Name: generation of na&#239;ve blastoderm explants from zebrafish embryos
Uploaded: 2021-07-30T14:00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of NaÃƒÂ¯ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل NICHD R00HD091386 إلى MLKW وNIEHS T32ES027801 إلى AAE.

1 إعداد الكواشف والإمدادات
<ol><li>إعداد الكاشف<ol>
<li>إعداد 500 مل من حل 3x دانيو (الحل 1، الجدول 1).</li>
		<li>إعداد 1 لتر من ماء البيض (الحل 2، الجدول 1).</li>
		<li>إعداد محلول 1.2٪ من الآغروز في ماء البيض. تذوب agarose تماما في الميكروويف، ومن ثم تبرد إلى 55 درجة مئوية في حمام مائي.</li>
		<li>إعداد وسائط 4 مل (الحل 3، الجدول 1،معدلة قليلا من19،21)لكل حالة تجريبية. ملاحظة: تذكر أن حساب بئر واحد على الأقل من explants من الأجنة غير المحقونة (أو التحكم حقن) عند حساب حجم المطلوبة.<ol>
<li>تعقيم مساحة العمل مع الإيثانول 70٪.</li>
			<li>إزالة وسائط ثقافة الخلية من 4 درجة مئوية ورذاذ / مسح مع الإيثانول 70٪.</li>
			<li>جعل وسائل الإعلام explant ومكان في حاضنة 28.5 درجة مئوية لتدفئة أثناء حقن الأجنة. ملاحظة: قم بتضمين الأجنة الشقيقة المطابقة للعمر والم سليمة دائما لأغراض التدريج. Dechorionate هذه الأجنة وزراعة لهم على لوحات المغلفة agarose في حل 0.3x دانيو (الحل 4، الجدول 1).</li>
		</ol>
</li>
		<li>إزالة الاقتباسات البروناز (1 مل في 20 ملغم / مل) من -20 درجة مئوية والسماح لذوبان الجليد. تذوب واحدة 1 مل aliquot لكل ثلاثة شروط تجريبية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد لوحات الآغاروز<ol>
<li>جعل لوحات الحقن.<ol>
<li>ملء 100 ملم × 15 ملم طبق بيتري البلاستيك في منتصف الطريق مع agarose المنصهر في ماء البيض.</li>
			<li>ضع قالب الحقن برفق فوق الآغاروز المنصهر بزاوية 45 درجة وقم بخفضه تدريجيا إلى الآغاروز ، مما يضمن عدم محاصرة أي فقاعات تحته. دعه يبرد تماما.</li>
			<li>إزالة القالب. استخدم الطبق فورا أو احفظه لاحقا بإضافة 2 مل من ماء البيض، ولف اللوحة وتخزينها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. قم بتدفئة الطبق لمدة 15-30 دقيقة في حاضنة 28.5 درجة مئوية قبل الحقن.</li>
		</ol>
</li>
		<li>جعل لوحات القطع explant.<ol>
<li>أضف 3 مل من الآغاروز المنصهر بنسبة 1.2٪ في ماء البيض إلى طبق بيتري عيار 60 مم × 15 ملم، مما يضمن أن الجزء السفلي بأكمله من البئر مغلف. دعه يبرد تماما.</li>
		</ol>
</li>
		<li>معطف لوحات الثقافة مع agarose.<ol>
<li>لكل حالة تجريبية، والاستغناء عن 1 مل من 1.2٪ agarose المنصهر في ماء البيض في بئر واحد من لوحة 6-جيدا، وضمان أن الجزء السفلي بأكمله من البئر هو المغلفة. دعه يبرد تماما.</li>
		</ol>
</li>
		<li>لصنع النباتات الشيمية، قم بإنشاء طبق قطع شامل مع آبار صغيرة عن طريق إضافة اثني عشر حبة زجاجية عيار 1 ملم إلى الآجروز المنصهر في طبق بيتري مقاس 60 مم × 15 ملم. إزالة الخرز مع ملقط مرة واحدة يبرد agarose تماما.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 حقن الأجنة مع الحمض النووي الريبي
<ol><li>ارتداء القفازات، وإزالة aliquot من ndr2 ميرنا الاصطناعية من التخزين في -80 درجة مئوية ووضعه على الفور على الجليد.</li>
	<li>إعداد إبرة الحقن.<ol>
<li>ملء إبرة الشعرية الزجاج سحبت مع الجيش الملكي النيبالي. ضع الإبرة المملوءة في متلاعب صغير وكسر طرف الإبرة بالملقط.</li>
		<li>معايرة حجم الحقن باستخدام ميكرومتر المرحلة مع قطرة من الزيت المعدني، وضبط وقت الحقن والضغط على حاقن هوائي لتحقيق بولوس من الحجم المطلوب. يبلغ حجم البوليوس الذي يبلغ قطره 120 ميكرومترا 1 nL. ملاحظة: يعتمد الحجم المطلوب من البولوس على تركيز الحمض النووي الريبي والجرعة المطلوبة لكل جنين. على سبيل المثال، إذا تم تسعير الحمض النووي الريبي في 10 نانوغرام / ميكرولتر، حقن 1 نانولتر لتحقيق كمية نهائية من 10 pg.<ol>
<li>إبقاء طرف إبرة الجيش الملكي النيبالي مغمورة في الزيت حتى تصبح جاهزة للحقن.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحميل الأجنة وحقن.<ol>
<li>سحب المقسمات في خزانات التربية، والسماح للأسماك لتفرخ لمدة 10-15 دقيقة، وجمع الأجنة باستخدام مصفاة الشاي.</li>
		<li>قم بتحميل الأجنة في لوحة الحقن باستخدام ماصة باستور ومضخة ماصة، ثم استخدم إصبعا قفازا للضغط على البيض في الأحواض برفق.</li>
		<li>حقن 10 pg ndr2 الجيش الملكي النيبالي في صفار الأجنة وحيدة الخلية حتى يتم الوصول إلى العدد المطلوب من الأجنة أو حتى تبدأ الأجنة في الانقسام. ملاحظة: لا تحقن بعد مرحلة الخلية الواحدة لضمان التوزيع حتى للجيش الملكي النيبالي في جميع أنحاء الجنين.</li>
		<li>اغسل الأجنة من لوحة الحقن في طبق بيتري 100 مم × 15 ملم مع تيار لطيف من ماء البيض من زجاجة ضغط. ملاحظة: احتفظ دائما بمجموعة من الأشقاء غير المترافقين مع العمر وغير المنصفين كعناصر تحكم.</li>
		<li>ضع الأجنة في حاضنة 28.5 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة 128 خلية. إزالة البويضات غير المخصبة والأجنة الميتة من الطبق.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3 إزالة الكورونات الأجنة
<ol><li>بمجرد وصول الأجنة إلى مرحلة 128 خلية ، ضعها في أطباق بيتري الزجاجية المسماة وديكنت أكبر قدر ممكن من ماء البيض منها.</li>
	<li>تسمية الزجاج بلورة الأطباق مع شريط المختبر (المقابلة لأسماء طبق صغير) وملء 2/3 من الطريق مع ماء البيض. ضع هذه الأطباق بجانب مجهر التشريح لسهولة الوصول السريع.</li>
	<li>إضافة 1 مل من مخزون pronase (20 ملغم / مل، إذابة على الجليد) إلى 15 مل من محلول دانيو 3x في أنبوب مخروطي 50 مل. ملاحظة: هذا المبلغ يكفي لثلاثة شروط تجريبية. زيادة حجم pronase والحل 3x Danieau لظروف إضافية explant. تنبيه: Pronase هو مهيجة; وبالتالي ارتداء قفازات عند التعامل معها.</li>
	<li>إضافة ما لا يقل عن 5 مل من محلول البروناز لكل طبق بيتري الزجاج التي تحتوي على الأجنة.</li>
	<li>تهييج الأطباق الزجاجية في حركة دائرية ، ورصد التقدم المحرز في dechorionation باستمرار تحت المجهر تشريح.</li>
	<li>بمجرد أن تبدأ الكوريونات في التجاعيد ويخرج 1-2 جنين من المشيمات الخاصة بهم ، قم بغمر طبق بيتري الزجاجي الذي يحتوي على البروناز والأجنة في طبق تبلور الزجاج المقابل الذي يحتوي على ماء البيض.</li>
	<li>غسل الأجنة dechorionated.<ol>
<li>غسل الأجنة ثلاث مرات مع ماء البيض عن طريق إضافة بلطف ومن ثم decanting ماء البيض من الطبق.</li>
		<li>غسل الثالث والأخير هو مع حل 0.3x دانيو. ملاحظة: إذا كانت الأجنة لا تزال لديها المشيمات بعد الغسيل، ماصة بلطف الأجنة حتى تتم إزالة المشيمات أو السماح لهم الجلوس في الغسيل (ماء البيض أو محلول دانيو 0.3x) لمدة دقيقة أو دقيقتين والتحريض بلطف مع حركات دائرية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>قم بتغطية الأجنة المتشحات بغطاء طبق بيتري وإعادتها إلى الحاضنة (28.5 درجة مئوية) حتى تصل إلى مرحلة 256 خلية.</li>
</ol>4 قطع النباتات السابقة
<ol><li>املأ طبق بيتري المغلف بالأغاروز مقاس 60 مم × 15 ملم بمحلول دانيو ثلاثي الأبعاد.</li>
	<li>بمجرد أن تكون الأجنة في مرحلة 256 خلية ، قم بنقلها إلى اللوحة المغلفة بالأغاروز التي تحتوي على محلول 3x Danieau ، واصطفها على طول مركز الطبق.</li>
	<li>قطع explants باستخدام ملقط (الشكل 1).<ol>
<li>استخدام زوج واحد من ملقط، عقدت مغلقة، لتحقيق الاستقرار في الجنين واستخدام الآخر لقطع من خلال blastoderm في ما يقرب من نصف ارتفاعه (من الهامش إلى القطب الحيواني) (الشكل 1A).</li>
		<li>لقطع، والضغط بلطف على خلايا blastoderm مع زوج واحد من ملقط. ثم، واتخاذ ملقط استقرار وتشغيلها على طول ملقط أخرى لشريحة في منتصف الطريق تقريبا عبر blastoderm(الشكل 1B).</li>
		<li>تدوير الجنين ، ووضع ملقط في قطع القائمة ، ومن ثم قطع blastoderm المتبقية متعامدة إلى قطع الأولى(الشكل 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>الحفاظ على explants في حل 3x دانيو لمدة 5 دقائق على الأقل للشفاء، ثم نقلها إلى بئر لوحة 6-جيدا المغلفة مع agarose ومليئة 4 مل من وسائل الإعلام explant. ملاحظة: قص explants من الأشقاء غير مقننة (أو التحكم حقن) كعناصر تحكم سالبة. إذا تم تنفيذ explants بشكل صحيح، فإن هذه explants لا تمتد ولا تعبر عن علامات endoderm، mesoderm، أو neuroectoderm.</li>
	<li>ضع لوحات الثقافة الشاملة في حاضنة 28.5 درجة مئوية حتى يتم الوصول إلى النقطة الزمنية / المرحلة المطلوبة (المحددة من الأشقاء السليمين). ملاحظة: إذا كان علاج explants مع مركب، مثل مثبط جزيء صغير، يمكن إضافة التركيز المطلوب مباشرة إلى وسائل الإعلام explant داخل الآبار في النقاط الزمنية المطلوبة. تذكر أن تشمل حجم agarose عند حساب التركيزات. (مثال: 1 مل agarose + 4 مل explant وسائل الإعلام = 5 مل الحجم الإجمالي لكل بئر).</li>
</ol>5 إعداد النباتات الشيمية
<ol><li>بدلا من لوحة مغلفة agarose العادية، وقطع explants chimeric في طبق مع agarose مصبوب في اثني عشر آبار صغيرة ضحلة باستخدام حبات الزجاج 1 ملم (القسم 1.2.4). ملء هذه اللوحة مع حل دانيو 3x. ملاحظة: يتم إنشاء explants Chimeric من خلايا blastoderm من اثنين من الأجنة من أنماط جينية مختلفة أو الشروط. تأكد من أن هذه الشروط يمكن تمييزها عن بعضها البعض من خلال التعبير عن علامات الفلورسنت المعدلة وراثيا أو حقنها.<ol>
<li>إعداد عن طريق إضافة اثني عشر أجنة من النمط الجيني واحد / شرط إلى الجانب الأيسر من لوحة واثني عشر أجنة من النمط الجيني الأخرى / شرط إلى الجانب الأيمن من لوحة.</li>
		<li>نقل جنين واحد من كل حالة إلى وسط اللوحة، بالقرب من أحد الآبار الاثنتي عشرة.</li>
		<li>باستخدام ملقط، قطع explant من كل جنين كما هو موضح لنباتات الجنين واحد (الخطوة 4.3).</li>
		<li>اضغط بسرعة على حواف قطع من اثنين من explants معا داخل البئر الضحلة باستخدام ملقط للسماح للنصفين للشفاء معا في explant واحد.</li>
		<li>استمر مع الآبار الأحد عشر المتبقية داخل اللوحة. مرة واحدة يتم شفاء explants، ونقلها إلى بئر لوحة 6-جيدا المغلفة مع agarose ومليئة 4 مل من وسائل الإعلام explant. كرر حتى يتم تحقيق العدد المطلوب من النباتات السابقة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6 ثقافة و/أو صورة النباتات الثابتة
<ol><li>زراعة النباتات في حاضنة 28.5 درجة مئوية حتى الأجنة الشقيقة سليمة تصل إلى المرحلة المطلوبة.</li>
	<li>يمكن تركيب النباتات المباشرة للتصوير المستمر بفواصل زمنية ، أو تصويرها بشكل دوري طوال فترة الثقافة ، أو تصويرها مباشرة عند نقطة النهاية التجريبية.</li>
	<li>إصلاح explants إذا رغبت في ذلك. بمجرد وصول النباتات إلى نقطة النهاية المطلوبة ، لاحظ مرحلة الأشقاء الجنين سليمة ووضع explants في قارورة التلألؤ الزجاج مع 1 مل من 4 ٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني. إصلاح بين عشية وضحاها على شاكر في 4 °C. تنبيه: البارافورمالديهايد سام. ارتداء قفازات عند التعامل مع هذه المادة الكيميائية والتخلص منها عن طريق الأساليب المعتمدة من قبل كل مؤسسة.<ol>
<li>بعد التثبيت، شطف explants ست مرات، 15 دقيقة لكل منهما مع برنامج تلفزيوني + 0.1٪ توين-20، والجفاف تدريجيا في الميثانول. تخزين explants في -20 درجة مئوية لتحليلها في وقت لاحق من قبل كامل جبل في التهجين الموقع، تلطيخ immunofluorescent، الخ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+embryonic+Xenopus+cells+to+activin+and+FGF+are+separated+by+multiple+dose+thresholds+and+correspond+to+distinct+axes+of+the+mesoderm.">Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm.</a> Cell. 71 (5), 731-739 (1992).</li><li>Sudarwati, S., Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoderm+formation+in+the+anuranXenopus+laevis+(Daudin).">Mesoderm formation in the anuranXenopus laevis (Daudin).</a> Wilhelm Roux Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (3), 189-204 (1971).</li><li>Gurdon, J. B., Fairman, S., Mohun, T. J., Brennan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+muscle-specific+actin+genes+in+Xenopus+development+by+an+induction+between+animal+and+vegetal+cells+of+a+blastula.">Activation of muscle-specific actin genes in Xenopus development by an induction between animal and vegetal cells of a blastula.</a> Cell. 41 (3), 913-922 (1985).</li><li>Keller, R., Danilchik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+expression,+pattern+and+timing+of+convergence+and+extension+during+gastrulation+of+Xenopus+laevis.">Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis.</a> Development. 103 (1), 193-209 (1988).</li><li>Ariizumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+Xenopus+animal+cap+cells.">Isolation and differentiation of Xenopus animal cap cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2009).</li><li>Asashima, M., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+inducers+on+inner+and+outer+gastrula+ectoderm+layers+of+Xenopus+laevis.">Effects of inducers on inner and outer gastrula ectoderm layers of Xenopus laevis.</a> Differentiation. 23 (3), 206-212 (1983).</li><li>Jones, E. A., Woodland, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+ectoderm+in+Xenopus:+tissue+specification+and+the+role+of+cell+association+and+division.">Development of the ectoderm in Xenopus: tissue specification and the role of cell association and division.</a> Cell. 44 (2), 345-355 (1986).</li><li>Keller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+dye+mapping+of+the+gastrula+and+neurula+of+Xenopus+laevis.+I.+Prospective+areas+and+morphogenetic+movements+of+the+superficial+layer.">Vital dye mapping of the gastrula and neurula of Xenopus laevis. I. Prospective areas and morphogenetic movements of the superficial layer.</a> Developmental Biology. 42 (2), 222-241 (1975).</li><li>Sokol, S., Wong, G. G., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+macrophage+factor+induces+head+structures+and+organizes+a+body+axis+in+Xenopus.">A mouse macrophage factor induces head structures and organizes a body axis in Xenopus.</a> Science. 249 (4968), 561-564 (1990).</li><li>Thomsen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activins+are+expressed+early+in+Xenopus+embryogenesis+and+can+induce+axial+mesoderm+and+anterior+structures.">Activins are expressed early in Xenopus embryogenesis and can induce axial mesoderm and anterior structures.</a> Cell. 63 (3), 485-493 (1990).</li><li>Howard, J. E., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gastrulation:+different+types+of+gastrulation+movement+are+induced+by+different+mesoderm-inducing+factors+in+Xenopus+laevis.">Analysis of gastrulation: different types of gastrulation movement are induced by different mesoderm-inducing factors in Xenopus laevis.</a> Mechanisms of Development. 43 (1), 37-48 (1993).</li><li>Fulton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axis+specification+in+Zebrafish+is+robust+to+cell+mixing+and+reveals+a+regulation+of+pattern+formation+by+morphogenesis.">Axis specification in Zebrafish is robust to cell mixing and reveals a regulation of pattern formation by morphogenesis.</a> Current Biology. 30 (15), 3063-3064 (2020).</li><li>Schauer, A., Pinheiro, D., Hauschild, R., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryonic+explants+undergo+genetically+encoded+self-assembly.">Zebrafish embryonic explants undergo genetically encoded self-assembly.</a> eLife. , 55190 (2020).</li><li>Oppenheimer, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+isolated+blastoderms+of+Fundulus+heteroclitus.">The development of isolated blastoderms of Fundulus heteroclitus.</a> The Journal of Experimental Zoology. 72 (2), 247-269 (1936).</li><li>Trinkaus, J. P., Drake, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+control+of+morphogenesis+in+isolated+Fundulus+blastoderms+by+nutrient+chemical+factors.">Exogenous control of morphogenesis in isolated Fundulus blastoderms by nutrient chemical factors.</a> The Journal of Experimental Zoology. 132 (2), 311-347 (1956).</li><li>Grinblat, Y., Lane, M. E., Sagerstr&#246;m, C., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+zebrafish+development+using+explant+culture+assays.">Analysis of zebrafish development using explant culture assays.</a> Methods in Cell Biology. 59, 127-156 (1999).</li><li>Sagerstr&#246;m, C. G., Grinblat, Y., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anteroposterior+patterning+in+the+zebrafish,+Danio+rerio:+an+explant+assay+reveals+inductive+and+suppressive+cell+interactions.">Anteroposterior patterning in the zebrafish, Danio rerio: an explant assay reveals inductive and suppressive cell interactions.</a> Development. 122 (6), 1873-1883 (1996).</li><li>Sagerstr&#246;m, C. G., Gammill, L. S., Veale, R., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+the+enveloping+layer+and+lack+of+autoneuralization+in+zebrafish+embryonic+explants.">Specification of the enveloping layer and lack of autoneuralization in zebrafish embryonic explants.</a> Devolopmental Dynamics. 232 (1), 85-97 (2005).</li><li>Xu, P. F., Houssin, N., Ferri-Lagneau, K. F., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+vertebrate+embryo+from+two+opposing+morphogen+gradients.">Construction of a vertebrate embryo from two opposing morphogen gradients.</a> Science. 344 (6179), 87-89 (2014).</li><li>Williams, M. L. K., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+and+planar+cell+polarity+signaling+cooperate+to+regulate+zebrafish+convergence+and+extension+gastrulation+movements.">Nodal and planar cell polarity signaling cooperate to regulate zebrafish convergence and extension gastrulation movements.</a> eLife. 9, (2020).</li><li>de Olivera-Melo, M., Xu, P. F., Houssin, N., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+ectopic+morphogen+gradients+in+the+Zebrafish+blastula.">Generation of ectopic morphogen gradients in the Zebrafish blastula.</a> Methods in Molecular Biology. 1863, 125-141 (2018).</li><li>Sepich, D. S., Calmelet, C., Kiskowski, M., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+convergence+and+extension+movements+of+lateral+mesoderm+during+zebrafish+gastrulation.">Initiation of convergence and extension movements of lateral mesoderm during zebrafish gastrulation.</a> Devolopmental Dynamics. 234 (2), 279-292 (2005).</li><li>Gritsman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EGF-CFC+protein+one-eyed+pinhead+is+essential+for+nodal+signaling.">The EGF-CFC protein one-eyed pinhead is essential for nodal signaling.</a> Cell. 97 (1), 121-132 (1999).</li><li>Feldman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+organizer+development+and+germ-layer+formation+require+nodal-related+signals.">Zebrafish organizer development and germ-layer formation require nodal-related signals.</a> Nature. 395 (6698), 181-185 (1998).</li><li>Spemann, H., Manngold, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uber+inducktion+von+embryoalanlangen+durch+implantation+artfremder+organisatoren.">Uber inducktion von embryoalanlangen durch implantation artfremder organisatoren.</a> Archiv f&#252;r mikroskopische Anatomie und Entwicklungsmechanik. 100, 599-638 (1924).</li><li>Mangold, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Induktionsf&#228;higkeit+der+verschiedenen+Bezirke+der+Neurula+von+Urodelen.">&#220;ber die Induktionsf&#228;higkeit der verschiedenen Bezirke der Neurula von Urodelen.</a> Naturwissenschaften. 21 (43), 761-766 (1933).</li><li>Shih, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+zebrafish+organizer:+microsurgical+analysis+at+the+early-shield+stage.">Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage.</a> Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).</li><li>Agathon, A., Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+nature+of+the+zebrafish+tail+organizer.">The molecular nature of the zebrafish tail organizer.</a> Nature. 424 (6947), 448-452 (2003).</li><li>Tacke, L., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+juxtaposition+between+inducing+chordamesoderm+and+reacting+neuroectoderm+is+a+prerequisite+for+neural+induction+in+Xenopus+laevis.">Close juxtaposition between inducing chordamesoderm and reacting neuroectoderm is a prerequisite for neural induction in Xenopus laevis.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (1), 33-43 (1988).</li><li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+lhx1a+transgenic+reporter+in+zebrafish.">Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish.</a> The International Journal of Developmental Biology. 54 (4), 731-736 (2010).</li><li>Williams, M. L. K., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mesoderm-independent+role+for+Nodal+signaling+in+convergence+&amp;+extension+gastrulation+movements.">A mesoderm-independent role for Nodal signaling in convergence &amp; extension gastrulation movements.</a> BioRxiv. , (2019).</li><li>Londin, E. R., Niemiec, J., Sirotkin, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chordin,+FGF+signaling,+and+mesodermal+factors+cooperate+in+zebrafish+neural+induction.">Chordin, FGF signaling, and mesodermal factors cooperate in zebrafish neural induction.</a> Developmental Biology. 279 (1), 1-19 (2005).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>Veenvliet, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+stem+cells+self-organize+into+trunk-like+structures+with+neural+tube+and+somites.">Mouse embryonic stem cells self-organize into trunk-like structures with neural tube and somites.</a> Science. 370 (6522), (2020).</li><li>Beccari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-axial+self-organization+properties+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+gastruloids.">Multi-axial self-organization properties of mouse embryonic stem cells into gastruloids.</a> Nature. 562 (7726), 272-276 (2018).</li><li>Moris, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+early+anteroposterior+organization+during+human+development.">An in vitro model of early anteroposterior organization during human development.</a> Nature. 582 (7812), 410-415 (2020).</li><li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+and+spatial+transcriptomics+reveal+somitogenesis+in+gastruloids.">Single-cell and spatial transcriptomics reveal somitogenesis in gastruloids.</a> Nature. 582 (7812), 405-409 (2020).</li></ol>

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

وقد وصفت هذه المقالة كيفية توليد النباتات الخارجية blastoderm حمار وحشي وناقش اثنين من التطبيقات العملية لهذه explants في معالجة دور إشارة مورفوجين العقدية في gastrulation. توفر هذه الطريقة في قطع وزراعة النباتات السابقة قائمة فارغة من الخلايا الساذجة التي يمكن التلاعب بها باستخدام حقن الحمض النووي الريبي والعلاج بمركبات جزيء صغير للتحقيق في مسار جزيئي للاهتمام.
الخطوات الهامة هناك أربع خطوات في هذا البروتوكول حاسمة بشكل خاص لنجاحه. الأول هو حقن الأجنة بالكمية المناسبة من العقدة. ويوصي هذا البروتوكول 10 PG من الحمض النووي الريبي ndr2, وعلى الرغم من أن مجموعة من الجرعات يعزز التمديد, الكثير أو القليل جدا من العقد سيمنع تمديد explant الأمثل20. الخطوة الثانية هي إزالة الكورونات الأجنة. إذا بقيت الأجنة في البروناز لفترة طويلة جدا، فإن صفار البيض تنفجر، والأجنة لن تكون قابلة للحياة لقطع. إذا لم تكن في pronase لفترة طويلة بما فيه الكفاية ، لن يتم تخفيف الكورونات عن طريق الغسيل وستحتاج بدلا من ذلك إلى إلغاء المشيمة اليدوية التي تستغرق وقتا طويلا. الخطوة الحرجة الثالثة هي قطع النباتات الخارجية. يوصى بقطع محلول دانيو 3x ، حيث أن محتوى الملح السفلي من محلول 0.3x Danieau أو ماء البيض لا يعزز الشفاء وبقاء الباذنجان.
بالإضافة إلى ذلك ، يجب قطع النباتات في ما يقرب من نصف ارتفاع blastoderm لضمان سذاجة الخلايا. إذا تم قطعها قريبة جدا من صفار، وسوف تحتوي على إشارات من الهامش (بما في ذلك العقدة الذاتية) التي تعزز مواصفات الأنسجة ومورفوجينيسيس. الخطوة الحرجة الرابعة والأخيرة هي في شفاء النباتات الشيمية. اثنين من explants لن تنصهر لتشكيل الوهم ما لم يتم الضغط بلطف حواف قطع معا على الفور بعد قطعها.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها توفر الخطوات الهامة الموضحة أعلاه فرصا لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. وترد أدناه بعض المسائل المشتركة والحلول المقترحة.
إذا لم يتم توسيع explants في وجود إشارات العقدة، وهناك بعض الحلول الممكنة. (أ) حقن الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة لضمان أن الحمض النووي الريبي مشتت بالتساوي في جميع أنحاء الجنين بأكمله. (ب) تجنب حقن الكثير من الحمض النووي الريبي العقدي عن طريق ضمان أن حجم حقن هو الصحيح باستخدام ميكرومتر لقياس bolus الحقن. (ج) تجنب حقن القليل جدا من الحمض النووي الريبي العقدي عن طريق قياس تركيزه لضمان عدم تدهوره. (د) الحفاظ على بعض الأشقاء سليمة مطابقة للعمر لاستنتاج المرحلة المكافئة من explants. Explants تحقيق أقصى قدر من التمديد عندما الأشقاء سليمة تصل إلى مرحلة سومايت 2-5. إذا تم جمع explants في وقت مبكر جدا، ثم لن يتم التوصل إلى التمديد الأمثل.
إذا كان صفار تنفجر بعد dechorionation، والأجنة ليست قابلة للحياة لقطع، وإزالة الأجنة من محلول pronase مرة واحدة في chorions تبدأ في تجعد و1-2 الأجنة تسليط المشيمة الخاصة بهم. ثم، شطف فورا في ماء البيض.
إذا كانت explants تظهر شمبانيا حول حواف، وهناك بعض الحلول. (أ) قطع النباتات السابقة فقط ضمن إطار زمني محدد للتنمية. على الرغم من أن explants خفض في أي مرحلة من مراحل 128-إلى 1000 خلية يمكن البقاء على قيد الحياة وتمتد في الثقافة، وتلك التي قطعت في مراحل 256-512 خلية تميل إلى أن تكون أقوى. (ب) تأكد من أن يتم قطع explants في حل 3x دانيو لضمان الشفاء السليم. (ج) قطع النباتات السابقة نظيفة ولكن بلطف. تجنب تمديد أو سحب الخلايا بعيدا أثناء عملية القطع.
إذا كانت explants السيطرة غير المصححة تمتد، من المرجح أن قطع explants قريبة جدا من صفار. لكي تكون النباتات السابقة ساذجة ، تأكد من إجراء التخفيضات في منتصف الطريق بين الصفار وأعلى blastoderm.
إذا فشل explants chimeric في الصمامات ، فمن المرجح أن يكون ذلك بسبب ميل النباتات السابقة في حل 3x Danieau مرة واحدة هو قطع الجولة والشفاء على حافة القطع. لضمان أن blastoderms اثنين شفاء لبعضها البعض بدلا من أنفسهم، اضغط عليها معا مباشرة بعد قطع. استخدام ملقط لتطبيق ضغط لطيف على blastoderms انضم حديثا داخل بئر agarose لتشجيعهم على الشفاء معا.
القيود في حين أن هذه النباتات الخارجية هي أداة قيمة لدراسة دور مورفوجين معين (أو جزيء آخر من الفائدة) في العزلة النسبية ، يجب تفسير الملاحظات التي تتم في أي نموذج الجسم الحي السابق بعناية. Explants المعرض C &amp؛ E مورفوجينيسيس التي هي مشابهة جدا لتلك التي لوحظت في الجسم الحي20، لكنها لا تلخيص جميع جوانب gastrulation ، على سبيل المثال ، حركات epiboly. كما أنها تفتقر إلى العديد من العوامل التنظيمية الأخرى وجزيئات الإشارات الموجودة داخل الجنين السليم. في حين أن هذه ميزة تجريبية كبيرة من explants ، فإنه يمكن أن يؤدي أيضا إلى استنتاجات لا تعقد في الجسم الحي. على سبيل المثال، بما أن النباتات الخارجية التي لا تتلقى ليغاندس العقدية الخارجية تفشل في التعبير عن علامات القولون العصبي، يمكن للمرء أن يستنتج من النباتات الخارجية وحدها أن إشارة العقد مطلوبة لمواصفات العلاج العصبي. ومع ذلك، يتم تشكيل neuroectoderm داخل الأجنة سليمة تفتقر إلى جميع الإشاراتالعقدية 23،24، مما يدل على الدور الحيوي للجزيئات الإشارات الأخرى في المواصفات العصبية32. يمكن أن يخبرنا النباتات الخارجية ما هو المورفوجين القادر عليه في بيئة معزولة. ومع ذلك، ينبغي تأكيد جميع هذه النتائج في/مقارنة الأجنة السليمة لتفسير النتائج تفسيرا دقيقا. وبعبارة أخرى، لا يمكن للنباتات السابقة أن تأخذ مكان الجنين النامي. بدلا من ذلك، فهي أداة تكميلية لتحديد دور وعلاقة مورفوجين مع المناطق المحيطة بها. مع وضع هذه القيود في الاعتبار ، فإن النباتات explants blastoderm حمار وحشي هي أداة قيمة للعديد من الأسئلة البحثية.
الأهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة مع تجدد الاهتمام في علم الأجنة الاصطناعية، وتستخدم بانتظام العديد من نهج الجسم الحي السابق وفي المختبر لنموذج جوانب التنمية الجنينية. على سبيل المثال، يمكن اقناع 2- و 3-الأبعاد gastruloids تتألف من الماوس أو الإنسان الجنينية / المستحثة الخلايا الجذعية متعددة القدرات، من خلال تطبيق جزيئات الإشارات الخارجية، لتلخيص بعض الأحداث النقش و / أو مورفوجينيتي من gastrulation، تجزئة، والخصي33،34،35،36،37 . على الرغم من قوة هذه الأساليب، تتطلب أساليب طويلة وشاقة ثقافة للحفاظ على كل من الخلايا الجذعية متعددة القدرات باستمرار وزراعة gastruloids، والتي تستغرق عدة أيام للوصول إلى مراحل gastrulation. وعلى النقيض من ذلك، لا تتطلب النباتات البرازية للحمار الوحشي أي صيانة لثقافات الخلايا الجذعية، حيث يتم جمع الأجنة ببساطة حسب الحاجة. فهي بسيطة نسبيا لتوليد والوصول إلى مراحل gastrulation في غضون ساعات، نفس أجنة حمار وحشي. وهذا يسلط الضوء على ميزة أخرى من explants حمار وحشي، على مدار الساعة التنموية سليمة. ولأن عمر نمو الخلايا الجذعية الجنينية والمحرضة المتعددة القدرات يمكن أن يكون متغيرا ونقاشا كبيرا، فربما تكون النباتات الجنينية أكثر ملاءمة للتحقيق في التنظيم الزمني للتطور. وأخيرا، في حين أن explants حمار وحشي pescoid (التي تحتوي على الهامش الجنيني) تمتد بالمثل في الثقافة12،13، فإنها تفعل ذلك استجابة لمراكز الإشارات الذاتية. وبدلا من ذلك، تمكن النباتات السابقة الموصوفة هنا الباحثين من التحقيق في الجزيئات ذات الأهمية مع تدخل ضئيل نسبيا من مثل هذه الإشارات الجنينية.
التطبيقات المستقبلية المحتملة هنا، تم استخدام النباتات السابقة لإثبات أن إشارات العقد ضرورية وكافية لتولد المورفوجين C&amp.E. ومع ذلك، من المتوقع أن يتم استخدامها لتمييز دور العديد من الجزيئات المختلفة في العديد من العمليات التنموية الأخرى، على سبيل المثال، تنظيم التعبير الجيني، وتدرجات الإشارات، والبرامج المورفوجينية الإضافية. بالإضافة إلى ذلك، لأن هذه النباتات هي قابلة للحياة حتى 24 حصان على الأقل19،يمكن أن نتوقع أن فائدتها سوف تمتد إلى ما وراء gastrulation إلى عمليات مثل تجزئة وتولد الأعضاء، أي عملية التي يرغب الباحثون في قائمة فارغة التنموية.

الهدف الدائم من مجال البيولوجيا التنموية هو كشف تعقيد تطوير الأجنة لفهم أصل شكل الحيوان ووظيفته. حتى الأجنة المبكرة تحتوي على مزيج معقد من جزيئات الإشارات ، وتفاعلات الخلايا والأنسجة ، والقوى الميكانيكية ، وكلها تخضع لتنظيم مكاني وزمني صارم. ولهذا السبب، كثيرا ما يكون من الصعب تحديد الدور الدقيق لإشارة معينة في عملية إنمائية ذات أهمية. من خلال إزالة الأنسجة الجنينية من بيئتها الذاتية ، يخلق استئصال الجنين منصة مبسطة لتمييز الأدوار التنموية للأنسجة والجزيئات الفردية في عزلة نسبية. تقنيات الزرع وربما اشتهر في زنوبوس laevis، حيث تم استخدامها لدراسة تحريض الأنسجة ، إشارات الخلية ، الالتصاق الخلية ، و morphogenesis ، من بين عمليات أخرى1،2،3،4. ما يسمى بغطاء الحيوان explants ، حيث يتم عزل المنطقة الحيوانية من أجنة Xenopus مرحلة blastula قبل التفاعلات الاستقرائية5،6،7، هي تقنية واسعة الانتشار وقوية. المشؤومة قبعات الحيوان غير المهتلفة لتصبح ectoderm7،8. ومع ذلك ، فهي مؤهلة للاستجابة للعديد من العوامل الاستقرائية ، مما يسمح لهم بتشكيل أنسجة من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث والخضوع لحركات مورفوجينية مناسبة للأنسجة9و10و11. ومع ذلك ، فإن الأدوات الوراثية المحدودة والملاءمة دون المثلى للتصوير الحي تمنع استخدام النباتات القصوى للغطاء الحيواني Xenopus للعديد من علماء الأحياء التنموية. من خلال استئصال خلايا blastoderm من أجنة حمار وحشي ، يمكن للباحثين الجمع بين فائدة فحص الغطاء الحيواني مع الوضوح البصري ، ووفرة الأدوات الوراثية ، وغيرها من المزايا التجريبية لنظام نموذج حمار وحشي.
حتى الآن، استفاد الباحثون من نكهتين من النباتات الخارجية حمار وحشي: ما يسمى pescoids وscoplants blastoderm. في نموذج pescoid ، يتم عزل blastoderm بأكمله ، بما في ذلك المنطقة الهامشية ، من الصفار ويسمح له بتطوير الجسم الحي السابق دون طبقة صفار متزامنة خارج نطاق الذاكرة (YSL)12،13. وبهذه الطريقة ، تحمل pescoids تشابها ملحوظا مع النباتات الخارجية Fundulus التي ولدتها منذ عقود جين أوبنهايمر وJ.P. ترينكاوس14،15. هذه explants تلخيص العديد من جوانب النقش الجنيني و morphogenesis12،13. ومع ذلك ، لأن هذه العزلات تحتوي على مراكز الإشارات الذاتية (الهامش الجنيني) ، فهي ليست مبسطة فيما يتعلق ببيئة الجزيئية الخاصة بهم. بدلا من ذلك، يمكن للباحثين توليد ساذج نسبيا حمار وحشي blastoderm explants عن طريق استبعاد المنطقة الهامشية16،17،18،19،20،21. غير المتحكم بها حمار وحشي blastoderm explants التعبير عن مستويات عالية من البروتين مورفوجينيتي العظام (BMP) morphogens19 وتؤدي إلى ectoderm غير العصبية وطبقة مغلفة (EVL) عندما مثقف ex vivo18. ومع ذلك ، فإنها تلخص العديد من جوانب النقش المحوري والمورفوجينيا استجابة لتدرجات الإشارات الخارجية19،20،21، على غرار قبعات Xenopus. لهذا السبب، blastoderm explants هي نموذج مفيد لدراسة دور مورفوجين معين (أو مورفوغنز) في مواصفات طبقة الجرثومية، وحركات الخلايا المورفوجينية، والتدرجات الإشارات داخل بيئة إشارات مبسطة. وعلاوة على ذلك، blastoderms من الأجنة من أنماط جينية مختلفة أو شروط يمكن الجمع في explant19،21 خلية واحدة،21 للتحقيق في استقلالية الخلية / الأنسجة والتفاعلات الاستقرائية.
يمكن استخدام النباتات المنفوخة من سمك الحمار الوحشي للتحقيق في دور الإشارات الجنينية (على سبيل المثال ، العقدة) في مورفوجينيسيس ومواصفات الأنسجة أثناء الاختراق. عن طريق حقن الاصطناعية ndr2 الجيش الملكي النيبالي (ترميز ليغاند العقدي) في مرحلة خلية واحدة، يتم تنشيط الإشارات العقدية في جميع أنحاء blastoderm من الجنين. تولد النباتات الخارجية من هذه الأجنة تدرجات إشارات العقد ، وتشكل جميع الطبقات الجرثومية الثلاث ، وتخضع لحركات تقارب وتمديد (C &amp؛ E) كما رأينا في الأجنة السليمة20. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام explants الشمي لتوضيح قدرة أنسجة mesoderm للحث على استئصال الأعصاب من blastoderm (السذاجة) غير مقننة. يوفر هذا البروتوكول تعليمات لإنشاء نباتات بيستوديرم لسمك الحمار الوحشي ويوضح فائدتها في تحديد دور إشارات العقد في تحريض الأنسجة والمورفوجين.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm glass beads</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Z250473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J19943-K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB012927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2 .4H2O</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>12364-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 watchmakers forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo injection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>I-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass crystalizing dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-741A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-748A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT4018-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean sea salts</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9258-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-015-2632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer</td>
			<td>SPI supplies</td>
			<td>02265-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK635704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26010-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico-pump pneumatic injector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet pump</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13 683C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes 100 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes 60 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wash bottles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-409-10E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200002-836</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of na&#239;ve blastoderm explants from zebrafish embryos

نظرا لوضوحها البصري وتطورها السريع ، تعد أجنة حمار وحشي نظاما ممتازا لفحص سلوكيات الخلايا وعمليات النمو. ومع ذلك ، بسبب تعقيد وتكرار الإشارات الجنينية ، يمكن أن يكون من الصعب تمييز الدور الكامل لأي إشارة واحدة أثناء تكوين الجنين المبكر. من خلال explanting المنطقة الحيوانية من blastoderm حمار وحشي، يتم إنشاء مجموعات ساذجة نسبيا من الخلايا الجنينية التي يمكن زراعة بسهولة والتلاعب بها فيفو السابقين. من خلال إدخال جين الفائدة عن طريق حقن الحمض النووي الريبي قبل الزرع ، يمكن للمرء تقييم تأثير هذا الجزيء على التعبير الجيني ، وسلوكيات الخلايا ، وغيرها من العمليات التنموية في عزلة نسبية. وعلاوة على ذلك، يمكن الجمع بين الخلايا من أجنة من أنماط جينية مختلفة أو ظروف في تفسير خميري واحد لفحص التفاعلات بين الخلايا/الأنسجة والوظائف الجينية الخاصة بالأنسجة. توفر هذه المقالة تعليمات لتوليد النباتات الخارجية blastoderm سمك الحمار الوحشي ويوضح أن جزيء إشارات واحد - ليغاند العقدية - يكفي للحث على تكوين طبقة الجرثومية ومورفوجينيسيس التمديد في الأنسجة الجنينية السذاجة خلاف ذلك. نظرا لقدرتها على تلخيص سلوكيات الخلايا الجنينية ، وتدرجات مورفوجين ، وأنماط التعبير الجيني في نظام الجسم الحي السابق المبسط ، من المتوقع أن تكون هذه النباتات الخارجية ذات فائدة كبيرة للعديد من باحثي سمك الحمار الوحشي.

العقدية محرك تشكيل طبقة الجرثومية وC & E من النباتات explants blastoderm سمك الحمار الوحشي ظلت زراعة النباتات المقطوعة من أجنة البرية غير المحتقنة (WT) أو تلك التي تم حقنها ب 50 pg من بروتين الفلورسنت الأخضر المشفر (GFP) مدورة طوال فترة الثقافة(الشكل 2A-C)وفشلت في التعبير عن علامات mesoderm أو endoderm أو neuroectoderm ( الشكل3C)20. معا، وهذه تشير إلى عدم وجود تشكيل طبقة مورفوجينيسيس والجرثومية التي تميز gastrulation الفقاريات. ومع ذلك، أصبح explants قطع من الأجنة حقن مع 10 PG من ndr2 مرنا ممدود للغاية بعد 8-9 ح في الثقافة (الشكل 2D). وكشف التصوير الحي الفاصل زمنيا لهذه النباتات الخارجية عن طريق الفحص المجهري التفاضلي للتباين التداخلي (DIC) أن ظهور التمديد عند أو حوالي 8 ح بعد الإخصاب (hpf) (الشكل 2F)، في نفس الوقت الذي يبدأ فيه تكوين المورفوجين C&amp.E في أجنة حمار وحشي سليمة22. قطع Explants من MZoep-/- الأجنة, التي تفتقر إلى tdgf1 الأساسية العقدية المشاركة مستقبلات23, فشلت في تمديد استجابة لحقن ndr2 (الشكل 2E), مما يدل على أن النشاط العقدي أمر بالغ الأهمية لهذا مورفوجينيسيس الجسم الحي السابق. وبالإضافة إلى ذلك، كامل جبل في الموقع التهجين أظهرت كذلك أن ndr2-التعبير عن explants التعبير عن علامات neuroectoderm (sox2) والعديد من الأنواع الفرعية ميسودرم (tbxta، نوتو، tbx16) (الشكل 2G)، وكذلك endoderm ومنظم الجنينية20.
لا يلزم الإشارة العقدية لتحريض القولون العصبي بواسطة mesoderm نشاط الإشارات العقدية ضروري لتحريض endoderm ومعظم mesoderm ولكن يمكن الاستغناء عنها لمواصفات neuroectoderm داخل gastrulae حمار وحشي23،24. في حين لم تفرق explants حمار وحشي blastoderm غير مقننة في neuroectoderm (الشكل 3C18)، explants من الأجنة حقن مع 10 pg ndr2 أظهرت تعبيرا قويا من علامة neuroectoderm sox2 في خطوط متميزة على طول المحور الطويل للميل (الشكل 2G)، مما يدل على أن النشاط العقدي مطلوب لتشكيل neuroectoderm ex vivo. منذ فترة طويلة من المعروف أن الأنسجة mesodermal يمكن أن تحفز الأنسجة العصبية25,26,27,28,29, بما في ذلك في حمار وحشي blastoderm explants17. ومع ذلك ، فمن غير الواضح ما إذا كان تشكيل neuroectoderm في هذا النظام التجريبي يتطلب إشارات العقد مباشرة أو ما إذا كانت الليغاند العقدي الخارجي يحفز mesoderm الذي يحفز الأنسجة العصبية بعد ذلك بشكل ثانوي.
تم إنشاء explants الشمي الذي يحتوي على أجزاء mesoderm المحتملين و neuroectoderm من جنينين مختلفين لاختبار ما إذا كان مطلوبا إشارات العقدة الأنسجة بشكل مستقل لمواصفات neuroectoderm ex vivo. قطع جزء mesoderm من كل explant من جنين WT خلاف ذلك التعبير عن مراسل GFP المعدلة وراثيا mesoderm محددة، TG[lhx1a:eGFP]30، حقن بجرعة عالية (100 pg) من ndr2 (الشكل 3A). تم قطع الجزء المفترض من كل استئصال عصبي إما من جنين WT التحكم أو العقدة مما يشير إلى نقص MZoep-/- الجنين حقن فقط مع مرنا ترميز العلامة النووية الفلورية H2B-RFP (الشكل 3A). تم إنشاء كل إكسبلانت الشمير عن طريق الجمع بين blastoderm واحد من كل من هذين الشرطين، والتي تم فحصها للتعبير عن علامات خاصة بالأنسجة من قبل كامل جبل في التهجين الموقعي في 12 hpf.
وأعرب معظم explants جنين واحد من الأجنة حقن مع 100 pg ndr2 القليل أو لا sox2، وأعرب عن علامات mesoderm ، بما في ذلك tbxta وlhx1a : gfp مراسل في جميع أنحاء explant (الشكل 3B، G). غير مقنن WT blastoderm (من النوع الذي يتألف من الجزء المحتملين neuroectoderm من explants الشمي) أعرب لا علامات mesoderm ولا sox2 عندما مثقف كمنصف واحد، مما يدل على عدم وجود مواصفات neuroectoderm و mesoderm (الشكل 3C،H). وبالمثل افتقرت النباتات ذات الجنين الواحد من MZoep-/- embryos إلى التعبير عن علامات كل من القولون العصبي والميوديرم، حتى عند حقنها ب ndr2 (الشكل 3D). ومع ذلك ، عندما تم الجمع بين blastoderms WT غير مقننة مع mesoderm الناجمة عن جرعات عالية من ليغاندس العقدية ، وأعرب عن هذه explants الشمي كل من علامات mesoderm وs sox2 بقوة(الشكل 3E، أنا). هذه النتائج تثبت أنه، كما لوحظ سابقا17،26،27،29، mesoderm يمكن أن تحفز المصير العصبي في الخلايا التي من شأنها أن تصبح خلاف ذلك ectoderm غير العصبية. لاختبار ما إذا كان مطلوبا إشارة العقد مباشرة داخل الجزء المحتملين neuroectoderm من هذه explants للتحريض العصبية، تم إنشاء explants الشمي من WT blastoderms حقنها مع 100 pg ndr2 و blastoderms من MZoep-/- الأجنة(الشكل 3J). على الرغم من عدم قدرتها على تلقي إشارات نودال من الجزء mesodermal المجاورة، وأعرب عن هذه explants sox2 إلى درجة مماثلة كما WT مراقبة الوهم (الشكل 3F). هذه النتيجة يدل على أن يتفق مع الأجنة سليمة التي يتم تحديد الأنسجة العصبية في غياب نشاط العقدة, لا يلزم إشارة العقدة الأنسجة بشكل مستقل للتحريض neuroectoderm ex vivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62797/62797fig01.jpg"> الشكل 1: إجراء لsexplantation blastoderm حمار وحشي (الخطوة 4.3). (أ) عقد ملقط في اليد غير المهيمنة (البرتقالي) مغلقة ضد صفار لتحقيق الاستقرار في الجنين في حين معسر blastoderm في ما يقرب من 1/2 من ارتفاعه باستخدام ملقط في اليد المهيمنة (الأزرق). (ب) تشغيل ملقط البرتقال على طول حافة ملقط الأزرق تجتاح الجنين لشريحة من خلال blastoderm بحيث يصل إلى قطع الأولى في منتصف الطريق تقريبا عبر blastoderm. (ج) تدوير الجنين 90 درجة، ثم ضع ملقط الأزرق داخل (ولكن متعامدة ل) قطع الأصلي وقرصة لقطع blastoderm المتبقية. (D) السماح للخلايا blastoderm ببلاطة للشفاء في حل 3x دانيو لمدة 5 دقائق تقريبا قبل نقلها إلى وسائل الإعلام explant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62797/62797fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62797/62797fig02.jpg"> الشكل 2 (تعديل من20): العقدية تعزيز C & E مورفوجينيسيس وتشكيل طبقة الجرثومية في النباتات explants blastoderm حمار وحشي. (A) رسم تخطيطي للحقن واختفاط أجنة حمار وحشي. (ب-ه) صور تمثيلية ذات مجال مشرق للمخططات الحية blastoderm للظروف / الأنماط الجينية المشار إليها في ما يعادل مرحلة سومايت 2-4. N = عدد الطائرات السابقة من محاكمتين إلى أربع محاكمات مستقلة. (F)سلسلة DIC الفاصل الزمني من explant ممثل من جنين WT حقن مع 10 pg ndr2 RNA. (G) صور تمثيلية للتهجين الكامل في الموقع للنصوص المشار إليها في النباتات السابقة من أجنة WT التي تم حقنها ب 10 pg ndr2 RNA. أشرطة المقياس هي 200 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62797/62797fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62797/62797fig03.jpg"> الشكل 3 (تعديل من31): تكشف النباتات الشيمية أن مواصفات neuroectoderm لا تتطلب إشارة العقد المستقلة للأنسجة ex vivo. (A) رسم تخطيطي للإجراء لتوليد explants حمار وحشي شيديري. (ب-واو) كامل جبل في التهجين الموقع ل tbxta علامة mesoderm (أعلى) وs neuroectoderm علامة sox2 (أسفل) في explants من الأجنة WT حقن مع 100 pg ndr2 الجيش الملكي النيبالي(B), uninj WT الضوابط (C), MZoep-/- حقن مع 10 pg ndr2 (D), و explants الشمي تحتوي على أجزاء neuroectoderm من WT (E) أو MZoep-/- (F ) الأجنة في ما يعادل مرحلة سومايت 2-4. تشير الكسور إلى عدد النباتات السابقة ذات النمط الظاهري الموضح على العدد الإجمالي للنباتات السابقة التي تم فحصها. (G-J) صور تمثيلية من TG الحية [lhx1a:gfp] explants من جنين واحد (G-H) أو جنبا إلى جنب مع 2B-التعبير blastoderms (I-J, أرجواني) من الشروط المشار إليها في ما يعادل مرحلة 2-4 سوميت. N = عدد النباتات من ثلاث تجارب مستقلة. أشرطة المقياس هي 200 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62797/62797fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>الحل 1</td>
			<td>الحل 2</td>
			<td>الحل 3</td>
			<td>الحل 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>حل</td>
			<td>3x دانيو</td>
			<td>ماء البيض</td>
			<td>وسائل الإعلام إكسبلانت</td>
			<td>0.3x دانيو</td>
		</tr>
<tr>
<td>المكونات</td>
			<td>174 مليون متر كلوريد NaCl</td>
			<td>60 ميكروغرام/مل أملاح البحر</td>
			<td>DMEM/F12 + 2.5 مليون لتر-الجلوتامين و15 م م HEPES</td>
			<td>17.4 مليون م كلوريد NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.1 مليون كيلو متر كل عام</td>
			<td>1 لتر ماء مقطر</td>
			<td>3٪ الحجم الإجمالي لمصل العجل حديث الولادة أو مصل الأبقار الجنينية</td>
			<td>0.21 مليون كيلو كل عام</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>1.2 مللي متر ملغسو4. 7H2O</td>
			<td></td>
			<td>1:200 البنسلين (50 وحدة/مل)-ستريبتومايسين (50 ميكروغرام/مل)</td>
			<td>0.12 مللي متر ملغسو4•7H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>1.8 mM Ca (NO3)2 •4H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.18 mM Ca (NO3)2 •4H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>15 مليون هيبس</td>
			<td></td>
			<td>مثل:</td>
			<td>1.5 مليون م HEPES</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ماء مقطر</td>
			<td></td>
			<td>4 مل/شرط × 9 شروط = 36 مل</td>
			<td>ماء مقطر</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.08 مل مصل العجل حديث الولادة (NCS، تم اقتباسه في -20 درجة مئوية (3٪)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.18 مل 200x القلم بكتيريا (PS، aliquoted في -20 درجة مئوية) (1:200)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35 مل DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1 - الجداول

Watch this Scientific Journal Video about Generation of NaÃƒÂ¯ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos at JoVE.com

Generation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

يتم إنشاء النباتات الخارجية blastoderm حمار وحشي عن طريق عزل الخلايا الجنينية من مراكز الإشارات الذاتية داخل الجنين المبكر، وإنتاج مجموعات الخلايا السذاجة نسبيا التلاعب بسهولة ومثقفة ex vivo. توفر هذه المقالة تعليمات لجعل مثل هذه explants ويوضح فائدتها عن طريق استجواب الأدوار للإشارات العقدية أثناء gastrulation.

جيل من الساذج Blastoderm Explants من أجنة زيبرافيش

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

حتى الأجنة المبكرة جدا تحتوي على العديد من جزيئات الإشارات المختلفة ، مما قد يجعل من الصعب تمييز الوظيفة الكاملة لأي إشارة جنينية فردية. من خلال عزل الخلايا عن مراكز الإشارات الذاتية ، تمكن هذه النباتات الخارجية الباحثين من فحص دور جزيء إشارات معين في عزلة نسبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا قادرون على تلخيص التوقيت الجنيني وحركات الخلايا وأنماط التعبير الجيني داخل نظام الجسم الحي السابق المبسط دون الوقت أو الجهد اللازم للحفاظ على الخلايا الجذعية في الثقافة.ابدأ بقطع النباتات من الأجنة غير المصابة أولا. إذا كان explants توسيع الثقافة، ثم تم إجراء خفض على مقربة من صفار. تبدأ عن طريق ملء إبرة شعرية زجاجية سحبت مع الجيش الملكي النيبالي.ضع الإبرة المملوءة في متلاعب صغير وكسر طرف الإبرة بالملقط. معايرة حجم الحقن باستخدام ميكرومتر المرحلة مع قطرة من الزيت المعدني، وضبط وقت الحقن والضغط على حاقن هوائي لتحقيق بولوس من الحجم المطلوب. إبقاء طرف إبرة الجيش الملكي النيبالي مغمورة في الزيت حتى تصبح جاهزة للحقن.قم بتحميل الأجنة في لوحة الحقن باستخدام ماصة باستور ومضخة ماصة، ثم استخدم إصبعا قفازا للضغط على البيض في الأحواض برفق. حقن 10 picograms ndr2 الجيش الملكي النيبالي في صفار أجنة خلية واحدة حتى يتم الوصول إلى العدد المطلوب من الأجنة أو حتى تبدأ الأجنة لتقسيم. استخدم تيارا لطيفا من ماء البيض من زجاجة ضغط لغسل الأجنة من لوحة الحقن إلى طبق بيتري المسمى.ضع الأجنة في حاضنة 28.5 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة الخلية 128. إزالة البويضات غير المخصبة والأجنة الميتة من الطبق. بمجرد وصول الأجنة إلى مرحلة الخلية 128 ، ضعها في أطباق بيتري الزجاجية المسماة ، وديكنت أكبر قدر ممكن من ماء البيض منها.تسمية الزجاج بلورة الأطباق مع شريط مختبر المقابلة لأسماء طبق صغير، وملء ثلثي الطريق مع ماء البيض. ضع هذه الأطباق بجانب مجهر التشريح لسهولة الوصول السريع. إضافة ملليلتر واحد من 20 ملليغرام لكل سهم بروناز ملليلتر، إذابة على الجليد إلى 15 ملليلتر من محلول 3X دانيو في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.إضافة ما لا يقل عن خمسة ملليلتر من محلول البروناز إلى كل طبق بيتري الزجاج التي تحتوي على الأجنة. تهييج الأطباق الزجاجية في حركة دائرية ، ورصد التقدم المحرز في dechorionation باستمرار تحت المجهر تشريح. بمجرد أن تبدأ الكوريونات في التجاعيد ويخرج جنين إلى جنينين من المشيمات الخاصة بهم ، قم بغمر طبق بيتري الزجاجي الذي يحتوي على البروناز والأجنة في طبق تبلور الزجاج المقابل الذي يحتوي على ماء البيض.غسل الأجنة dechorionation ثلاث مرات مع ماء البيض وdecant ماء البيض من الطبق. قم بإجراء الغسيل الثالث والأخير مع حل 0.3X Danieau. قم بتغطية الأجنة المتشترية بغطاء طبق بيتري، وأعيدها إلى الحاضنة عند 28.5 درجة مئوية حتى وصلت إلى مرحلة ال 256 خلية.ملء طبق بيتري المغلفة agarose مع حل 3X دانيو. بمجرد أن تكون الأجنة في مرحلة 256 خلية ، قم بنقلها إلى لوحة الآجروز المغلفة التي تحتوي على محلول 3X Danieau ، واصطفها على طول وسط الطبق. استخدام زوج واحد من ملقط، عقدت مغلقة لتحقيق الاستقرار في الجنين، واستخدام الآخر لقطع من خلال blastoderm.لقطع، والضغط بلطف على خلايا blastoderm مع زوج واحد من ملقط، ثم اتخاذ ملقط استقرار وتشغيلها على طول ملقط أخرى لشريحة في منتصف الطريق تقريبا عبر blastoderm. تدوير الجنين، ووضع ملقط في قطع القائمة ومن ثم قطع الكيسات المتبقية متعامدة إلى القطع الأول. الحفاظ على explants في حل 3X دانيو لمدة خمس دقائق على الأقل للشفاء، ومن ثم نقلها إلى بئر agarose المغلفة من لوحة من ستة آبار مليئة أربعة ملليلتر من وسائل الإعلام explant.ضع لوحات الثقافة المضروبة في حاضنة 28.5 درجة مئوية حتى يتم الوصول إلى النقطة الزمنية أو المرحلة المطلوبة. لقطع explants chimeric، استخدم طبق مع agarose مصبوب في 12 آبار ضحلة صغيرة باستخدام حبات الزجاج ملليمتر واحد. ملء لوحة مع حل 3X دانيو.الاستعداد عن طريق إضافة 12 جنينا من النمط الجيني واحد أو شرط إلى الجانب الأيسر من لوحة، و 12 الأجنة من النمط الجيني الأخرى مشروطة إلى الجانب الأيمن من لوحة. نقل جنين واحد من كل حالة إلى مركز اللوحة بالقرب من أحد الآبار ال 12. باستخدام ملقط، وقطع explant من كل جنين كما هو موضح لنباتات الجنين واحد.اضغط بسرعة على حواف قطع من اثنين من explants معا داخل البئر الضحلة باستخدام ملقط للسماح للنصفين للشفاء معا في explant واحد. استمر مع الآبار ال 12 المتبقية داخل اللوحة. بمجرد شفاء النباتات السابقة ، قم بنقلها إلى بئر الآغاروز المغلفة بلوحة من ستة آبار مليئة بأربعة ملليلترات من الوسائط المصفية.كرر حتى يتم تحقيق العدد المطلوب من النباتات السابقة. النباتات المستزرعة في حاضنة 28.5 درجة مئوية حتى الأجنة الشقيقة سليمة وصلت إلى المرحلة المطلوبة. ظلت النباتات الملحقة للتحكم المقطوعة من الأجنة البرية غير المصابة أو تلك التي تم حقنها ب 50 صورة من الحمض النووي الريبي لترميز البروتين الفلوري الأخضر مدورة طوال فترة الثقافة ، وفشلت في التعبير عن علامات mesoderm أو endoderm أو neuroectoderm.أصبحت النباتات المقطوعة من الأجنة التي تم حقنها ب 10 بيكوجرامات من ndr2 mRNA ممدودة للغاية بعد ثماني إلى تسع ساعات في الثقافة. وكشف التصوير الحي الفاصل زمنيا لهذه النباتات الخارجية عن طريق المجهر التبايني التفاضلي المتدخل أن الملحقات تبدأ في أو حوالي ثماني ساعات بعد الإخصاب. أظهرت النباتات من الأجنة التي تم حقنها ب 10 بيكوجرامات من ndr2 تعبيرا قويا عن علامات mesoderm ، tbxta ، noto ، tbx16 ، وعلامة neuroectoderm sox2.من المهم جدا لخفض explants أعلى بكثير من الهامش الجنيني. وإلا فإن الطائرات الخارجية ستحتوي على إشارات داخلية من الهامش ولن تكون ساذجة. في هذه الطريقة، استخدمت النباتات السابقة لمعالجة دور الإشارات العقدية في مورفوجينيسيس gastrulation.في المستقبل، يمكن للباحثين الآخرين استخدام هذا النهج لاختبار دور جزيئات الإشارات الإضافية، على سبيل المثال، في أي عدد من العمليات التنموية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

إصابة سفينة الميكانيكية في الزرد الأجنة

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

الزرد خلية قرنية إإكسبلنتس لدراسة الهجرة الجماعية خلية وعودة التظهرن في شفاء الجروح الجلدية

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

إإكسبلنتس الشبكية كاملة من الدجاج الأجنة لعلاج Electroporation للوالكيميائية الكاشف

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

جيل من التعايش الالتصاقي الزرد الأجنة التي كتبها فيوجن الجراحي لتطوير الأريمات

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

تقارب كشف وسمها الذاتية المستقبلات من الزرد الأجنة

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

التلاعب الصيغة الصبغية من الزرد الأجنة مع الحرارة صدمة 2 العلاج

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

بيوسنسينغ موتور الخلايا العصبية الغشاء المحتملة في الأجنة الزرد الحية

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

ثقافة الكبار المعدلة وراثيا الزرد الشبكية إإكسبلنتس التصوير خلية حية من قبل Multiphoton المجهر

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...