Samtidig Brightfield, fluorescens, og optisk sammenhæng Tomografisk Imaging af kontraherende Hjerte Trabeculae Ex Vivo

Det overordnede mål med denne procedure er at demonstrere integrationen af tre billeddannelsessystemer i en enkelt enhed, hvilket muliggør en samtidig måling af den mekaniske funktion, iondynamik og geometrisk ændring af kontraherende hjertevæv. Specifikt måler vi vævets kraftproduktion, calciumtransienter, lokale forskydninger og formændring. Kombination af disse billedbehandlingsmetoder kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i hjertesygdomme, med store konsekvenser for udviklingen af effektive behandlingsstrategier.

Den største fordel ved denne teknik er, at den gør det muligt for os at studere heterogeniteten af muskelaktivitet. Den enhed, der anvendes i denne protokol indeholder tre billedbehandlingssystemer i stand til billeddannelse den samme prøve, en brightfield mikroskop, fluorescens mikroskop, og en optisk sammenhæng tomograph. En række dichroic spejle bruges til at adskille fluorescens emission og brightfield transmission billede.

De grundlæggende træk ved denne enhed er to uafhængigt aktiverede monteringskroge, et målekammer med tre optisk klare akser og en ekstern udløserlinje, der synkroniserer brightfield- og OCT-kameraerne med en stimulator. I denne video demonstrerer vi, hvordan man isolerer, forbereder og billede hjerte trabeculae og præsenterer nogle repræsentative resultater. Efter excising et hjerte fra en bedøvet rotte, overføre det til dissektion kammer.

Brug to buede pincet, træk aorta over perfusionsbeholderen. Hold aorta på plads med en kraft. I mellemtiden skal du åbne slangelinjen for at tillade dissektionsopløsning at strømme gennem perfusionsbeholderen.

Når koronarvakulturen er renset for blod, og hjertet er helt perfunderet med dissektionsopløsning, skal du sikre aortaen på plads ved hjælp af en sutur. Placer hjertet ved at dreje kanylen, så den venstre kranspulsåre er synlig på den overlegne overflade. Fastgør toppen af hjertet til bunden af dissektionskammeret.

Skær begge atrier af. Skær langs højre side af septum til toppen af hjertet. Fastgør den åbnede venstre hjertekammer til bunden af dissektionskammeret.

Derefter skæres langs venstre side af septum, åbne højre ventrikel og pin det til bunden af dissektion kammer, også. Identificer en fritløbende trabecula i højre hjertekammer. Brug fjedersaksen og en kraftp til at skære vægvævet omkring trabeculaen.

Skær derefter vægvævet i halvdelen, ortogonale til retningen af trabecula. Trim vægvævet, indtil dets dimension er passende for den anvendte monteringskonfiguration. Lad den punkterede trabecula stå i dissektionskammeret.

Skyl varmt vand, destilleret vand, og derefter superfusate opløsning gennem målekammeret. Tænd lyskilden til brightfield-mikroskopet, og tryk på F1 for at aktivere indfangning. Juster manuelt den nedstrømskrog, indtil den er centreret i brightfield-billedet.

Klik på nul downstream-akse, og deaktiver derefter downstream for at aktivere motoren. Flyt skyderen for det nedstrøms setpoint, indtil enden af krogen flugter med kanten af det standardområde, der er af interesse. Nulstil downstream-aksen igen, og flyt derefter skyderen for det nedstrøms setpoint til 1.000.

Gentag processen med upstream-krogen, men flyt ikke upstream-setpoint-skyderen efter nulstilling af upstream-aksen igen. Klik på Flyt til montering. Start lysstofbelysningssystemet ved at skifte lampekontakten, før du hurtigt tænder for styresystemet ved at skifte hovedkontakten.

Skift driftstilstand til turboafblæser ved at trykke på tilstandsknappen på frontpanelet efterfulgt af to og derefter en. Tryk på onlineknappen for at aktivere ekstern kontrol. Sæt superfusate flow gennem målekammeret.

Fyld monteringskammeret med dissektionsopløsning. Brug en en-milliliter sprøjte, transport trabecula fra dissektion kammer til montering kammer. Lad trabecula at falde ned i monteringskammeret via tyngdekraften.

Sænk væskeniveauet i monteringskammeret, så det er i niveau med midten af krogene. Juster afstanden mellem krogene for at afspejle trabeculas slæklængde ved at flytte den nedstrøms setpoint skyderen. Ved hjælp af et mikroskop til at støtte visualisering, let greb et af stykkerne af endevæv med pincet og montere den på opstrøms krog.

Monter det andet stykke endevæv på krogen. Når den er monteret sikkert, skal du flytte trabecula tilbage i målekammeret ved at trykke på flyt til kammeret og genoptage superfusate flow. Indstil stimulusfrekvensen til en, stimulusvarighed til 10 og stimulusspænding til 10.

Start stimulering ved at trykke stimulus på. Tænd for lysfeltbelysningssystemet. Tryk på F1, og vælg et interesseområde, der omslutter et overstøvret område af brugergrænsefladen.

Klik på beregningssarkets længde for at beregne den gennemsnitlige sarkomlængde i det fremhævede område. Forøg muskellængden, indtil den gennemsnitlige sarkomlængde er ca. 2,32 mikron. Flyt musklen ved at justere den midterste setpoint skyderen på midten og adskillelse kontrol fanen, således at kanten af downstream krog er lige synlig i brightfield billedet.

Indsaml fluorescensoplysningerne for 10 ryk. Forøg den midterste setpoint-værdi med 200, og indsaml yderligere 10 ryk til en værdi af fluorescensoplysninger. Gentag denne proces, indtil brightfield-billedet indeholder upstream-krogen.

Indsaml det sidste vindues fluorescensoplysninger. Sæt trabeculaen tilbage på en central placering ved at indstille den midterste setpoint-værdi til nul. Reducer stimulusfrekvensen til 0,2 Hertz, og skift fra K-H-superfusatet til Fura-2-lasteløsningen.

Mål lysstofsignalet hvert 10. minut. Visualiser signalet under fanen YDELSE-signal. Efter 360 nanometer signal er steget med en faktor på 10, returnere stimulus frekvens til en Hertz og skifte tilbage til K-H superfusate løsning.

Kontroller forholdet måling hvert 10. minut, indtil signalet stabiliserer sig, hvorefter dataindsamlingen kan begynde. Returner musklen til den position, hvor kanten af downstream krogen er lige til stede i brightfield billedet. Indfang fluorescensoplysninger ved at klikke på aktivér fluorescenskilde.

Begynd at streame hardwaredata. På brightfield imaging-brugergrænsefladen skal du indstille hentningstilstanden til ekstern udløser, øge billedhastigheden til 100 Hertz og indstille antallet af billeder, der skal hentes, til 100. Tryk på ctrl-shift-S efterfulgt af F1 for at registrere brightfield-billeddataene for dette vindue.

Forøg værdien for midtersætpunktet med 200, og gentag indfangningsprocessen for lysfelter. Fortsæt med scanningsprotokollen, indtil billeddataene er indsamlet for det sidste vindue. Sæt trabeculaen tilbage på en central placering ved at indstille den midterste setpoint-værdi til nul.

Tænd for OCT-belysningskilden ved at dreje på hovedtasten og trykke på tænd/sluk-knappen efterfulgt af sld-knappen. Dæk galvanometerhovedet, og klik på få baggrund til at måle baggrundsinterferensmønsteret og trække det fra målingen. Indstil billedoptagelsestilstanden til livevisning.

Centrer trabecula i X- og Y-akserne ved at justere X- og Y-forskydningsværdierne. Med trabecula centreret, scanne langs y-aksen ved at justere Y position for at finde de positioner, der svarer til opstrøms og nedstrøms kroge. Bemærk disse positioner ned.

Angiv område Y til den absolutte forskel mellem disse værdier divideret med 10. Indstil billedoptagelsestilstanden til udløst stimulus, område X til 100, og klik på knappen angiv aktive parametre. Klik på stream data, og hent dem derefter.

For at fange de regionale calcium- og brightfield-oplysninger for hele længden af trabecula præsenteret her, var der behov for syv muskelpositioner. Dette tal af den gennemsnitlige kraft fra hver af de overlejrede positioner tyder på, at rykkraften var uforstyrret af dette forslag, hvilket afslørede, at der ikke var nogen positionsafhængighed af kraftproduktionen. Disse scanninger indsamlet ved hjælp af optisk sammenhæng tomografi med en hastighed på 100 Hertz blev segmenteret ved hjælp af ImageJ plugin, Weka.

Hvert tværsnit vises forvrænget på grund af forskellen mellem side- og dybdeopløsningerne. Dette blev korrigeret ved at skalere hver akse uafhængigt med sin respektive opløsning. Efter skalering af den rå C-scanning af trabecula er musklen omtrent cylindrisk.

Refleksionen af målekammervæggen kan undertiden overlappe muskeldataene, men segmenteringssoftwaren kan trænes til at tage højde for dette. Når det er segmenteret, kan tværsnitsarealet langs musklens længde beregnes i hele ryk. Bemærk, at netop denne trabecula har en lille gren.

Bevægelsen af filialen er tydelig cirka halvvejs langs trabecula. Endelig kan de segmenterede billeder omdannes til masker for at hjælpe med opførelsen af geometriske modeller. Billeddata fanget på hver af de syv positioner med en hastighed på 100 billeder i sekundet blev syet sammen for at skabe et enkelt komplet billede af trabecula.

Forholdet mellem den udeladte fluorescens, der er forbundet med 340- og 380 nanometer excitationslyset, korrelerer med det intracellulære calcium, efter at trabeculaen er blevet fyldt med Fura-2. Gennemsnittet af 10 intracellulære calciumtransienter fra hvert vindue er justeret med den region, de blev afbildet. Mens toppen af transienterne for denne trabecula synes rimeligt konsekvent, den diastoliske calcium reduceret langs dens længde.

På samme måde viser resultaterne af beregningerne af forskydningssporing og sarkomlængde også tilstedeværelsen af regionale variabilitet. Den anvendte markørløse sporingsteknik er i stand til at beregne forskydningen af hver pixel. Egnetheden af sarkomlængdeestimaterne blev testet baseret på bredden og amplituden af den gaussiske pasform til FFT-signalet.

Disse betingelser blev ikke opfyldt i muskelregionen mellem nul og 500 mikron, så ingen sarkomlængdeoplysninger kunne beregnes der. I betragtning af de tilknyttede forskydninger er det sandsynligt, at sarkomerne i denne region aflange i træktens kontraktilefase. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man isolerer hjerte trabeculae og forberede dem til multimodal billedbehandling pålideligt.

Denne proces etablerer en vej til indsamling af et datasæt, der kræves til opførelse af fysiologisk informerede finite elementmodeller for sammentrækning af hjertevæv.