirka tre timmar i vila. När hydrogelen är ordentligt polymeriserad och verkar helt gelatinös, ta försiktigt bort hjärtat från det och placera det i en clearinglösning i injektionsflaskan med clearinglösning.Byt clearinglösningen i injektionsflaskan en gång var tredje dag för att påskynda förtydligandet. När hjärtat verkar helt klargjort ta bort det från injektionsflaskan och tvätta det i 50 ml uppvärmd PBS i 24 timmar i skakande tillstånd. Tvätta igen i 50 ml av en X PBS T i 24 timmar i skakande tillstånd.Inkubera provet i 0,01 milligram per milliliter vetegroddar aglutinin Alexa golv 633 i tre milliliter av en X PBS T i skakningstillstånd vid 50 rpm vid rumstemperatur i sju dagar. Efter sju dagars inkubation, tvätta provet i 50 ml av en X PBS T vid rumstemperatur under skakning i 24 timmar. Inkubera provet i 4% PFA i 15 minuter och tvätta det sedan tre gånger i 0,01 molar PBS i fem minuter vardera.Inkubera hjärtat successivt i 20 och 47% TDE i 0,01 molar PBS i åtta timmar vardera. Och sedan slutligen vid 68% TDE i 0,01 molar PBS för att ge det erforderliga brytningsindexet på 1,46. Fyll försiktigt cirka 80% av den externa kvartsquivet med brytningsindexmediet.Fyll den inre kvartsquivet med samma brytningsindexmedium. Sänk ner provet inuti den inre kvavten. Flytta försiktigt provet till botten av kvetten med hjälp av tunn pincett och ordna hjärtat med dess längsgående axel parallellt med kvettens huvudaxel för att minimera excitationsljusets väg över vävnaden under skanningen.Fäst försiktigt den skräddarsydda kontakten ovanför den inre täcket med två skruvar. Montera provet på mikroskopsteget med magneter. Översätt det vertikala provsteget manuellt för att fördjupa det interna kvavet i det externa.Slå på excitationsljuskällan med en våglängd på 638 nanometer och ställ in den på låg effekt i storleksordningen tre milliwatt. Flytta provet med hjälp av den motoriserade översättaren för att belysa en inre platta i vävnaden. Slå på HC-bildkameraprogramvaran och ställ in kamerautlösaren på externt kantutlösarljusarkläge för att driva kamerans förvärvsutlösare av den anpassade programvaran som styr hela installationen.Aktivera automatisk spara i kameraprogramvaran och ställ in utdatamappen där bilderna måste sparas. Justera provpositionen manuellt i X Y-planet med de linjära översättarna för att flytta provet till mitten av kamerasensorns synfält. Flytta provet längs Z-axeln med hjälp av den linjära motoriserade översättaren för att identifiera hjärtgränser för tomografisk rekonstruktion.Öka lasereffekten till cirka 20 milliwatt innan du börjar för bildsessionen. Starta det tomografiska förvärvet genom att klicka på startknappen i bildprogramvarans inspelningspanel och börja samtidigt flytta provet längs Z-axeln med konstant hastighet på sex mikrometer per sekund med hjälp av den motoriserade översättaren. Kombinationen av klarhetsmetoden med TDE som brytningsindexmedium ändrar inte provets slutliga volym signifikant och leder inte heller till en isotrop deformation av provet.Excitationsoptiken producerade ett ljusark med ett minimalt avfall på cirka sex mikrometer som divergerade upp till 175 mikrometer vid kanten av synfältet. Synkroniseringen av kamerans rullande slutare med den axiella skanningen av ljusarkavfallet säkerställde att utsläppssignalen endast samlades in i provdelen upphetsad med avfallet från ljusarket vilket resulterade i en genomsnittlig F W H M på cirka 6,7 mikrometer längs hela synfältet. Mikroskopets Z-punktspridningsfunktion uppskattades också genom en tomografisk rekonstruktion av den fluorescerande nanosfären och en F W H M på 6,4 mikrometer uppskattades av passformen.Systemets potential att lösa enstaka cellmembran i tre dimensioner med ett tillräckligt signal-brusförhållande i hela organet bekräftades också. Avgasningsförfarandet är det mest kritiska steget i protokollet. Om det inte utförs korrekt kan vävnaden stöta på skador som indikerar under inkubationen i en rengöringslösning.Det presenterade protokollet kan kombineras med ett multifärgningsprotokoll för att uppnå en hel organrekonstruktion som integrerar olika biologiska strukturer och kan tillämpas för att studera patologiska modeller.

Research

JoVE Journal

Biology

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Korrekt vård och rengöring av mikroskopet

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

Viktigaste komponenterna i ljusmikroskop

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Faskontrast och differentierad interferenskontrast (DIC) Mikroskopi

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Född Normalisering för fluorescens Optical Projection Tomography för hela hjärtat Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Semi-automatisk optisk Heartbeat Analys av små hjärtan

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoskopisk Fluorescens Tomografi för In-vivo Imaging för att utveckla Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging och terapeutiska behandlingar i en Orthotopic musmodell av äggstockscancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Hela montering Immunhistokemisk Analys för Embryonala Limb Skin kärlsystemet: ett modellsystem för studier Vascular Avgrening morfogenes i Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Metod för embryonala Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optisk Kartläggning av Intra-sarkoplasmatiska retiklet Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Och transmembranpotentialen i Langendorff-perfusion Kanin hjärta

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...