Name: simultaneous brightfield, fluorescence, and optical coherence tomographic imaging of contracting cardiac trabeculae ex vivo
Uploaded: 2021-10-02T15:00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo at JoVE.com

تم تمويل هذه الدراسة من منح الدكتوراه من جامعة أوكلاند (التي منحت لJD وMC)، السير تشارلز هيركوس زمالات البحوث الصحية (20/011 و 21/116) من مجلس البحوث الصحية في نيوزيلندا (منحت لJ-CH إلى KT، على التوالي)، منحة دكتوراه تمنحها المؤسسة الوطنية للقلب (تمنح إلى AA)، منح مارسدن للبدء السريع (UOA1504 و UOA1703) من الجمعية الملكية في نيوزيلندا (تمنح إلى J-CH و KT، على التوالي) ، وزمالة أبحاث جيمس كوك من الجمعية الملكية في نيوزيلندا (منحت لمنظمة AT). تم تمويل التطوير الأصلي لهذه الأداة من منحة مارسدن (11-UOA-199) من الجمعية الملكية في نيوزيلندا (تمنح لجمعية AT وPN).

<ol>
	<li>Han, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+stress+production+in+isolated+cardiac+trabeculae+from+the+rat.">Energetics of stress production in isolated cardiac trabeculae from the rat.</a> American Journal of Physiology. Heart and circulatory physiology. 299 (5), 1382-1394 (2010).</li><li>Ter Keurs, H. E. D. J., Rijnsburger, W. H., Van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+development+and+sarcomere+length+in+rat+cardiac+trabeculae.+Evidence+of+length-dependent+activation.">Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation.</a> Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).</li><li>Shen, X., Cannell, M. B., Ward, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+SR+load+and+pH+regulatory+mechanisms+on+stretch-dependent+Ca2++entry+during+the+slow+force+response.">Effect of SR load and pH regulatory mechanisms on stretch-dependent Ca2+ entry during the slow force response.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 63, 37-46 (2013).</li><li>Dowrick, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+force+response+to+stretch:+Controversy+and+contradictions.">The slow force response to stretch: Controversy and contradictions.</a> Acta Physiologica. 226 (1), 13250 (2019).</li><li>Stuyvers, B. D. M. Y., Miura, M., Ter Keurs, H. E. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diastolic+viscoelastic+properties+of+rat+cardiac+muscle;+involvement+of+Ca2+.">Diastolic viscoelastic properties of rat cardiac muscle; involvement of Ca2+.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 13-28 (1997).</li><li>Tang, E. J. L. P., Laven, R. C., Hajirassouliha, A., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+displacement+in+isolated+heart+muscle+cells+using+markerless+subpixel+image+registration.">Measurement of displacement in isolated heart muscle cells using markerless subpixel image registration.</a> Conference Record - IEEE International Instrumentation and Measurement Technology Conference. , (2019).</li><li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+excitation-contraction+coupling.">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li><li>Cheuk, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+markerless+tracking+of+the+strain+distribution+of+actively+contracting+cardiac+muscle+preparations.">A method for markerless tracking of the strain distribution of actively contracting cardiac muscle preparations.</a> Experimental Mechanics. 61 (1), 95-106 (2020).</li><li>Lippok, N., Coen, S., Nielsen, P., Vanholsbeeck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersion+compensation+in+Fourier+domain+optical+coherence+tomography+using+the+fractional+Fourier+transform.">Dispersion compensation in Fourier domain optical coherence tomography using the fractional Fourier transform.</a> Optics Express. 20 (21), 23398 (2012).</li><li>Cheuk, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-Dimensional+imaging+of+cardiac+trabeculae+contracting+in+vitro+using+gated+OCT.">Four-Dimensional imaging of cardiac trabeculae contracting in vitro using gated OCT.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 64 (1), 218-224 (2017).</li><li>Ritland, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+between+refractive+index+and+density+of+a+glass+at+constant+temperature.">Relation between refractive index and density of a glass at constant temperature.</a> Journal of the American Ceramic Society. 38 (2), 86-88 (1955).</li><li>Tuchina, D. K., Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+glucose+and+glycerol+diffusion+in+myocardium.">Quantification of glucose and glycerol diffusion in myocardium.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 8 (3), (2015).</li><li>Taberner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamometer+for+nature's+engines.">A dynamometer for nature's engines.</a> IEEE Instrumentation and Measurement Magazine. 22 (2), 10-16 (2019).</li><li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trainable+Weka+Segmentation:+A+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification.">Trainable Weka Segmentation: A machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li><li>Jiang, Y., Julian, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacing+rate,+halothane,+and+BDM+affect+fura+2+reporting+of+[Ca2+](i)+in+intact+rat+trabeculae.">Pacing rate, halothane, and BDM affect fura 2 reporting of [Ca2+](i) in intact rat trabeculae.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273 (6), 2046-2056 (1997).</li><li>Miura, M., Boyden, P. A., Ter Keurs, H. E. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+during+triggered+propagated+contractions+in+intact+trabeculae.">Ca2+ waves during triggered propagated contractions in intact trabeculae.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 274 (1), (1998).</li><li>Han, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radius-dependent+decline+of+performance+in+isolated+cardiac+muscle+does+not+reflect+inadequacy+of+diffusive+oxygen+supply.">Radius-dependent decline of performance in isolated cardiac muscle does not reflect inadequacy of diffusive oxygen supply.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (4), 1222-1236 (2011).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

في هذه الدراسة، نقدم التكوين الذي يمكن تجميع ثلاثة أنظمة بصرية تجمع بين برايتفيلد، مضان، والتصوير أكتوبر لجمع البيانات من الترابكولا القلب السابقين التعاقد بنشاط(الشكل 1 والشكل 2). مثل هذا التكامل المنظم ممكن بسبب تصميم غرفة القياس (الشكل 3) لتمكين الترتيب المتعامد من أكتوبر إلى محور مشرق الفلورسينس. يلعب نظام تركيب العضلات دورا مهما بنفس القدر في نجاح التحديدات الكمية المتزامنة للمؤشرات الرئيسية في توصيف ديناميكيات انقباض عضلات القلب. تكمن حداثتها في تمكين إجراءات مسح العضلات دون أي اضطراب واضح في الأداء الميكانيكي للعضلات(الشكل 6). مع تكوين التصوير المشترك ونظام الخطاف الآلي لقياس القوة ، يمكن لهذا النظام تقييم التغايرية الإقليمية في Ca2 + عابرة ، والتشريد ، وطول الساركومير ، جنبا إلى جنب مع المعلومات الهندسية العيانية من trabecula التعاقد طوال الدورة الزمنية للارتعاش(الشكلين 7 والشكل 8).
وبالنظر إلى انتشار أنظمة التصوير الساطعة في مختبرات أبحاث القلب، يمكن تحقيق إعادة إنتاج هذه النتائج مع بعض الاعتبارات البسيطة للأجهزة. هنا ، نقدم مجموعة أدوات معالجة الصور للجمع بين برايتفيلد - epifluorescence و OCT ، وهو أمر ضروري في تحليل التغاير الانكماشي الأساسي. يتطلب تكامل OCT مسارا بصريا دون عائق ، في حين يتطلب التصوير المسور خط تشغيل خارجي بين التحفيز وكاميرا التصوير OCT و brightfield ، وخطافات تركيب العضلات القادرة على تحريك العينة في جميع أنحاء غرفة القياس. تتوفر البرامج والأساليب المطلوبة بعد المعالجة مجانا. على وجه الخصوص ، فإن برنامج التقسيم المستخدم ، WEKA14، مفتوح المصدر. تقنية تتبع بدون علامات من النقاط المادية8، طول الساركومير ، التصوير الحجمي المسور10، ورموز توليد الشبكة يمكن الوصول إليها بالمثل ويمكن توفيرها بناء على طلب المؤلف المقابل.
إن قابلية العضلات للحياة، والتحميل الأمثل ل Fura-2، وتركيز الصورة هي الركائز الثلاث التي تشكل أسس تجربة ناجحة. باستخدام محلول تشريح يحتوي على BDM لمنع انقباط ، ونقل العضلات في حقنة ، والأوكسجين المستمر للمحلول ، وإعداد حلول تجريبية جديدة في يوم التجربة ، وكلها تسهم في ارتفاع معدل صلاحية العضلات. قبل تحميل trabecula مع Fura-2AM، يجب أن يتم جمع autofluorescence لكل شرط واحد مهتم في دراسة كما يمكن أن يكون لها تأثير كبير على قياس Ca2 + عابرة 15. إن أكسجة محلول التحميل Fura-2AM معقد بسبب الإدراج الضروري ل pluronic-F127 المتفاعلة على السطح للمساعدة في تحميل الصبغة. لمكافحة تكوين الفقاعة الزائدة الناتجة عن هذا السطحي ، يتيح قطرة صغيرة من الرغوة المضادة في محلول التحميل للمستخدم زيادة معدل الأكسجين ، وبالتالي تحسين فرصة أن يحافظ trabecula على الجدوى الوظيفية طوال عملية التحميل. وأخيرا، يجب أن يكون تركيز التصوير موحدا بطول العضلات لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء لمعلومات brightfield و fluorescence.
هناك نوعان من القيود للنظر مع الأساليب المعروضة هنا. الأول هو الاستبانة المكانية للمجهر الفلوري. في حين أن القرارات المكانية للتصوير OCT و brightfield عالية ، فإن دقة المجهر الفلوري تقتصر على جزء لا يتجزأ من الفلورسينس من الحجم الذي تم التقاطه داخل نافذة تصوير 540 ميكرومتر في 540 ميكرومتر. هناك مجال لزيادة الدقة المكانية للمجهر الفلوري باستخدام كاميرا جهاز ذات زيادة عالية ، بدلا من PMT ، لالتقاط إشارة الفلورسينس على حساب نسبة الإشارة إلى الضوضاء16. ثانيا هو قطر trabecula التي يمكن دراستها من حيث طول ساركومير قابلة للقياس وعمق هندسي. نهج نافذة -FFT لحساب طول ساركومير يستغل الاستفادة من تحسين الدقة المكانية ولكن يرتبط مع انخفاض متانة(الشكل 8D). في الحالات التي يكون فيها ترابيكولاي عكر أو كبير القطر لدراسة, سيتم تخفيض قابلية حل FFT إلى حد كبير بسبب انخفاض التباين المرتبطة ربط الساركومريك في عينات الأنسجة أكبر. وبالمثل، داخل أكتوبر، فإن الانعكاسات الخلفية من عمق التصوير أكبر من 300 ميكرومتر تكون أضعف من أن يتم حلها خلال مرحلة التقسيم. وبالتالي، يقتصر أسلوبنا على trabeculae قطرها أقل من 300 ميكرومتر. ومع ذلك، فإنه لا ينصح لدراسة عينات قطرها كبيرة كما قد يكون هناك مشاكل مع الأوكسجين نشرها من قلب العضلات خلال معدلات عالية من التحفيز17.
تمكن طريقتنا من تقييم الوظيفة الميكانيكية الأيونية بالتعاون مع هندسة العضلات في العضلات السليمة والممرضة ، مما يوفر نهجا قويا لفهم فسيولوجيا عضلة القلب ، والفيزيولوجيا المرضية ، وعلم الصيدلة. يستخرج خط أنابيب معالجة الصور المبين هنا بيانات ستكون محورية للحصول على فهم أعمق للتغايرية الانقبالية. أحد السبل لتحقيق إمكانات مجموعة البيانات الغنية هذه بشكل كامل هو بناء نماذج رياضية تدمج هذه البيانات وتفسرها ، وإجراء تنبؤات يمكن اختبارها تجريبيا باستخدام جهازنا.

Superfusion من مستحضرات أنسجة عضلة القلب المعزولة هو بروتوكول قياسي ويستخدم على نطاق واسع لدراسة تنشيط القلب الأيونية والميكانيكا1. على وجه الخصوص ، فإن عزل trabeculae ، الهياكل الشبيهة بالقضبان من الجدران البطينية ، مكن من تقييم الظواهر بما في ذلك التنشيط المعتمد على الطول للانكماش2، والاستجابة المعتمدة على التمدد للانكماش3،4، واللزوجة الانبساطية 5 منأنسجة القلب. تير Keurs، البادئ من هذه التقنية من الترابكولا المعزولة superfusing، استخدمت في البداية مزيجا من التصوير الفلوري للقياسات Ca2 + والحيود الليزر لتحديد أطوال ساركومير2،5. منذ هذه الدراسات المبكرة ، أصبح من الشائع بشكل متزايد استخراج معلومات طول الساركومير بدقة مكانية أكبر باستخدام تقنيات تحويل فورييه السريعة 2D (FFT) المستندة إلى6 على صور المجهر المشرق. يسمح نظاما التصوير بتقييم جزئي للعلاقة الأساسية بين إطلاق Ca2+ وإنتاج القوة المعتمدة على طول الساركومير.
يتم إعادة محاولة عضلة القلب ، مع ربط مرئية المرتبطة سلسلة الكامنة وراء وحدات انقباش تتكون من خيوط سميكة وسميكة. التفاعل بين هذه خيوط المكونة التي تشكل sarcomeres يكمن وراء توليد القوة، والتي تبدأ على النحو التالي: إشارة كهربائية إزالة الاستقطاب، أو إمكانات العمل، ويسبب الجهد تعتمد على نوع L قنوات Ca2 + في غشاء الخلية لفتح؛ تدفق الخلوية التي تلت ذلك من Ca2 + يحفز الإفراج عن Ca2 + من reticulum الساركوبلازمي (ريال)، وهو مخزن Ca2 + داخل الخلية، في عملية تعرف باسم Ca2 +-المستحث Ca2 + الإصدار7؛ هذه الزيادة المفاجئة في تركيز Ca2 + داخل الخلية من نانومولار إلى نطاق الكائنات الدقيقة تمكن من إنتاج القوة. مضخات Ca2+ تقذف باستمرار Ca2+ من السيتوسول مرة أخرى إلى المقصورة SR وخارج الخلية؛ عندما يعود تركيز Ca2+ داخل الخلية إلى نطاق النانومولار ، يتوقف إنتاج القوة ، وتسترخي العضلات. أثناء إنتاج القوة، تنزلق خيوط سميكة ورقيقة مكونة فوق بعضها البعض. طول الساركومير يملي المدى النسبي للتداخل، وبالتالي، فإن إمكانية إنتاج القوة من العضلات بالمنظار.
في هذه الورقة، نقوم بتوسيع تقنيات التصوير الفلورية-برايتفيلد لتشمل التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT). أكتوبر يستخدم المبدأ المادي للتدخل وقادرة على الحصول على تشوه هندسي من الأنسجة لفهم العضلات الانقباش التغايرية8. يستخدم جهازنا(الشكل 1)نظام OCT (SD-OCT) الطيفي. في SD-OCT، يقسم مقسم الحزمة الضوء من صمام ثنائي فائق الوميض قصير النطاق بطول التماسك إلى أذرع مرجعية وقياسية. الذراع المرجعية تحتوي على مرآة ثابتة، وذراع القياس يحتوي على مقياس 2D-galvanometer لتوجيه الضوء. يتم جمع ضوء backscattered من العينة ويتداخل مع الضوء المنعكس في الذراع المرجعية لتشكيل نمط التداخل. يتم ترميز معلومات العمق في تردد هامش الطيفية. لاستخراج المعلومات، يتم تمرير الإشارة من خلال مطياف ويتم تطبيق FFT معكوس على النتيجة. تمثل الإشارة 1D المقابلة الهياكل في أعماق مختلفة ، بما يتوافق مع التغيرات في مؤشر الانكسار9 (A-scan). من خلال توجيه الليزر في محور واحد ، يمكن للمرء بناء مقطع عرضي من عينة من الاهتمام (B - المسح الضوئي) ، وبالمثل ، عن طريق تكرار العملية في نمط خطوة الحكمة في المحور المتبقي ، يمكن إنشاء صورة ثلاثية الأبعاد (C - المسح الضوئي). وبالتالي ، يمكن للمرء أن جمع سلسلة من باء بمسح في شريحة واحدة لتكرار الوقت متفاوتة الموضوع على أساس الزناد الخارجي وتكرار لتوليد مسح ثلاثي الأبعاد ، وهو ما يمثل صورة مخطط متغيرة زمنيا10.
في دمج أنظمة التصوير الثلاثة، قمنا بالنظر في المبدأين التاليين. أولا، لا ينبغي لأجهزة استشعار التصوير أن تكتشف الضوء من طريقة تصوير بديلة، وثانيا، ينبغي أن يحتوي التصميم المادي على مساحة حرة لثلاث طائرات تصوير متزامنة على الأقل. لمعالجة المطلب الأول، يستخدم المجهر برايتفيلد الصمام الطول الموجي 660 نانومتر لإلقاء الضوء على العينة في تكوين مقلوب. المجهر الفلوري هو في تكوين epifluorescence حيث يتم استخدام نفس العدسة الموضوعية لكل من الإثارة وجمع الضوء المنبعث. ضوء الإثارة لديه الطول الموجي بين 340 نانومتر و 380 نانومتر، وأنبوب فوتوموليبير (PMT) يقيس الضوء المنبعث على طول موجي من 510 نانومتر. زوج من المرايا ديكهرويك تمكين هذين المسارين البصرية لتقاسم نفس البصمة المادية دون التدخل في القياس المعاكس(الشكل 2). وأخيرا، يستخدم OCT ضوء النطاق العريض (100 نانومتر عرض الطيفي) مع الطول الموجي المركزي من 840 نانومتر، متميزة عن الطريقتين الأخريين. ونظرا لطبيعة الإضاءة المستخدمة في أكتوبر منخفضة التماسك، فإن أي ضوء متناثر من مصادر التوهج الساطع لن يساهم في نمط التداخل الذي يشفر معلومات العمق. بالنسبة للشرط الثاني ، يحتوي تصميم السكن للأنبوب الشعري على مسارات بصرية يمكن الوصول إليها إلى الطائرات الأمامية والدنيئة والمتفوقة للعينة. خلال التجارب، يحمل خطان بلاتينيان ترابيكولا داخل أنبوب شعري متغلغل في محلول كريبس-هنسيليت (KH) المؤكسيج. رئيس galvanometer من أكتوبر هو موجه بشكل متعامد إلى مسار التصوير مشرق مضان للاستفادة من الطائرة البصرية المتعامدة الثالثة(الشكل 3).
تحدد هذه الورقة اعتبارات التصميم لبناء جهاز قادر على تصوير الكالسيوم وطول الساركومير وهندسة العضلات في وقت واحد. ولإثبات قدرات القياس هذه، فإننا نصف عملية عزل الترابيكولا البطينية، وإعداد الحلول العازلة اللازمة، إلى جانب الخطوات الحاسمة التي ينطوي عليها التعامل مع الترابيكولا في الجسم الحي السابق وتحميلها بفلور. وأخيرا، توضح هذه الورقة العمليات المطلوبة لترجمة مجموعة البيانات إلى مرئيات أكثر فائدة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>150375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215; microscope lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Super Fluor 20&#215;</td>
			<td>NA 0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D Galvanometer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVSM002/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-50 beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FC850-40-50-APC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-10 beam-splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TW850R2A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analogue input module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-9205</td>
			<td>Records the PMT signal at 200 kHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield imaging light source</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>PE-2</td>
			<td>660&#160;nm LAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broadband light source</td>
			<td>Superlum</td>
			<td>Broadlighter-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cameralink card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-1429</td>
			<td>Brightfield imaging frame grabber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen 5</td>
			<td>BOC</td>
			<td>Gas code: 181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condensor lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>LWD 0.52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAQ</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6259</td>
			<td>Triggers the galvanometer movement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror 1</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF409-Di03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF552-Di02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffraction grating</td>
			<td>Wasatch Photonics</td>
			<td>1200 lines/mm @840 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-Q 3 UV System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ZRQSVR3WW</td>
			<td>Distilled water machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6875-SB</td>
			<td>LSE digital dry bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Open-source image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2AM pentapotassium salt</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>F14186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware FPGA card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-7813R</td>
			<td>Also controls the triggering of the brightfield capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>61024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-DH illumination pillar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>MedSource</td>
			<td>VAPDRUGISO250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Line-scan camera</td>
			<td>Basler</td>
			<td>spL2048-70km</td>
			<td>Spectrometer camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3810000</td>
			<td>RCT basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Data processing code</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT FPGA card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-1483R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tank</td>
			<td>BOC</td>
			<td>Gas code: 100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MP220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerload</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P10020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superluminescent diode</td>
			<td>Broadlighter</td>
			<td>D-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transimpedance amplifier</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wistar rat</td>
			<td>Vernon Jansen Unit</td>
			<td></td>
			<td>8 &#8211; 10 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon arc lamp</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>DG-4</td>
			<td>Lambda DG-4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous brightfield, fluorescence, and optical coherence tomographic imaging of contracting cardiac trabeculae ex vivo

في عضلة القلب، يقوم العابرون داخل الخلية Ca2+ بتنشيط العضلات العضلية المنقبضة، مما يسبب انكماشا وتقصيرا بالمنظار وتشوها هندسيا. كان فهمنا للعلاقات الداخلية بين هذه الأحداث محدودا لأننا لا نستطيع "الرؤية" داخل العضلة ولا تتبع بدقة الطبيعة الزمنية لديناميكيات الإثارة والانكماش. لحل هذه المشاكل، قمنا ببناء جهاز يجمع بين مجموعة من طرائق التصوير. على وجه التحديد ، فإنه يدمج المجهر مشرق لقياس التغيرات المحلية من طول الساركومير وسلالة الأنسجة ، ومجهر مضان لتصور Ca2 + عابرة ، ودموغرافيا التماسك البصري لالتقاط التغيرات الهندسية للأنسجة طوال الدورة الزمنية لدورة القلب. نقدم هنا البنية التحتية للتصوير وإطار جمع البيانات المرتبط به. يتم جمع البيانات من هياكل الأنسجة المعزولة الشبيهة بالقضبان المعروفة باسم trabeculae carneae. في أداتنا، زوج من السنانير البلاتينية التي تسيطر عليها الموقف عقد كل نهاية عينة العضلات فيفو السابقين في حين يتم فرضه باستمرار مع محلول ملحي الغنية بالمغذيات. السنانير تحت سيطرة مستقلة، مما يسمح السيطرة في الوقت الحقيقي من طول العضلات والقوة. تتيح الترجمة بالطول المسح الضوئي للعينة، والتغلب على القيود المرتبطة بالحجم النسبي لنافذة التصوير بالمجهر (540 ميكرومتر في 540 ميكرومتر) وطول ترابيكولا نموذجي (>2000 ميكرومتر). الأقطاب البلاتينية في أي من طرفي غرفة العضلات تحفز trabecula بمعدل يحدده المستخدم. نحن نستغل إشارة التحفيز كمحفز لمزامنة البيانات من كل نافذة تصوير لإعادة بناء العينة بأكملها في ظل ظروف ثابتة. تطبيق تقنيات معالجة الصور على هذه البيانات التصوير brightfield يوفر إزاحة الأنسجة وخرائط طول الساركومير. ومن شأن هذه المجموعة من البيانات، عند دمجها في خط أنابيب لنمذجة التجارب، أن توفر فهما أعمق لتجانس العضلات الانقباشية وعدم التجانس في علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية.

من أجل التقاط الإقليمية Ca2 + ومعلومات brightfield لكامل طول trabecula المقدمة هنا، كانت هناك حاجة إلى سبعة مواقف العضلات. ويشير الشكل 6 إلى أن قوة الارتعاش لم تزعجها هذه الحركة، مما يكشف عن عدم وجود اعتماد على موقع إنتاج القوة النشطة.
تم تقسيم B-بمسح تم جمعها باستخدام التصوير المقطعي التماسك البصري بمعدل 100 هرتز باستخدام البرنامج المساعد ImageJ WEKA14 (الشكل 7A). يظهر كل مقطع عرضي مشوها بسبب الفرق بين الدقة الجانبية (10 ميكرومتر) والعمق (1.73 ميكرومتر (في عضلة القلب)). تم تصحيح هذا التشويه عن طريق قياس محور عمق الصورة بنسبة الدقة الجانبية العمق. الشكل 7B، C تثبت أنه بعد توسيع نطاق الخام C - مسح trabecula هو أسطواني تقريبا في الهندسة. انعكاس جدار غرفة القياس يمكن أن تتداخل في بعض الأحيان مع بيانات العضلات (الشكل 7A، ب)، ولكن يمكن تدريب برنامج تجزئة لحساب هذا(الشكل 7D، ه). مرة واحدة مجزأة، يمكن حساب المنطقة المقطعية العرضية على طول العضلات في جميع أنحاء نشل(الشكل 7F). لاحظ أن هذا trabecula خاصة لديه ملحق صغيرة تتفرع منه. حركة الفرع واضح ~ 0.75 ملم على طول trabecula. وأخيرا، يمكن تحويل الصور المجزأة إلى شبكات للمساعدة في بناء نماذج هندسية(الشكل 7G).
تم خياطة بيانات التصوير التي تم التقاطها في كل من المواقف المختلفة trabecula بمعدل 100 إطارا في الثانية معا لخلق صورة واحدة كاملة من trabecula (الشكل 8A). دقة هذه الصور هي 0.535 ميكرومتر / بكسل. استخدام وظائف الترجيح الخطي في المناطق المتداخلة من النوافذ المجاورة يساعد التصور ويقلل من تأثير المقالة القصيرة الموجودة في صور brightfield. لقياس إشارة الفلورسنت، يتم إضاءة نافذة 540 ميكرومتر في 540 ميكرومتر من التربيكولا دوريا مع 340 نانومتر، 365 نانومتر، و 380 نانومتر ضوء الطول الموجي بمعدل 600 هرتز. ترتبط نسبة الفلورسينس المنبعثة المرتبطة بضوء الإثارة 340 نانومتر و380 نانومتر بالكالسيوم داخل الخلايا بعد تحميل الترابيكولا ب Fura-2. وبما أن هذا القياس هو نسبة، فإن معدل القياس الفعال هو 200 هرتز. المتوسط(ن = 10) داخل الخلية Ca2 + العابرين من كل نافذة يتم محاذاتها مع المنطقة التي تم تصويرها (الشكل 8B). في حين أن ذروة العابرين تبدو متسقة بشكل معقول ، فإن الانبساطي [Ca2 +] أقل داخل المنطقة بين 900 ميكرومتر و 1800 ميكرومتر على طول ترابكولا. وبالمثل، تشير نتائج عمليات تتبع الإزاحة(الشكل 8C)وطول الساركومير(الشكل 8D)أيضا إلى وجود تباين إقليمي. تقنية التتبع بدون علامات المستخدمة قادرة على معالجة إزاحة كل بكسل ، نظرا للتباين الكافي. عند رسم خرائط لتوزيع أطوال الساركومير في آخر، تم استخدام منطقة عبر الارتباط من 128 بكسل في 128 بكسل (~ 67 ميكرومتر في 67 ميكرومتر) لحساب طول الساركومير الإقليمي. هذه المنطقة تغلف ما يقرب من 29 sarcomeres عند إغلاق العينة على مقربة من طول الساركومير الأمثل. تم تعيين حجم الخطوة (في كل من الاتجاهين س و ص)بين السنترويد لكل إطار عبر الارتباط إلى 50 بكسل (~ 26 ميكرومتر) لمعالجة هذه البيانات. تم اختبار مدى ملاءمة تقديرات طول الساركومير على أساس عرض وسعة الغاوسي المناسب لإشارة FFT. لم يتم استيفاء هذه الشروط في منطقة العضلات بين 0 ميكرومتر و 500 ميكرومتر لذلك لا يمكن حساب أي معلومات طول الساركومير هناك. وبالنظر إلى حالات التشريد المرتبطة بها، فمن المرجح أن تكون الساركومير في هذه المنطقة ممدودة خلال مرحلة الانكماش. وتمشيا مع هذه التكهنات، فإن متوسط أطوال الساركومير على الجانب الأيمن من التربيكولا يقصر خلال تلك الفترة. ومن خلال الجمع بين المعلومات التي يقدمها كل فريق من الأفرقة، يبدو أن المنطقة التي تضم أكبر منطقة مقطعية لا تنتج أهم قوة. على افتراض أن الاختلاف الإقليمي للعاببين Ca2 + له تدرج سلس تقريبا ، يشير الشكل 8B إلى أن أكبر سعة Ca2 + عابرة تحدث في مكان ما بين 1300 ميكرومتر و 1600 ميكرومتر على طول التربيكولا. تشير خريطة الإزاحة إلى أن المنطقة التي تمر بأقل حركة تتماشى بشكل جيد مع ذروة Ca2+ عابرة. ومع ذلك، هذه المنطقة لديها أصغر المناطق المقطعية العرضية للعينة. ومع مراعاة هذه البيانات، يمكن للمرء أن يستنتج أن هذه المنطقة ولدت أكبر قدر من الإجهاد.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig01.jpg"> الشكل 1:صورة مشروحة لمقياس عضلة القلب. ويرد كل من المكونات البصرية الرئيسية. يحتوي الداخل على رؤية خلفية عن قرب لهدف المجهر في الموقع، أسفل غرفة القياس. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig02.jpg"> الشكل 2:المسار البصري للمجهر المشرق والمضان المتزامن. مصدر الإضاءة للمجهر الفلوري هو مصباح قوس زينون ، والذي يتحول إخراجه دوريا بين 340 نانومتر ، 365 نانومتر ، وضوء 380 نانومتر. يحتوي مسار إخراج مصباح القوس على مرآة ديكهروبية بطول موجي مقطوع يبلغ 409 نانومتر يعكس ضوء الأشعة فوق البنفسجية على مرآة توجه الضوء إلى هدف المجهر الفلوري. تركز العدسة ضوء الإثارة على العينة وتجمع الضوء المنبعث ، الذي له طول موجي أطول من 510 نانومتر. يمر هذا الضوء المنبعث عبر المرآة الديكهروية الأولى ، ولكن ليس الثاني ، حيث يبلغ طوله الموجي 552 نانومتر. ثم تركز عدسة الحقل الضوء المنعكس على مستشعر PMT. وفي الوقت نفسه، يقع مصدر الإضاءة (660 نانومتر LED) لمجهر برايتفيلد فوق العينة. يركز الضوء المرسل على العينة بواسطة عدسة مكثف ، ويلتقط هدف الفلورسينس × 20 صورة الإرسال الناتجة. الطول الموجي المستخدم لإضاءة برايتفيلد يتجاوز الطول الموجي المقطوع لكل مرآة ديكهروبية ، لذلك يمر عبر كليهما قبل أن تركز الصورة على مستشعر كاميرا CMOS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig03.jpg"> الشكل 3: تصميم حامل غرفة القياس. (أ) عرض متساوي القياس لحامل غرفة القياس مع مسارات بصرية مضافة. الإضاءة برايتفيلد يحدث من السطح المتفوق(ضالمحور)؛ الإضاءة الفلورية يحدث من السطح السفلي(ضالمحور)، وقياس الذراع إشارة أكتوبر متعامدة إلى محور الإضاءة الأخرى(صالمحور). خلال التجربة، يحمل خطان بلاتينيان ترابيكولا داخل أنبوب زجاجي شعري يعمل كغرفة قياس. تتحكم محركات لفائف الصوت في كل خطاف ويتم قياس مواقعها باستخدام قياس التداخل بالليزر. تتم مقارنة الموضع الحالي مع نقطة تعيين معرفة من قبل المستخدم و، باستخدام وحدة تحكم PID المرمزة داخل FPGA، يتم تقليل الخطأ. (ب) غرفة القياس في الموقع مع الإضاءة brightfield تشغيل. يتم عرض الخلفية في الشكل 1 inset. (ج) تخطيطي لتدفق السخانات الفائقة من خلال حامل غرفة القياس. Superfusate يدخل الجزء الخلفي من كتلة ويتدفق في الاتجاه المشار إليه من قبل السهام. تقوم أقطاب المنبع والمصب بإنشاء التحفيز الميداني للحصول على تقلص ترابيكولا مثبتة في غرفة القياس. يشير التظليل الأزرق إلى المناطق التي تتدفق فيها التدفقات الفائقة أثناء التجربة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig04.jpg"> الشكل 4: لوحة أمامية من الحصول على صورة والتحكم البرمجيات. (أ) برايتفيلد واجهة المستخدم التصوير. (ب) أكتوبر واجهة المستخدم التصوير. (C) واجهة المستخدم التحكم في الأجهزة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig05.jpg"> الشكل 5: تشريح Trabecula وتركيب البروتوكول. (أ) Langendorff-perfused قلب الفئران في غرفة تشريح. (ب ) نفس القلب مع إزالة الأذين. خطوط متقطعة تشير إلى مسار ختان لفتح البطينين. (ج) فتح القلب لفضح الداخلية من البطينين على حد سواء. يشير المربع المتقطع إلى المنطقة التي توجد فيها عادة trabeculae. (D) منطقة الجدار البطين الأيمن المقتطعة (نفس ما يشير إليه المربع المتقطع في C). خطوط متقطعة تسليط الضوء على ثلاثة trabeculae. (ه) ترابيكولا مختارة من الثلاثة في D. (F) وtrabecula من لوحة E مع إزالة نسيج الجدار. (G) ترابيكولا معزولة في نهاية حقنة 1 مل. (H)وtrabecula في غرفة تصاعد. (I)ركبت trabecula بين اثنين من السنانير البلاتين. (J) وtrabecula، التي شنت بين السنانير، داخل غرفة القياس (الشكل 3B). البقعة الخضراء هي قطعة أثرية من أول فلتر ديكهروي. (ك) زاوية ثانوية من trabecula شنت داخل غرفة القياس. المسافة بين trabecula وعدسة الهدف المجهر هو ما يقرب من 1 ملم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig05large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig06.jpg"> الشكل 6: اعتماد موضع قياس القوة. القوة التي تنتجها العضلات من كل من مواقع التصوير(ن = 7) مضافا. وكان متوسط إنتاج القوة النشطة 0.527 mN ± 0.003 mN، والوقت إلى 50 ٪ انكماش 77.1 مللي ثانية ± 0.3 مللي ثانية، والوقت إلى 50 ٪ الاسترخاء 328.1 مللي ثانية ± 0.9 مللي ثانية (يتم تقديم جميع البيانات على أنها متوسط ± SE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig7v2.jpg"> الشكل 7: أكتوبر تحليل التصوير. (أ)مثال على تقسيم واكا. يتم تمييز المقطع العرضي المجزأ من العضلات باللون الأحمر ، ويتم تمييز الخلفية باللون الأخضر. (ب) عرض متفوقة من البيانات الخام C-مسح ترابيكولا. خط الزاوية الساطع نحو الجزء العلوي من الصورة هو انعكاس جدار غرفة القياس. (ج) عرض الجانبي للبيانات الخام C-مسح ترابيكولا. (D) عرض متفوقة للبيانات أكتوبر مجزأة. (ه) عرض الجانبي للبيانات أكتوبر مجزأة. (F) المنطقة المقطعية العرضية بطول التراكيكولا(المحور س)عبر الزمن (المحور ص). وكان متوسط منطقة المقطع العرضي على طول العضلات 0.0326 مم2 ± 0.0005 مم2 (متوسط ± S.E.) (G) شبكة من ترابكولا. وقد تم محاذاة شبكة تقريبا مع مؤامرة منطقة مقطعية من لوحة F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig7v2lage.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig08.jpg"> الشكل 8: تحليل التصوير الساطع والمضان. (أ) صورة مخيط (سبع نوافذ التصوير) من trabecula. (ب) Ca2 + عابرين على طول ترابكولا. (C) متوسط x-displacementمن كل نافذة تصوير. يمثل الإزاحة الإيجابية حركة إلى اليمين وسلبية إلى اليسار. (D) متوسط أطوال ساركومير من كل نافذة التصوير التي كان التباين الصورة اللازمة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig08large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1: جدول الحلول يرجى <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/Tables_of_solutions.xlsx" target="_blank">الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo at JoVE.com

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

يقدم هذا البروتوكول مجموعة من ساركومير والكالسيوم والبيانات الهندسية العيانية من ترابيكولا القلب المتعاقدة بنشاط مع الجسم الحي السابق. ويمكن إجراء هذه القياسات المتزامنة من خلال دمج ثلاث طرق للتصوير.

في وقت واحد برايتفيلد، فلورسينس، والتصوير الطبوغرافي التماسك البصري من التعاقد ترابيكولاي القلب السابق فيفو

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and ...

الهدف العام لهذا الإجراء هو إظهار تكامل ثلاثة أنظمة تصوير في جهاز واحد ، مما يتيح قياسا متزامنا للوظيفة الميكانيكية ، والديناميكيات الأيونية ، والتغيير الهندسي لأنسجة القلب المتعاقدة. على وجه التحديد، نحن نقيس إنتاج قوة الأنسجة، والعابلي الكالسيوم، والتشريد المحلي، وتغيير الشكل. ويمكن أن يساعد الجمع بين طرائق التصوير هذه في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أمراض القلب، مع ما يترتب على ذلك من آثار كبيرة على وضع استراتيجيات علاجية فعالة.الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكننا من دراسة عدم التجانس في نشاط العضلات. يحتوي الجهاز المستخدم في هذا البروتوكول على ثلاثة أنظمة تصوير قادرة على تصوير نفس العينة، ومجهر برايتفيلد، ومجهر مضان، وتصوير مقطعي للتماسك البصري. وتستخدم سلسلة من المرايا ديكهروي لفصل انبعاث مضان وصورة انتقال برايتفيلد.السمات الأساسية لهذا الجهاز هما خطاطيف تصاعد مستقلة المحركة، وغرفة قياس مع ثلاثة محاور واضحة بصريا وخط الزناد الخارجي الذي يتزامن مع كاميرات brightfield وOCD مع محفز. في هذا الفيديو، ونحن نبين كيفية عزل وإعداد وصورة ترابيكولا القلب وتقديم بعض النتائج التمثيلية. بعد استئصال قلب من جرذ مخدر، قم بنقله إلى غرفة التشريح.باستخدام اثنين من ملقط منحني، سحب الشريان الأورطي على قنية التغلغل. عقد الشريان الأورطي في مكان مع ملقى واحد. وفي الوقت نفسه، افتح خط الأنابيب للسماح حل تشريح لتدفق من خلال قنية التخبط.بمجرد تطهير الأوعية التاجية من الدم وثقب القلب تماما بمحلول التشريح ، قم بتأمين الشريان الأورطي في مكانه باستخدام خياطة. ضع القلب عن طريق تدوير القنية بحيث يكون الشريان التاجي الأيسر مرئيا على السطح المتفوق. دبوس قمة القلب إلى الجزء السفلي من غرفة تشريح.قطع كل من الأذينين. قطع على طول الجانب الأيمن من الحاجز إلى قمة القلب. تثبيت البطين الأيسر فتح إلى قاعدة غرفة تشريح.ثم، وقطع على طول الجانب الأيسر من الحاجز، وفتح البطين الأيمن ودبوس عليه إلى قاعدة غرفة تشريح، أيضا. تحديد trabecula حرة التشغيل في البطين الأيمن. باستخدام مقص الربيع والملقط، وقطع أنسجة الجدار المحيطة trabecula.ثم، وقطع نسيج الجدار في النصف، متعامدة إلى اتجاه trabecula. تقليم أنسجة الجدار حتى بعدها هو المناسب لتكوين تصاعد المستخدمة. اترك التراكيكولا المقتطعة في غرفة التشريح.تدفق الماء الساخن، والمياه المقطرة، ومن ثم حل superfusate من خلال غرفة القياس. قم بتشغيل مصدر ضوء المجهر الساطع واضغط على F1 لتمكين الالتقاط. ضبط خطاف المصب يدويا حتى يتم توسيطه في صورة brightfield.انقر فوق محور المصب صفر، ثم تعطيل المصب لتمكين المحرك. حرك شريط تمرير نقطة تعيين المتلقين للمعلومات حتى محاذاة نهاية الخطاف مع حافة منطقة الاهتمام الافتراضية. أعد صفر محور المصب، ثم حرك شريط تمرير نقطة تعيين المصب إلى 1,000.كرر العملية باستخدام ربط upstream ولكن لا نقل شريط التمرير نقطة تعيين upstream بعد إعادة التصفير محور upstream. انقر فوق الانتقال إلى التركيب. ابدأ نظام الإضاءة الفلورية عن طريق تبديل مفتاح المصباح قبل تشغيل النظم الفرعية لوحدة التحكم بسرعة عن طريق تبديل المفتاح الرئيسي.قم بتبديل الوضع التشغيلي إلى فراغ توربو بالضغط على زر الوضع على اللوحة الأمامية، يليه اثنان، ثم واحد. اضغط على زر الاتصال لتمكين التحكم الخارجي. وقفة تدفق فائقة من خلال غرفة القياس.ملء غرفة تصاعد مع حل تشريح. باستخدام حقنة مليلتر واحد، نقل trabecula من غرفة تشريح إلى غرفة تصاعد. السماح لtrabecula النزول إلى غرفة تصاعد عن طريق الجاذبية.خفض مستوى السوائل في غرفة التركيب بحيث يكون مستوى مع القسم الأوسط من السنانير. ضبط المسافة بين السنانير لتعكس طول فترة سماح من trabecula عن طريق تحريك شريط التمرير نقطة تعيين المصب. باستخدام المجهر للمساعدة في التصور ، قبضة طفيفة واحدة من قطعة من الأنسجة نهاية مع ملقط وجبل على هوك المنبع.جبل قطعة أخرى من الأنسجة نهاية على هوك المصب. مرة واحدة شنت بشكل آمن، ونقل trabecula مرة أخرى إلى غرفة القياس عن طريق الضغط على الانتقال إلى الغرفة واستئناف تدفق فائقة. تعيين وتيرة التحفيز إلى واحد، ومدة التحفيز إلى 10، والجهد التحفيز إلى 10.بدء التحفيز عن طريق الضغط على التحفيز. تشغيل نظام الإضاءة برايتفيلد. اضغط F1 وحدد منطقة الفائدة التي تحيط منطقة المخططات من واجهة المستخدم.انقر فوق حساب طول الساركومير لحساب متوسط طول الساركومير في المنطقة المميزة. زيادة طول العضلات حتى متوسط طول الساركومير هو ما يقرب من 2.32 ميكرون. حرك العضلة عن طريق ضبط شريط تمرير نقطة الوسط على علامة التبويب التحكم في الوسط والفصل بحيث تكون حافة خطاف المصب مرئية فقط داخل صورة brightfield.جمع المعلومات الفلورية ل10 الارتعاشات. زيادة قيمة نقطة تعيين المركز بمقدار 200 وجمع آخر 10 الارتعاشات قيمتها من المعلومات الفلورية. كرر هذه العملية حتى تحتوي الصورة brightfield على خطاف المنبع.جمع قيمة النافذة النهائية من المعلومات الفلورية. إرجاع trabecula إلى موضع مركزي عن طريق تعيين قيمة نقطة تعيين الوسط إلى صفر. خفض وتيرة التحفيز إلى 0.2 هيرتز والتحول من قوة K-H الفائقة إلى محلول التحميل Fura-2.قياس إشارة الفلورسينس كل 10 دقائق. تصور الإشارة على علامة التبويب إشارة PMT. بعد زيادة إشارة نانومتر 360 بعامل 10 ، أعد تردد التحفيز إلى هيرتز واحد وارجع إلى محلول K-H الفائق.تحقق من قياس النسبة كل 10 دقائق حتى تستقر الإشارة ، وعند هذه النقطة ، يمكن أن يبدأ جمع البيانات. إعادة العضلات إلى الموقف حيث حافة هوك المصب هو مجرد وجود داخل صورة brightfield. التقاط معلومات الفلورسينس بالنقر فوق تمكين مصدر الفلورسينس.بدء تشغيل بيانات الأجهزة المتدفقة. على واجهة مستخدم التصوير brightfield، قم بتعيين وضع الالتقاط إلى مشغل خارجي، وزيادة معدل الإطار إلى 100 هيرتز، وتعيين عدد الصور لالتقاط إلى 100. اضغط على التحكم-shift-S، متبوعا F1، لتسجيل بيانات التصوير في الحقول الساطعة لهذه النافذة.قم بزيادة قيمة نقطة تعيين الوسط بمقدار 200 وكرر عملية التقاط brightfield. استمر في استخدام بروتوكول المسح الضوئي حتى يتم جمع بيانات التصوير للنافذة النهائية. إرجاع trabecula إلى موضع مركزي عن طريق تعيين قيمة نقطة تعيين الوسط إلى صفر.قم بتشغيل مصدر إضاءة OCT عن طريق تشغيل المفتاح الرئيسي، والضغط على زر الطاقة، متبوعا بزر SLDs. تغطية رئيس galvanometer وانقر الحصول على خلفية لقياس نمط التداخل الخلفية وطرحه من القياس. تعيين وضع التقاط الصورة إلى طريقة العرض المباشر.قم بمركز الترابيكولا في محاور X و Y عن طريق ضبط قيم الإزاحة X و Y. مع توسيط trabecula، تفحص على طول المحور ص عن طريق ضبط موقف Y للعثور على المواقف المقابلة لالفوام والمصب السنانير. لاحظ هذه المواقف لأسفل.تعيين النطاق Y إلى الفرق المطلق بين هذه القيم مقسوما على 10. تعيين وضع التقاط الصورة إلى التحفيز أثار، مجموعة X إلى 100، وانقر على زر تعيين المعلمات النشطة. انقر فوق دفق البيانات، ثم الحصول على.من أجل التقاط الكالسيوم الإقليمي ومعلومات برايتفيلد لكامل طول trabecula المعروضة هنا، كانت هناك حاجة إلى سبعة مواقف العضلات. ويشير هذا الرقم للقوة المتوسطة من كل موقع من المواقع المتراكبة إلى أن قوة الارتعاش لم تزعجها هذه الحركة، مما يكشف عن عدم وجود اعتماد على موقف فعل إنتاج القوة. تم تقسيم هذه الاشعة التي تم جمعها باستخدام التصوير المقطعي التماسك البصري بمعدل 100 هيرتز باستخدام البرنامج المساعد ImageJ ، ويكا.كل مقطع عرضي يبدو مشوها بسبب الفرق بين الدقة الجانبية والدقة العمق. تم تصحيح ذلك عن طريق قياس كل محور بشكل مستقل مع الدقة الخاصة به. بعد تحجيم الخام C-مسح ترابيكولا, العضلات أسطواني تقريبا.انعكاس جدار غرفة القياس يمكن أن تتداخل في بعض الأحيان مع بيانات العضلات، ولكن يمكن تدريب برنامج تجزئة لحساب هذا. مرة واحدة مجزأة، يمكن حساب المنطقة المقطعية على طول العضلات في جميع أنحاء نشل. لاحظ أن هذا ترابيكولا خاصة لديه فرع صغير.حركة الفرع واضحة في منتصف الطريق تقريبا على طول trabecula. وأخيرا، يمكن تحويل الصور المجزأة إلى شبكات للمساعدة في بناء نماذج هندسية. تم خياطة بيانات التصوير التي تم التقاطها في كل من المواقع السبعة بمعدل 100 إطار في الثانية معا لإنشاء صورة كاملة واحدة من trabecula.ترتبط نسبة الفلورسينس المحذوفة المرتبطة بضوء الإثارة 340 و 380 نانومتر بالكالسيوم داخل الخلايا بعد تحميل الترابيكولا ب Fura-2. يتم محاذاة متوسط 10 عابري الكالسيوم داخل الخلايا من كل نافذة مع المنطقة التي تم تصويرها. في حين أن ذروة العابرين لهذا trabecula تبدو متسقة إلى حد معقول، والكالسيوم الانبساطي خفضت على طولها.وبالمثل، تشير نتائج عمليات تتبع التشرد وحساب طول الساركومير أيضا إلى وجود تباين إقليمي. تقنية التتبع بدون علامات المستخدمة قادرة على حساب إزاحة كل بكسل. تم اختبار مدى ملاءمة تقديرات طول الساركومير على أساس عرض وسعة الغاوسي المناسب لإشارة FFT.لم يتم استيفاء هذه الشروط في منطقة العضلات بين صفر و 500 ميكرون ، لذلك لا يمكن حساب أي معلومات طول الساركومير هناك. وبالنظر إلى التهجيرات المرتبطة بها، فمن المرجح أن الساركومير في هذه المنطقة ممدود خلال مرحلة الانكماش من الارتعاش. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل ترابيكولا القلب وإعدادها للتصوير متعدد الوسائط بشكل موثوق.هذه العملية يؤسس مسارا لجمع مجموعة البيانات اللازمة لبناء نماذج عنصر محدود علم فسيولوجي من تقلص الأنسجة القلبية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

عالية الدقة 3D تصوير السابقين فيفو العينات البيولوجية بواسطة CT مايكرو

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

التصوير الضوئي المجال تواتر<em&gt; خارج الجسم</em&gt; عينات استئصال الرئة: الحصول على صورة واحدة واحدة لارتباط لالتشريح المرضي

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

تنظير العين الضوئي متكاملة والطيفي المجال بالاتساق التصوير المقطعي البصري

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

النطاق العريض للكشف عن الموجات فوق الصوتية البصرية للتطبيقات التصوير الطبي

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

التصوير مبدل طبيعة الكولاجين السواحل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; و<em&gt; خارج الحي</em&gt; عن طريق التهجين أثار صور من المحاكاة محبوس الكولاجين الببتيدات

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير الضوئي

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

استخدام الإرسال الضوئي غير عادية لقياس المؤشرات الحيوية القلب في مصل الدم البشري

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

للتحويل الصوتية والبصرية القرار المجهر الضوئي ل<em&gt; في فيفو</em&gt; الحيوانات الصغيرة الدم الأوعية الدموية التصوير

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the ...

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy oSLO and Optical Coherence Tomography OCT

النقل المتعدد الوسائط "الشبكية الحجمي التصوير المائل المسح الضوئي الليزر تنظير العين" (أوسلو) و "التصوير المقطعي التماسك الضوئية" (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...