Name: mesoscopic optical imaging of whole mouse heart
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart at JoVE.com

Detta projekt har fått finansiering från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt bidragsavtal nr 952166 (REPAIR), MUR under FISR-programmet, projekt FISR2019_00320 och Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-projektet.

All djurhantering och alla försök utfördes i enlighet med riktlinjerna från Europaparlamentets direktiv 2010/63/EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål och överensstämde med principerna och bestämmelserna från det italienska hälsoministeriet. Det experimentella protokollet godkändes av det italienska hälsoministeriet (protokollnummer 647/2015-PR). Alla djuren tillhandahölls av ENVIGO, Italien. För dessa experiment användes 5 manliga C57BL/6J-möss med 6 månaders ålder.
<p class="...

<ol>
	<li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li><li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy:+genetic+basis,+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death.">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li><li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function.">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li><li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation.">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+of+fixed+tissue:+a+review+from+a+microscopist's+perspective.">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers.">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart.">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).</li><li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls.">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li><li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery.">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li><li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles.">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li><li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue.">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808 (2015).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes.">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).</li><li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvessel+prediction+in+H&amp;E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks.">Microvessel prediction in H&amp;E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+whole-organ/body+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues.">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).</li></ol>

I detta arbete introducerades ett framgångsrikt tillvägagångssätt för att rensa, fläcka och avbilda ett helt mushjärta med hög upplösning. Först optimerades och utfördes ett vävnadstransformationsprotokoll (CLARITY), något modifierat för dess applicering på hjärtvävnaden. För att få en effektiv rekonstruktion i 3D av ett helt hjärta är det faktiskt viktigt att förhindra fenomenet ljusspridning. CLARITY-metoden gör det möjligt för oss att få ett mycket transparent intakt hjärta, men det kräver ...

Strukturell ombyggnad i samband med hjärtsjukdomar kan påverka elektrisk ledning och införa elektromekaniska dysfunktioner i organet 1,2. Nuvarande metoder som används för att förutsäga funktionella förändringar använder vanligtvis MR och DT-MRI för att erhålla en övergripande rekonstruktion av fibrosavsättning, vaskulärt träd och fiberfördelning av hjärtat, och de används för att modellera APP-vägar (Preferential Action Potential Propagation) över organet 3,4. Dessa strategier kan ge en vacker översikt över hjärtorganisationen. Deras rumsliga upplösning är dock otillräcklig för att undersöka effekterna av strukturell ombyggnad på hjärtfunktionen på cellnivå.
Att placera detta ramverk i en annan storleksordning, där enskilda celler kan spela individuella roller på handlingspotentialutbredning, är utmanande. Huvudbegränsningen är ineffektiviteten hos standardavbildningsmetoder för att utföra högupplöst avbildning (mikrometrisk upplösning) i massiva (centimeterstora) vävnader. Faktum är att avbildning av biologiska vävnader i 3D vid hög upplösning är mycket komplicerat på grund av vävnadsogenomskinlighet. Det vanligaste sättet att utföra 3D-rekonstruktioner i hela organ är att förbereda tunna sektioner. Exakt sektionering, montering och avbildning kräver dock betydande ansträngning och tid. Ett alternativt tillvägagångssätt som inte kräver att provet skärs är att generera en transparent vävnad. Under de senaste åren har flera metoder för att klargöra vävnader föreslagits 5,6,7,8. Utmaningen att producera massiva, transparenta och fluorescerande märkta vävnader har nyligen uppnåtts genom att utveckla sanna vävnadstransformationsmetoder (CLARITY9, SHIELD10). I synnerhet är CLARITY-metoden baserad på omvandlingen av en intakt vävnad till en nanoporös, hydrogelhybridiserad, lipidfri form som gör det möjligt att ge hög transparens genom selektivt avlägsnande av membranlipid-dubbelskikt. I synnerhet har denna metod visat sig framgångsrik även i hjärtpreparat11,12,13,14. Men eftersom hjärtat är för bräckligt för att vara lämpligt för en aktiv röjning, måste det rensas med det passiva tillvägagångssättet, vilket kräver lång tid för att ge fullständig transparens.
I kombination med avancerade bildtekniker som ljusarkmikroskopi har CLARITY potential att avbilda massiva 3D-hjärtvävnader med mikrometrisk upplösning. I ljusarkmikroskopi utförs belysningen av provet med ett tunt ljusark begränsat i detektionsmålets fokalplan. Fluorescensemissionen samlas upp längs en axel vinkelrätt mot belysningsplanet15. Detektionsarkitekturen liknar widefieldmikroskopi, vilket gör förvärvet mycket snabbare än laserskanningsmikroskop. Genom att flytta provet genom ljusarket kan man få en fullständig tomografi av stora prover, upp till centimeterstora prover. På grund av de inneboende egenskaperna hos den gaussiska strålen är det emellertid möjligt att erhålla ett mycket tunt (i storleksordningen några mikron) ljusark endast för en begränsad rumslig förlängning, vilket drastiskt begränsar synfältet (FoV). Nyligen har ett nytt excitationsschema introducerats för att övervinna denna begränsning och tillämpas för hjärnavbildning, vilket möjliggör 3d-rekonstruktioner med isotrop upplösning16.
I detta dokument presenteras en passiv clearingmetod som möjliggör en betydande minskning av den clearingtid som krävs enligt CLARITY-protokollet. Den metodologiska ramen som beskrivs här möjliggör rekonstruktion av ett helt mushjärta med mikrometrisk upplösning i en enda tomografisk skanning med en förvärvstid i storleksordningen minuter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-2&#8217; Thiodiethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>166782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>61-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AV-044 Initiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>AVP5874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca flash 4.0 v3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HC Image</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimating lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection arm</td>
			<td>Integrated optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>91863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extera&#236;nal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fold mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BBE1-E02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometric mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS211/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>4.6.1.19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser source</td>
			<td>Integrated Optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long-pass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KB25/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>CI-1316-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized traslator</td>
			<td>Physisk Instrument</td>
			<td>M-122.2DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TL2X-SAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycap AS</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>2606T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relay lens</td>
			<td>Qioptiq</td>
			<td>G063200000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACT508-200-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable lens</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>KNF Neuberger Inc</td>
			<td>N86KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WTB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesoscopic optical imaging of whole mouse heart

Både genetiska och icke-genetiska hjärtsjukdomar kan orsaka allvarliga ombyggnadsprocesser i hjärtat. Strukturell ombyggnad, såsom kollagenavsättning (fibros) och cellulär felinriktning, kan påverka elektrisk ledning, införa elektromekaniska dysfunktioner och så småningom leda till arytmi. Nuvarande prediktiva modeller av dessa funktionella förändringar är baserade på icke-integrerad och lågupplöst strukturell information. Att placera detta ramverk i en annan storleksordning är utmanande på grund av ineffektiviteten hos standardavbildningsmetoder för att utföra högupplöst avbildning i massiv vävnad. I detta arbete beskriver vi ett metodiskt ramverk som möjliggör avbildning av hela mushjärtan med mikrometrisk upplösning. För att uppnå detta mål har det krävts en teknisk insats där framsteg inom vävnadsomvandling och avbildningsmetoder har kombinerats. Först beskriver vi ett optimerat CLARITY-protokoll som kan omvandla ett intakt hjärta till en nanoporös, hydrogelhybridiserad, lipidfri form som möjliggör hög transparens och djup färgning. Därefter beskrivs ett fluorescensljusarkmikroskop som snabbt kan förvärva bilder av ett mesoskopiskt synfält (mm-skala) med mikronskalans upplösning. Efter mesoSPIM-projektet möjliggör det tänkta mikroskopet rekonstruktion av hela mushjärtat med mikrometrisk upplösning i en enda tomografisk skanning. Vi tror att denna metodologiska ram kommer att göra det möjligt att klargöra involveringen av cytoarkitekturens oordning i de elektriska dysfunktionerna och bana väg för en omfattande modell som tar hänsyn till både funktionella och strukturella data, vilket möjliggör en enhetlig undersökning av de strukturella orsakerna som leder till elektriska och mekaniska förändringar efter vävnadsombyggnad.

Den utvecklade passiva röjningsinställningen gör det möjligt att få ett rensat vuxet mushjärta (med en dimension av ordningen 10 mm x 6 mm x 6 mm) på cirka 3 månader. Alla komponenter i installationen är monterade som visas i figur 1. Den försumbara temperaturgradienten mellan varje röjningskammare (i storleksordningen 3 °C) gör det möjligt att hålla temperaturen inom ett lämpligt intervall över alla kammare.
<img ...

Watch this Scientific Journal Video about Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart at JoVE.com

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Vi rapporterar en metod för mesoskopisk rekonstruktion av hela mushjärtat genom att kombinera nya framsteg inom vävnadstransformation och färgning med utvecklingen av ett axiellt skannat ljusarkmikroskop.

Mesoskopisk optisk avbildning av hela mushjärtat

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Denna metod kombinerar förbättring av clearingprotokoll med ögonförmågan för optisk sektionering av Mesos PIM-tekniken så att vi kan utföra en meso-skopisk rekonstruktion med mikrometrisk upplösning. Det ger möjlighet att avbilda massiva hjärtvävnader eller hela mushjärtan hela lösningen i en enda skanning utan att förlora den ursprungliga tredimensionella vävnadsorganisationen. Efter att hjärtat har kannulerats av proximal aorta tvättad i tyrolösning och fixerad i 4% Paraformaldehyd i 0,01 molar PBS är det redo att starta clearingprotokollet.Tvätta hjärtat tre gånger i 0,01 molar PBS vid fyra grader Celsius i 15 minuter. Efter detta steg kan hjärtat lagras i PBS och 0,01% natriumazid vid fyra grader Celsius i flera månader. Inkubera hjärtat i 20 ml hydrogellösning i skakningstillstånd vid 15 varv / min i tre dagar vid fyra grader Celsius.Avgasa provet vid rumstemperatur med hjälp av en torktumlare, en vakuumpump och ett rörsystem som ansluter torken till både pumpbandet och kväveledningen. Placera provet i torktumlaren och öppna injektionsflaskan och håll locket på. Stäng torken och ta bort syret från röret genom att öppna kväveledningen.Slå på vakuumpumpen för att ta bort syret från torken i 10 minuter. Stäng av pumpen och öppna torkens ratt till kväveledningen. Öppna sedan kvävekranen.När trycket är lika med atmosfärstrycket öppnar du försiktigt torken och stänger snabbt injektionsflaskan. Håll hjärtat i den avgasade hydrogellösningen vid 37 grader Celsius i cirka tre timmar i vila. När hydrogelen är ordentligt polymeriserad och verkar helt gelatinös, ta försiktigt bort hjärtat från det och placera det i en clearinglösning i injektionsflaskan med clearinglösning.Byt clearinglösningen i injektionsflaskan en gång var tredje dag för att påskynda förtydligandet. När hjärtat verkar helt klargjort ta bort det från injektionsflaskan och tvätta det i 50 ml uppvärmd PBS i 24 timmar i skakande tillstånd. Tvätta igen i 50 ml av en X PBS T i 24 timmar i skakande tillstånd.Inkubera provet i 0,01 milligram per milliliter vetegroddar aglutinin Alexa golv 633 i tre milliliter av en X PBS T i skakningstillstånd vid 50 rpm vid rumstemperatur i sju dagar. Efter sju dagars inkubation, tvätta provet i 50 ml av en X PBS T vid rumstemperatur under skakning i 24 timmar. Inkubera provet i 4% PFA i 15 minuter och tvätta det sedan tre gånger i 0,01 molar PBS i fem minuter vardera.Inkubera hjärtat successivt i 20 och 47% TDE i 0,01 molar PBS i åtta timmar vardera. Och sedan slutligen vid 68% TDE i 0,01 molar PBS för att ge det erforderliga brytningsindexet på 1,46. Fyll försiktigt cirka 80% av den externa kvartsquivet med brytningsindexmediet.Fyll den inre kvartsquivet med samma brytningsindexmedium. Sänk ner provet inuti den inre kvavten. Flytta försiktigt provet till botten av kvetten med hjälp av tunn pincett och ordna hjärtat med dess längsgående axel parallellt med kvettens huvudaxel för att minimera excitationsljusets väg över vävnaden under skanningen.Fäst försiktigt den skräddarsydda kontakten ovanför den inre täcket med två skruvar. Montera provet på mikroskopsteget med magneter. Översätt det vertikala provsteget manuellt för att fördjupa det interna kvavet i det externa.Slå på excitationsljuskällan med en våglängd på 638 nanometer och ställ in den på låg effekt i storleksordningen tre milliwatt. Flytta provet med hjälp av den motoriserade översättaren för att belysa en inre platta i vävnaden. Slå på HC-bildkameraprogramvaran och ställ in kamerautlösaren på externt kantutlösarljusarkläge för att driva kamerans förvärvsutlösare av den anpassade programvaran som styr hela installationen.Aktivera automatisk spara i kameraprogramvaran och ställ in utdatamappen där bilderna måste sparas. Justera provpositionen manuellt i X Y-planet med de linjära översättarna för att flytta provet till mitten av kamerasensorns synfält. Flytta provet längs Z-axeln med hjälp av den linjära motoriserade översättaren för att identifiera hjärtgränser för tomografisk rekonstruktion.Öka lasereffekten till cirka 20 milliwatt innan du börjar för bildsessionen. Starta det tomografiska förvärvet genom att klicka på startknappen i bildprogramvarans inspelningspanel och börja samtidigt flytta provet längs Z-axeln med konstant hastighet på sex mikrometer per sekund med hjälp av den motoriserade översättaren. Kombinationen av klarhetsmetoden med TDE som brytningsindexmedium ändrar inte provets slutliga volym signifikant och leder inte heller till en isotrop deformation av provet.Excitationsoptiken producerade ett ljusark med ett minimalt avfall på cirka sex mikrometer som divergerade upp till 175 mikrometer vid kanten av synfältet. Synkroniseringen av kamerans rullande slutare med den axiella skanningen av ljusarkavfallet säkerställde att utsläppssignalen endast samlades in i provdelen upphetsad med avfallet från ljusarket vilket resulterade i en genomsnittlig F W H M på cirka 6,7 mikrometer längs hela synfältet. Mikroskopets Z-punktspridningsfunktion uppskattades också genom en tomografisk rekonstruktion av den fluorescerande nanosfären och en F W H M på 6,4 mikrometer uppskattades av passformen.Systemets potential att lösa enstaka cellmembran i tre dimensioner med ett tillräckligt signal-brusförhållande i hela organet bekräftades också. Avgasningsförfarandet är det mest kritiska steget i protokollet. Om det inte utförs korrekt kan vävnaden stöta på skador som indikerar under inkubationen i en rengöringslösning.Det presenterade protokollet kan kombineras med ett multifärgningsprotokoll för att uppnå en hel organrekonstruktion som integrerar olika biologiska strukturer och kan tillämpas för att studera patologiska modeller.

mesoscopic-optical-imaging-of-whole-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Korrekt vård och rengöring av mikroskopet

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Viktigaste komponenterna i ljusmikroskop

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Faskontrast och differentierad interferenskontrast (DIC) Mikroskopi

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

Född Normalisering för fluorescens Optical Projection Tomography för hela hjärtat Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Semi-automatisk optisk Heartbeat Analys av små hjärtan

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoskopisk Fluorescens Tomografi för In-vivo Imaging för att utveckla Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo Imaging och terapeutiska behandlingar i en Orthotopic musmodell av äggstockscancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Metod för embryonala Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Optisk Kartläggning av Intra-sarkoplasmatiska retiklet Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Och transmembranpotentialen i Langendorff-perfusion Kanin hjärta

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Upprättande och Längs avbildning av hjärtfunktionen In Vivo Använda optisk koherens mikroskopi (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...