Name: mesoscopic optical imaging of whole mouse heart
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart at JoVE.com

Bu proje, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programından 952166 No'lu hibe anlaşması (REPAIR), FISR programı kapsamında MUR, proje FISR2019_00320 ve Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE projesi kapsamında fon almıştır.

Tüm hayvan elleçleme ve prosedürleri, bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin Avrupa Parlamentosu'nun 2010/63/EU sayılı Direktifindeki kılavuzlara uygun olarak ve İtalya Sağlık Bakanlığı'nın ilke ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Deneysel protokol İtalya Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanmıştır (protokol numarası 647/2015-PR). Tüm hayvanlar ENVIGO, İtalya tarafından sağlandı. Bu deneyler için 6 aylık 5 erkek C57BL/6J fare kullanıldı...

<ol>
	<li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li><li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy:+genetic+basis,+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death.">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li><li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function.">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li><li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation.">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+of+fixed+tissue:+a+review+from+a+microscopist's+perspective.">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers.">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart.">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).</li><li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls.">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li><li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery.">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li><li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles.">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li><li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue.">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808 (2015).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes.">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).</li><li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvessel+prediction+in+H&amp;E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks.">Microvessel prediction in H&amp;E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+whole-organ/body+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues.">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).</li></ol>

Bu çalışmada, bütün bir fare kalbini yüksek çözünürlükte temizlemek, lekelemek ve görüntülemek için başarılı bir yaklaşım tanıtıldı. İlk olarak, bir doku dönüşüm protokolü (CLARITY) optimize edildi ve uygulandı, kalp dokusuna uygulanması için biraz modifiye edildi. Gerçekten de, bütün bir kalbin 3B'sinde etkili bir rekonstrüksiyon elde etmek için, ışık saçılması fenomenini önlemek esastır. CLARITY metodolojisi, oldukça şeffaf ve sağlam bir kalp elde etmemizi sağlar, ancak ...

Kalp hastalıkları ile ilişkili yapısal yeniden yapılanma elektrik iletimini etkileyebilir ve organın elektromekanik işlev bozukluklarına neden olabilir 1,2. Fonksiyonel değişiklikleri tahmin etmek için kullanılan güncel yaklaşımlar, fibroz birikiminin, vasküler ağacın ve kalbin lif dağılımının genel bir rekonstrüksiyonunu elde etmek için MRG ve DT-MRG'yi yaygın olarak kullanır ve organ boyunca tercihli eylem potansiyeli yayılım (APP) yollarını modellemek için kullanılır 3,4. Bu stratejiler kalp organizasyonuna güzel bir genel bakış sağlayabilir. Bununla birlikte, uzamsal çözünürlükleri, yapısal yeniden yapılanmanın hücresel düzeyde kardiyak fonksiyon üzerindeki etkisini araştırmak için yetersizdir.
Bu çerçeveyi, tek hücrelerin eylem potansiyeli yayılımı üzerinde bireysel roller oynayabileceği farklı bir büyüklük sırasına yerleştirmek zordur. Temel sınırlama, masif (santimetre boyutlu) dokularda yüksek çözünürlüklü görüntüleme (mikrometrik çözünürlük) gerçekleştirmek için standart görüntüleme yöntemlerinin verimsizliğidir. Aslında, biyolojik dokuları 3D olarak yüksek çözünürlükte görüntülemek, doku opaklığı nedeniyle çok karmaşıktır. Tüm organlarda 3D rekonstrüksiyonları gerçekleştirmek için en yaygın yaklaşım, ince kesitler hazırlamaktır. Bununla birlikte, hassas kesitleme, montaj ve görüntüleme önemli çaba ve zaman gerektirir. Numunenin kesilmesini gerektirmeyen alternatif bir yaklaşım, şeffaf bir doku oluşturmaktır. Son yıllarda, dokuları berraklaştırmak için çeşitli metodolojiler önerilmiştir 5,6,7,8. Masif, şeffaf ve floresan olarak etiketlenmiş dokular üretme zorluğu, son zamanlarda gerçek doku dönüşüm yaklaşımları geliştirilerek elde edilmiştir (CLARITY9, SHIELD10). Özellikle, CLARITY yöntemi, bozulmamış bir dokunun, membran lipit çift katmanlarının seçici olarak çıkarılmasıyla yüksek şeffaflık kazandırmayı sağlayan nanogözenekli, hidrojel-hibridize, lipit içermeyen bir forma dönüştürülmesine dayanır. Özellikle, bu yöntem kardiyak preparatta da başarılı bulunmuştur11,12,13,14. Bununla birlikte, kalp aktif bir temizlik için uygun olamayacak kadar kırılgan olduğundan, tam şeffaflık sağlamak için uzun zaman gerektiren pasif yaklaşım kullanılarak temizlenmelidir.
Işık tabakası mikroskobu gibi gelişmiş görüntüleme teknikleriyle birlikte, CLARITY 3D masif kalp dokularını mikrometrik çözünürlükte görüntüleme potansiyeline sahiptir. Işık tabakası mikroskobunda, numunenin aydınlatılması, algılama hedefinin odak düzleminde sınırlı ince bir ışık tabakası ile gerçekleştirilir. Floresan emisyonu, aydınlatma düzlemi15'e dik bir eksen boyunca toplanır. Algılama mimarisi geniş alan mikroskobuna benzer ve bu da edinimi lazer tarama mikroskoplarından çok daha hızlı hale getirir. Numunenin ışık tabakası boyunca hareket ettirilmesi, santimetre büyüklüğündeki numunelere kadar büyük örneklerin tam bir tomografisinin elde edilmesini sağlar. Bununla birlikte, Gauss ışınının içsel özellikleri nedeniyle, yalnızca sınırlı bir uzamsal uzantı için çok ince (birkaç mikron mertebesinde) bir ışık tabakası elde etmek mümkündür, böylece görüş alanını (FoV) büyük ölçüde sınırlar. Son zamanlarda, bu sınırlamanın üstesinden gelmek için yeni bir uyarma şeması tanıtıldı ve beyin görüntüleme için uygulandı ve izotropik çözünürlük16 ile 3d rekonstrüksiyonlara izin verdi.
Bu yazıda, CLARITY protokolünün ihtiyaç duyduğu takas zamanlamasının önemli ölçüde azaltılmasını sağlayan pasif bir takas yaklaşımı sunulmuştur. Burada açıklanan metodolojik çerçeve, tüm fare kalbinin mikrometrik çözünürlükle tek bir tomografik taramada dakika sırasına göre bir edinme süresiyle yeniden yapılandırılmasına izin verir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-2&#8217; Thiodiethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>166782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>61-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AV-044 Initiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>AVP5874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca flash 4.0 v3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HC Image</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimating lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection arm</td>
			<td>Integrated optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>91863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extera&#236;nal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fold mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BBE1-E02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometric mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS211/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>4.6.1.19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal quartz cuvette</td>
			<td>Portmann Instruments</td>
			<td>UQ-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser source</td>
			<td>Integrated Optics</td>
			<td>0638L-15A-NI-PT-NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long-pass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KB25/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>CI-1316-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized traslator</td>
			<td>Physisk Instrument</td>
			<td>M-122.2DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TL2X-SAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycap AS</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>2606T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relay lens</td>
			<td>Qioptiq</td>
			<td>G063200000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACT508-200-A-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable lens</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>KNF Neuberger Inc</td>
			<td>N86KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WTB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesoscopic optical imaging of whole mouse heart

Hem genetik hem de genetik olmayan kalp hastalıkları kalpte ciddi yeniden şekillenme süreçlerine neden olabilir. Kollajen birikimi (fibrozis) ve hücresel yanlış hizalama gibi yapısal yeniden modelleme, elektriksel iletimi etkileyebilir, elektromekanik işlev bozukluklarına neden olabilir ve sonunda aritmilere yol açabilir. Bu fonksiyonel değişikliklerin mevcut öngörücü modelleri, entegre olmayan ve düşük çözünürlüklü yapısal bilgilere dayanmaktadır. Bu çerçeveyi farklı bir büyüklük sırasına yerleştirmek, standart görüntüleme yöntemlerinin masif dokuda yüksek çözünürlüklü görüntüleme gerçekleştirmedeki etkisizliği nedeniyle zordur. Bu çalışmada, tüm fare kalplerinin mikrometrik çözünürlükle görüntülenmesini sağlayan metodolojik bir çerçeve tanımladık. Bu hedefe ulaşmak, doku transformasyonu ve görüntüleme yöntemlerindeki gelişmelerin birleştirildiği teknolojik bir çaba gerektirmiştir. İlk olarak, sağlam bir kalbi yüksek şeffaflık ve derin lekelenmeye izin veren nanogözenekli, hidrojel hibridize, lipit içermeyen bir forma dönüştürebilen optimize edilmiş bir CLARITY protokolünü açıklıyoruz. Daha sonra, mikron ölçeğinde çözünürlükte mezoskopik bir görüş alanının (mm ölçeğinde) görüntülerini hızlı bir şekilde elde edebilen bir floresan ışık tabakası mikroskobu açıklanmaktadır. MezoSPIM projesini takiben, tasarlanan mikroskop, tek bir tomografik taramada tüm fare kalbinin mikrometrik çözünürlükle yeniden yapılandırılmasına izin verir. Bu metodolojik çerçevenin, sitomimari kargaşanın elektriksel işlev bozukluklarına katılımının açıklığa kavuşturulmasına izin vereceğine ve hem işlevsel hem de yapısal verileri dikkate alan kapsamlı bir modelin önünü açacağına, böylece doku yeniden şekillenmesinden sonra elektriksel ve mekanik değişikliklere yol açan yapısal nedenlerin birleşik bir şekilde araştırılmasını sağlayacağına inanıyoruz.

Geliştirilen pasif temizleme kurulumu, yaklaşık 3 ay içinde temizlenmiş bir yetişkin fare kalbi (10 mm x 6 mm x 6 mm mertebesinde bir boyutta) elde etmeyi sağlar. Kurulumun tüm bileşenleri Şekil 1'de gösterildiği gibi monte edilmiştir. Her bir temizleme odası arasındaki ihmal edilebilir sıcaklık gradyanı (3 ° C mertebesinde), sıcaklığın tüm odalarda uygun bir aralıkta tutulmasını sağlar.
<img alt="Figure...

Watch this Scientific Journal Video about Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart at JoVE.com

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Doku transformasyonu ve boyamadaki yeni gelişmeleri eksenel olarak taranmış bir ışık tabakası mikroskobunun geliştirilmesiyle birleştirerek tüm fare kalbinin mezoskopik rekonstrüksiyonu için bir yöntem sunuyoruz.

Tüm Fare Kalbinin Mezoskopik Optik Görüntülenmesi

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Bu metodoloji, temizleme protokolünün iyileştirilmesini Mesos PIM teknolojisinin optik kesitleme göz kabiliyeti ile birleştirerek mikrometrik çözünürlükte mezo skopik rekonstrüksiyonlar gerçekleştirmemizi sağlar. Orijinal üç boyutlu doku organizasyonunu kaybetmeden masif kalp dokularını veya tüm fare kalplerini tek bir taramada tüm çözeltiyi görüntüleme imkanı sağlar. Kalp, tiro çözeltisinde yıkanmış proksimal aort ile kanüle edildikten ve 0.01 molar PBS'de% 4 Paraform aldehit ile sabitlendikten sonra, temizleme protokolüne başlamaya hazırdır.Kalbi 15 dakika boyunca dört santigrat derecede 0.01 molar PBS'de üç kez yıkayın. Bu adımdan sonra, kalp birkaç ay boyunca PBS ve% 0.01 sodyum azidde dört santigrat derecede saklanabilir. Kalbi 20 mililitre hidrojel çözeltisi içinde, dört santigrat derecede üç gün boyunca 15 RPM'de sallanma durumunda inkübe edin.Bir kurutucu, vakum pompası ve kurutucuyu hem pompa bandına hem de azot boru hattına bağlayan bir tüp sistemi kullanarak numuneyi oda sıcaklığında gazdan arındırın. Numuneyi kurutucuya yerleştirin ve kapağı üzerinde tutarak şişeyi açın. Kurutucuyu kapatın ve azot boru hattını açarak oksijeni tüpten çıkarın.Oksijeni kurutucudan 10 dakika boyunca çıkarmak için vakum pompasını açın. Pompayı kapatın ve kurutucunun düğmesini azot boru hattına açın. Ardından azot musluğunu açın.Basınç atmosferik basınca eşit olduğunda, kurutucuyu dikkatlice açın ve şişeyi hızla kapatın. Kalbi gazdan arındırılmış hidrojel çözeltisinde 37 santigrat derecede istirahatte yaklaşık üç saat boyunca tutun. Hidrojel uygun şekilde polimerize edildiğinde ve tamamen jelatinimsi göründüğünde, kalbi dikkatlice çıkarın ve temizleme çözeltisi ile şişedeki bir temizleme çözeltisine yerleştirin.Arıtma prosedürünü hızlandırmak için şişedeki temizleme solüsyonunu her üç günde bir değiştirin. Kalp tamamen berraklaştıktan sonra, şişeden çıkarın ve sallanma durumunda 24 saat boyunca 50 mililitre ısıtılmış PBS'de yıkayın. Sarsıntı durumunda 24 saat boyunca 50 mililitre bir X PBS T içinde tekrar yıkayın.Numuneyi mililitre başına 0.01 miligram buğday tohumu aglutinin Alexa kat 633'te bir X PBS T'nin üç mililitresinde yedi gün boyunca oda sıcaklığında 50 RPM'de sallanma durumunda inkübe edin. Yedi günlük inkübasyondan sonra, numuneyi oda sıcaklığında 50 mililitre X PBS T içinde 24 saat çalkalayarak yıkayın. Numuneyi 15 dakika boyunca% 4 PFA'da inkübe edin ve ardından her biri beş dakika boyunca 0.01 molar PBS'de üç kez yıkayın.Kalbi her biri sekiz saat boyunca 0.01 molar PBS'de 20 ve% 47 TDE'de art arda inkübe edin. Ve son olarak, gerekli kırılma indisi 1.46'yı sağlamak için 0.01 molar PBS'de% 68 TDE'de. Dış kuvars kuvetin yaklaşık% 80'ini kırılma indisi ortamı ile nazikçe doldurun.İç kuvars kuvetini aynı kırılma indisi ortamıyla doldurun. Numuneyi iç quvet içine batırın. İnce cımbız kullanarak numuneyi yavaşça quvet'in dibine doğru hareket ettirin ve tarama sırasında doku boyunca uyarma ışığı yolunu en aza indirmek için kalbi uzunlamasına ekseni quvet'in ana eksenine paralel olarak düzenleyin.Özel fişi iç quvet'in üzerine iki vida ile dikkatlice sabitleyin. Mıknatısları kullanarak numuneyi mikroskop aşamasına monte edin. İç quvet'i harici olana batırmak için dikey numune aşamasını manuel olarak çevirin.638 nanometre dalga boyuna sahip uyarma ışık kaynağını açın ve üç miliwatt mertebesinde düşük güce ayarlayın. Dokunun iç plakasını aydınlatmak için motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi hareket ettirin. HC görüntü canlı kamera yazılımını açın ve tüm kurulumu kontrol eden özel yazılım tarafından kameranın alma tetikleyicisini çalıştırmak için kamera tetikleyicisini harici kenar tetik ışığı sayfası modunda ayarlayın.Kamera yazılımında otomatik kaydetmeyi etkinleştirin ve görüntülerin kaydedilmesi gereken çıktı klasörünü ayarlayın. Numuneyi kamera sensörünün görüş alanının merkezine taşımak için doğrusal çevirmenlerle X Y düzlemindeki numune konumunu manuel olarak ayarlayın. Tomografik rekonstrüksiyon için kalp sınırlarını tanımlamak üzere doğrusal motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi Z ekseni boyunca hareket ettirin.Görüntüleme seansına başlamadan önce lazer gücünü yaklaşık 20 miliwatt'a yükseltin. Görüntüleme yazılımının yakalama panelindeki başlat düğmesine tıklayarak tomografi alımını başlatın ve aynı zamanda motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi saniyede altı mikrometre sabit hızda Z ekseni boyunca hareket ettirmeye başlayın. Netlik metodolojisinin TDE ile kırılma indisi ortamı olarak kombinasyonu, numunenin nihai hacmini önemli ölçüde değiştirmez veya numunenin izotropik deformasyonuna yol açmaz.Uyarma optikleri, görüş alanının kenarında 175 mikrometreye kadar ayrılan yaklaşık altı mikrometrelik minimum atık içeren bir ışık tabakası üretti. Kamera yuvarlanan deklanşörün ışık tabakası atıklarının eksenel taraması ile senkronizasyonu, emisyon sinyalinin yalnızca ışık tabakasının israfıyla uyarılan numune kısmında toplanmasını sağladı ve tüm görüş alanı boyunca yaklaşık 6.7 mikrometrelik ortalama F W H M ile sonuçlandı. Mikroskobun Z noktası yayılma fonksiyonu da floresan nanosferin tomografik bir rekonstrüksiyonu ile tahmin edildi ve 6.4 mikrometrelik bir F W H M fit tarafından tahmin edildi.Sistemin tek hücre zarlarını üç boyutta, tüm organda yeterli sinyal-gürültü oranıyla çözme potansiyeli de doğrulandı. Gazdan arındırma prosedürü, protokolün en kritik adımıdır. Düzgün bir şekilde gerçekleştirilmezse, doku bir temizleme çözeltisinde inkübasyon sırasında belirtilen hasarlarla karşılaşabilir.Sunulan protokol, farklı biyolojik yapıları entegre eden bütün bir organ rekonstrüksiyonunu elde etmek için çoklu boyama protokolü ile birleştirilebilir ve patolojik modelleri incelemek için uygulanabilir.

mesoscopic-optical-imaging-of-whole-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Mikroskop Uygun Bakım ve Temizlik

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Biyoloji

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Işık Mikroskobu Binbaşı Bileşenleri

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Faz Kontrast ve Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Mikroskopi

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

Tüm Kalp Görüntüleme Floresan Optik Projeksiyon Tomografi tarihi Normalizasyon

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Küçük Kalpler Yarı-otomatik Optik Heartbeat Analizi

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

Yeni Bir<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Fare Kalp için&gt; Kültür Yöntemi

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Hazırlama ve Optik Koherens Mikroskobu Kullanımı In Vivo Kalp Fonksiyonu Boyuna Görüntüleme (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...