Name: simultaneous brightfield, fluorescence, and optical coherence tomographic imaging of contracting cardiac trabeculae ex vivo
Uploaded: 2021-10-02T15:00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo at JoVE.com

Deze studie werd gefinancierd door Doctoral Scholarships van de University of Auckland (toegekend aan JD en MC), Sir Charles Hercus Health Research Fellowships (20/011 en 21/116) van de Health Research Council of New Zealand (toegekend aan respectievelijk J-CH aan KT), een doctoraatsbeurs toegekend door de National Heart Foundation (toegekend aan AA), Marsden Fast-Start grants (UOA1504 en UOA17) en een James Cook Research Fellowship van de Royal Society of New Zealand (toegekend aan AT). De oorspronkelijke ontwikkeling van dit instrument werd gefinancierd door een Marsden-subsidie (11-UOA-199) van de Royal Society of New Zealand (toegekend aan AT en PN).

<ol>
	<li>Han, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+stress+production+in+isolated+cardiac+trabeculae+from+the+rat.">Energetics of stress production in isolated cardiac trabeculae from the rat.</a> American Journal of Physiology. Heart and circulatory physiology. 299 (5), 1382-1394 (2010).</li><li>Ter Keurs, H. E. D. J., Rijnsburger, W. H., Van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+development+and+sarcomere+length+in+rat+cardiac+trabeculae.+Evidence+of+length-dependent+activation.">Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation.</a> Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).</li><li>Shen, X., Cannell, M. B., Ward, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+SR+load+and+pH+regulatory+mechanisms+on+stretch-dependent+Ca2++entry+during+the+slow+force+response.">Effect of SR load and pH regulatory mechanisms on stretch-dependent Ca2+ entry during the slow force response.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 63, 37-46 (2013).</li><li>Dowrick, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+force+response+to+stretch:+Controversy+and+contradictions.">The slow force response to stretch: Controversy and contradictions.</a> Acta Physiologica. 226 (1), 13250 (2019).</li><li>Stuyvers, B. D. M. Y., Miura, M., Ter Keurs, H. E. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diastolic+viscoelastic+properties+of+rat+cardiac+muscle;+involvement+of+Ca2+.">Diastolic viscoelastic properties of rat cardiac muscle; involvement of Ca2+.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 13-28 (1997).</li><li>Tang, E. J. L. P., Laven, R. C., Hajirassouliha, A., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+displacement+in+isolated+heart+muscle+cells+using+markerless+subpixel+image+registration.">Measurement of displacement in isolated heart muscle cells using markerless subpixel image registration.</a> Conference Record - IEEE International Instrumentation and Measurement Technology Conference. , (2019).</li><li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+excitation-contraction+coupling.">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li><li>Cheuk, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+markerless+tracking+of+the+strain+distribution+of+actively+contracting+cardiac+muscle+preparations.">A method for markerless tracking of the strain distribution of actively contracting cardiac muscle preparations.</a> Experimental Mechanics. 61 (1), 95-106 (2020).</li><li>Lippok, N., Coen, S., Nielsen, P., Vanholsbeeck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersion+compensation+in+Fourier+domain+optical+coherence+tomography+using+the+fractional+Fourier+transform.">Dispersion compensation in Fourier domain optical coherence tomography using the fractional Fourier transform.</a> Optics Express. 20 (21), 23398 (2012).</li><li>Cheuk, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-Dimensional+imaging+of+cardiac+trabeculae+contracting+in+vitro+using+gated+OCT.">Four-Dimensional imaging of cardiac trabeculae contracting in vitro using gated OCT.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 64 (1), 218-224 (2017).</li><li>Ritland, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+between+refractive+index+and+density+of+a+glass+at+constant+temperature.">Relation between refractive index and density of a glass at constant temperature.</a> Journal of the American Ceramic Society. 38 (2), 86-88 (1955).</li><li>Tuchina, D. K., Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+glucose+and+glycerol+diffusion+in+myocardium.">Quantification of glucose and glycerol diffusion in myocardium.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 8 (3), (2015).</li><li>Taberner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamometer+for+nature's+engines.">A dynamometer for nature's engines.</a> IEEE Instrumentation and Measurement Magazine. 22 (2), 10-16 (2019).</li><li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trainable+Weka+Segmentation:+A+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification.">Trainable Weka Segmentation: A machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li><li>Jiang, Y., Julian, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacing+rate,+halothane,+and+BDM+affect+fura+2+reporting+of+[Ca2+](i)+in+intact+rat+trabeculae.">Pacing rate, halothane, and BDM affect fura 2 reporting of [Ca2+](i) in intact rat trabeculae.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273 (6), 2046-2056 (1997).</li><li>Miura, M., Boyden, P. A., Ter Keurs, H. E. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+during+triggered+propagated+contractions+in+intact+trabeculae.">Ca2+ waves during triggered propagated contractions in intact trabeculae.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 274 (1), (1998).</li><li>Han, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radius-dependent+decline+of+performance+in+isolated+cardiac+muscle+does+not+reflect+inadequacy+of+diffusive+oxygen+supply.">Radius-dependent decline of performance in isolated cardiac muscle does not reflect inadequacy of diffusive oxygen supply.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (4), 1222-1236 (2011).</li></ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

In deze studie presenteren we een configuratie waarmee de assemblage van drie optische systemen die brightfield-, fluorescentie- en OCT-beeldvorming combineren, gegevens kan verzamelen van een actief samentrekkende ex vivo cardiale trabecula (figuur 1 en figuur 2). Een dergelijke georkestreerde integratie is mogelijk door het ontwerp van de meetkamer (figuur 3) om de orthogonale opstelling van de LGO naar de brightfield-fluorescentieas mogelijk te maken. Het spieropbouwende systeem speelt een even belangrijke rol in het succes van gelijktijdige kwantificeringen van belangrijke indices bij het karakteriseren van de dynamiek van hartspier excitatie-contractie. De nieuwigheid ervan is het mogelijk maken van spierscanprocedures zonder duidelijke verstoring van de mechanische prestaties van de spier (figuur 6). Met de gecombineerde beeldvormingsconfiguratie en het gemotoriseerde haaksysteem voor krachtmeting kan dit systeem de regionale heterogeniteit in de ca2+ transiënte, verplaatsings- en sarcomerelengte evalueren, samen met macroscopische geometrische informatie van een samentrekkende trabecula gedurende de tijd van de twitch (figuren 7 en figuur 8).
Gezien de alomtegenwoordigheid van brightfield-epifluorescentiebeeldvormingssystemen binnen hartonderzoekslaboratoria, kan de reproductie van deze resultaten worden bereikt met enkele kleine hardwareoverwegingen. Hier presenteren we de beeldverwerkingstoolkit voor het combineren van brightfield-epifluorescentie en OCT, wat essentieel is bij het analyseren van de onderliggende contractiele heterogeniteit. De integratie van de OCT vereist een onbelemmerd optisch pad, terwijl de gated imaging een externe triggerlijn vereist tussen de stimulus en zowel de OCT- als brightfield imaging camera, en spiermontagehaken die het monster door de meetkamer kunnen verplaatsen. De vereiste nabewerkingssoftware en -methoden zijn vrij beschikbaar. Met name de gebruikte segmentatiesoftware, WEKA14,is open-source. De techniek van markerless tracking van materiaalpunten8,sarcomerelengte, gated volumetrische beeldvorming10en meshgeneratiecodes zijn eveneens toegankelijk en kunnen op verzoek van de overeenkomstige auteur beschikbaar worden gesteld.
Spier levensvatbaarheid, optimale belasting van Fura-2, en beeld focus zijn de drie pijlers die de basis vormen van een succesvol experiment. Het gebruik van een dissectieoplossing met BDM om contractuur, transport van de spier in een spuit, continue oxygenatie van de oplossing en het voorbereiden van nieuwe experimentele oplossingen op de dag van een experiment te voorkomen, dragen allemaal bij aan een hoge levensvatbaarheid van de spieren. Alvorens de trabecula met Fura-2AM te laden, moet autofluorescentie worden verzameld voor elke voorwaarde die men wil bestuderen, omdat het een significant effect kan hebben op de gemeten Ca2+ transiënte15. Oxygenatie van Fura-2AM laadoplossing wordt gecompliceerd door de noodzakelijke opname van de oppervlakteactieve stof pluronic-F127 om het laden van kleurstoffen te helpen. Om de resulterende overmatige bubbelvorming veroorzaakt door deze oppervlakteactieve stof te bestrijden, stelt een kleine druppel antischuim in de laadoplossing de gebruiker in staat om de oxygenatiesnelheid te verhogen, waardoor de kans wordt vergroot dat de trabecula functionele levensvatbaarheid behoudt tijdens het laadproces. Ten slotte moet de beeldvormingsfocus gelijkmatig zijn langs de spierlengte om de signaal-ruisverhouding van de brightfield- en fluorescentie-informatie te maximaliseren.
Er zijn twee beperkingen om te overwegen met de hier gepresenteerde methoden. Ten eerste is de ruimtelijke resolutie van de fluorescentiemicroscoop. Hoewel de ruimtelijke resoluties van de OCT en brightfield imaging hoog zijn, is de resolutie van de fluorescentiemicroscoop beperkt tot de integraal van de fluorescentie van het volume dat wordt vastgelegd in een beeldvenster van 540 μm bij 540 μm. Er is ruimte om de ruimtelijke resolutie van de fluorescentiemicroscoop te verhogen door een high-gain charge-coupled apparaatcamera te gebruiken, in plaats van een PMT, om het fluorescentiesignaal vast te leggen ten koste van de signaal-ruisverhouding16. Ten tweede is de diameter van de trabecula die kan worden bestudeerd in termen van meetbare sarcomerelengte en geometrische diepte. De windowed-FFT-benadering voor het berekenen van de sarcoomlengte maakt gebruik van het voordeel van een verbeterde ruimtelijke resolutie, maar wordt geassocieerd met verminderde robuustheid (figuur 8D). In gevallen waarin troebele of trabeculae met een grote diameter moet worden bestudeerd, zal de oplosbaarheid van de FFT sterk worden verminderd als gevolg van het verminderde contrast dat gepaard gaat met de sarctische banderol in grotere weefselmonsters. Evenzo zullen binnen de LGO de tegenreflecties van een beelddiepte van meer dan 300 μm te zwak zijn om tijdens de segmentatiefase te worden opgelost. Daarom is onze techniek beperkt tot trabeculae met een diameter van minder dan 300 μm. Het wordt echter niet aanbevolen om monsters met een grote diameter te bestuderen, omdat er problemen kunnen zijn met diffusieve oxygenatie van de spierkern tijdens hoge stimulatiesnelheden17.
Onze methode maakt de beoordeling van de ionische mechanische functie in combinatie met spiergeometrie in gezonde en zieke spieren mogelijk, wat een krachtige benadering biedt voor het begrijpen van hartspierfysiologie, pathofysiologie en farmacologie. De hier beschreven pijplijn voor beeldverwerking extraheert gegevens die cruciaal zijn voor het verkrijgen van een dieper begrip van contractiele heterogeniteit. Een manier om het potentieel van zo'n rijke dataset volledig te realiseren, is door wiskundige modellen te bouwen die deze gegevens integreren en interpreteren, en om voorspellingen te doen die experimenteel kunnen worden getest met behulp van ons apparaat.

Superfusie van geïsoleerde hartspierweefselpreparaten is een standaard en veel gebruikt protocol voor het bestuderen van cardiale ionische activering enmechanica 1. In het bijzonder heeft de isolatie van trabeculae, staafachtige structuren van de ventriculaire wanden, de beoordeling mogelijk gemaakt van verschijnselen, waaronder de lengteafhankelijke activering van contractie2,rekafhankelijke respons van contractie3,4en diastolische visco-elasticiteit5 van hartweefsel. Ter Keurs, de initiatiefnemer van deze techniek van het superfusing van geïsoleerde trabeculae, gebruikte aanvankelijk een combinatie van fluorescentiebeeldvorming voor Ca2+ metingen en laserdiffractie voor het bepalen van sarcomerelengtes2,5. Sinds deze vroege studies is het steeds gebruikelijker geworden om sarcomere lengte-informatie met een grotere ruimtelijke resolutie te extraheren met behulp van 2D fast Fourier transform (FFT)-gebaseerde technieken6 op brightfield microscopiebeelden. De twee beeldvormingssystemen maken een gedeeltelijke beoordeling mogelijk van de onderliggende relatie tussen Ca2+ afgifte en sarcomere lengte-afhankelijke krachtproductie.
Hartspier is geried, met de zichtbare banderolleren geassocieerd met een onderliggende reeks contractiele eenheden bestaande uit dikke en dikke filamenten. De interactie van deze samenstellende filamenten waaruit sarcoom bestaat, ligt ten grondslag aan krachtgeneratie, die als volgt begint: een depolariserend elektrisch signaal, of actiepotentieel, zorgt ervoor dat spanningsafhankelijke L-type Ca2+ kanalen in het celmembraan openen; de daaropvolgende cellulaire instroom van Ca2+ induceert de afgifte van Ca2+ uit het sarcoplasmatisch reticulum (SR), een intracellulaire Ca2+ opslag, in een proces dat bekend staat als Ca2+-geïnduceerde Ca2+ afgifte7; deze plotselinge toename van de intracellulaire Ca2+ concentratie van nanomoulier tot micromolar bereik maakt krachtproductie mogelijk; Ca2+ pompen extruderen ca2+ continu uit de cytosol terug in het SR- en extracellulaire compartiment; wanneer de intracellulaire Ca2+ concentratie terugkeert naar het nanomolarenwaaier, stopt de krachtproductie en ontspant de spier. Tijdens de krachtproductie glijden de dikke en dunne filamenten over elkaar heen. De sarcoomlengte bepaalt de relatieve mate van overlap en dus het potentieel voor krachtproductie van de spier macroscopisch.
In dit artikel breiden we deze fluorescentie-brightfield beeldvormingstechnieken uit met optische coherentietomografie (OCT). OCT maakt gebruik van het fysische principe van interferentie en is in staat om de geometrische vervorming van weefsel te verkrijgen om spiercontractiele heterogeniteit te begrijpen8. Ons apparaat (figuur 1) maakt gebruik van een spectral-domein OCT (SD-OCT) systeem. In SD-OCT splitst een bundelsplijter het licht van een breedband superluminescente diode van korte coherentielengte in referentie- en meetarmen. De referentiearm bevat een vaste spiegel en de meetarm bevat een 2D-galvanometer om het licht te sturen. Het licht dat uit het monster wordt teruggekaatst, wordt verzameld en interfereert met het gereflecteerde licht in de referentiearm om een interferentiepatroon te vormen. De diepte-informatie is gecodeerd in de frequentie van de spectrale rand. Om de informatie te extraheren, wordt het signaal door een spectrometer doorgegeven en wordt een omgekeerde FFT op het resultaat toegepast. Het overeenkomstige 1D-signaal vertegenwoordigt de structuren op verschillende diepten, wat overeenkomt met veranderingen in brekingsindex9 (A-scan). Door de laser in één as te sturen, kan men een dwarsdoorsnede van het interessemonster (B-scan) construeren en op dezelfde manier, door het proces in een stapsgewijs patroon in de resterende as te herhalen, kan een driedimensionaal beeld worden gegenereerd (C-scan). Bij uitbreiding kan men een reeks B-scans verzamelen in één segment voor een herhalend tijds variërend onderwerp op basis van een externe trigger en herhalen om een driedimensionale scan te genereren, die een tijdsverlengende planaire afbeelding10vertegenwoordigt.
Bij de integratie van de drie beeldvormingssystemen hebben we de volgende twee principes overwogen. Ten eerste mogen beeldsensoren geen licht detecteren van een alternatieve beeldvormingsmodaliteit, en ten tweede moet het fysieke ontwerp vrije ruimte bevatten voor ten minste drie gelijktijdige beeldvormingsvlakken. Om aan de eerste eis te voldoen, gebruikt de brightfield-microscoop een 660 nm golflengte-LED om het monster in een omgekeerde configuratie te verlichten. De fluorescentiemicroscoop bevindt zich in een epifluorescentieconfiguratie waarbij dezelfde objectieve lens wordt gebruikt voor zowel excitatie als verzameling van het uitgestraalde licht. Het excitatielicht heeft een golflengte tussen 340 nm en 380 nm, en een fotomultiplicatorbuis (PMT) meet het uitgestraalde licht op een golflengte van 510 nm. Een paar dichroïsche spiegels stelt deze twee optische paden in staat om dezelfde fysieke voetafdruk te delen zonder de tegenovergestelde meting te verstoren (figuur 2). Ten slotte maakt de LGO gebruik van breedbandlicht (100 nm spectrale breedte) met een centrale golflengte van 840 nm, verschillend van de andere twee modaliteiten. Vanwege de lage coherentie van het licht dat voor OCT wordt gebruikt, zal strooi licht van de brightfield-fluorescentiebronnen niet bijdragen aan het interferentiepatroon dat diepte-informatie codeert. Voor de tweede vereiste heeft het behuizingsontwerp voor de capillaire buis toegankelijke optische paden naar de voorste, inferieure en superieure vlakken van het monster. Tijdens experimenten houden twee platinahaken een trabecula vast in een capillaire buis doordrenkt met zuurstofhoudende Krebs-Henseleit (KH) oplossing. De galvanometerkop van de OCT is orthogonaal gericht op de brightfield-fluorescentie beeldvormingsroute om te profiteren van het derde orthogonale optische vlak (figuur 3).
Dit artikel schetst de ontwerpoverwegingen voor het bouwen van een apparaat dat tegelijkertijd calcium, sarcomerelengte en spiergeometrie kan weergeven. Om deze meetcapaciteiten aan te tonen, beschrijven we het proces van het isoleren van een ventriculaire trabecula, de voorbereiding van de nodige bufferoplossingen, samen met de kritieke stappen die betrokken zijn bij de behandeling en fluorescentiebelasting van een ex vivo trabecula. Ten slotte schetst dit document de processen die nodig zijn om de gegevensset te vertalen naar nuttigere visualisaties.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>150375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215; microscope lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Super Fluor 20&#215;</td>
			<td>NA 0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D Galvanometer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVSM002/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-50 beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FC850-40-50-APC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-10 beam-splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TW850R2A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analogue input module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-9205</td>
			<td>Records the PMT signal at 200 kHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield imaging light source</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>PE-2</td>
			<td>660&#160;nm LAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broadband light source</td>
			<td>Superlum</td>
			<td>Broadlighter-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cameralink card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-1429</td>
			<td>Brightfield imaging frame grabber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen 5</td>
			<td>BOC</td>
			<td>Gas code: 181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condensor lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>LWD 0.52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAQ</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6259</td>
			<td>Triggers the galvanometer movement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror 1</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF409-Di03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF552-Di02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffraction grating</td>
			<td>Wasatch Photonics</td>
			<td>1200 lines/mm @840 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-Q 3 UV System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ZRQSVR3WW</td>
			<td>Distilled water machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6875-SB</td>
			<td>LSE digital dry bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Open-source image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2AM pentapotassium salt</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>F14186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware FPGA card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-7813R</td>
			<td>Also controls the triggering of the brightfield capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>61024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-DH illumination pillar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>MedSource</td>
			<td>VAPDRUGISO250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Line-scan camera</td>
			<td>Basler</td>
			<td>spL2048-70km</td>
			<td>Spectrometer camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3810000</td>
			<td>RCT basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Data processing code</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT FPGA card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-1483R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tank</td>
			<td>BOC</td>
			<td>Gas code: 100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MP220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerload</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P10020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superluminescent diode</td>
			<td>Broadlighter</td>
			<td>D-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transimpedance amplifier</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wistar rat</td>
			<td>Vernon Jansen Unit</td>
			<td></td>
			<td>8 &#8211; 10 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon arc lamp</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>DG-4</td>
			<td>Lambda DG-4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous brightfield, fluorescence, and optical coherence tomographic imaging of contracting cardiac trabeculae ex vivo

In hartspier activeren intracellulaire Ca2+ transiënten contractiele myofilamenten, wat contractie, macroscopische verkorting en geometrische vervorming veroorzaakt. Ons begrip van de interne relaties tussen deze gebeurtenissen is beperkt omdat we niet in de spier kunnen 'zien' noch precies de spatio-temporele aard van excitatie-contractiedynamiek kunnen volgen. Om deze problemen op te lossen, hebben we een apparaat gebouwd dat een reeks beeldverwerkingsmodaliteiten combineert. In het bijzonder integreert het een brightfield-microscoop om lokale veranderingen van sarcomerelengte en weefselspanning te meten, een fluorescentiemicroscoop om de Ca2 + transiënte te visualiseren en een optische coherentietomografie om de geometrische veranderingen van het weefsel tijdens de loop van een hartcyclus vast te leggen. We presenteren hier de beeldvormingsinfrastructuur en het bijbehorende framework voor gegevensverzameling. Gegevens worden verzameld uit geïsoleerde staafachtige weefselstructuren die bekend staan als trabeculae carneae. In ons instrument houden een paar positiegestuurde platinahaken elk uiteinde van een ex vivo spiermonster vast terwijl het continu wordt oversmolten met een voedingsrijke zoutoplossing. De haken staan onder onafhankelijke controle, waardoor real-time controle van spierlengte en kracht mogelijk is. In de lengte kan het monster in de lengte worden gescand, waardoor beperkingen in verband met de relatieve grootte van het microscoopbeeldvenster (540 μm bij 540 μm) en de lengte van een typische trabecula (>2000 μm) worden overschreden. Platinaelektroden aan beide uiteinden van de spierkamer stimuleren de trabecula met een door de gebruiker gedefinieerde snelheid. We gebruiken het stimulatiesignaal als trigger voor het synchroniseren van de gegevens uit elk beeldvenster om het hele monster te reconstrueren dat onder steady-state omstandigheden trilt. Het toepassen van beeldverwerkingstechnieken op deze brightfield beeldvormingsgegevens zorgt voor weefselverplaatsing en sarcomere lengtekaarten. Een dergelijke verzameling van gegevens, wanneer opgenomen in een experiment-modellering pijpleiding, zal een dieper begrip van spier contractiele homogeniteit en heterogeniteit in fysiologie en pathofysiologie.

Om de regionale Ca2+ en brightfield informatie over de gehele lengte van de hier gepresenteerde trabecula vast te leggen, waren zeven spierposities nodig. Figuur 6 suggereert dat de twitch-kracht ongestoord was door deze beweging, waaruit bleek dat er geen positieafhankelijkheid was van de actieve krachtproductie.
B-scans verzameld met optische coherentietomografie met een snelheid van 100 Hz werden gesegmenteerd met behulp van de ImageJ-plug-in WEKA14 (Figuur 7A). Elke doorsnede lijkt vervormd door het verschil tussen de laterale (10 μm) en diepte (1,73 μm (in myocardium)) resoluties. Deze vervorming werd gecorrigeerd door de diepteas van de afbeelding te schalen met de laterale resolutie-diepteresolutieverhouding. Figuur 7B,C toont aan dat na het schalen van de ruwe C-scan van de trabecula deze ongeveer cilindrisch is in de meetkunde. De reflectie van de wand van de meetkamer kan soms overlappen met de spiergegevens (figuur 7A, B), maar de segmentatiesoftware kan worden getraind om dit te verantwoorden ( figuur7D, E). Eenmaal gesegmenteerd, kan het dwarsdoorsnedegebied langs de lengte van de spier worden berekend gedurende de twitch (Figuur 7F). Merk op dat deze specifieke trabecula een kleine aanhangsel vertakking van het heeft. De beweging van de tak is duidelijk ~0,75 mm langs de trabecula. Ten slotte kunnen de gesegmenteerde afbeeldingen worden omgezet in mazen om de constructie van geometrische modellen te helpen (figuur 7G).
Beeldvormingsgegevens die op elk van de verschillende trabeculaposities met een snelheid van 100 fps werden vastgelegd, werden aan elkaar genaaid om een enkel volledig beeld van de trabecula te creëren (figuur 8A). De resolutie van deze beelden is 0,535 μm/pixel. Het gebruik van lineaire wegingsfuncties in de overlappende gebieden van naburige vensters helpt visualisatie en minimaliseert de impact van het vignet dat aanwezig is in de brightfield-afbeeldingen. Om het fluorescerende signaal te meten, wordt een venster van 540 μm bij 540 μm van de trabecula cyclisch verlicht met 340 nm, 365 nm en 380 nm golflengtelicht met een snelheid van 600 Hz. De verhouding van de uitgezonden fluorescentie geassocieerd met het excitatielicht van 340 nm en 380 nm correleert met het intracellulaire calcium nadat de trabecula is geladen met Fura-2. Omdat deze meting een verhouding is, is de effectieve meetsnelheid 200 Hz. De gemiddeld (n = 10) intracellulaire Ca2+ transiënten uit elk venster zijn uitgelijnd met het gebied waarin ze zijn afgebeeld (figuur 8B). Hoewel de piek van de transiënten redelijk consistent lijkt, is de diastolische [Ca2+] lager in het gebied tussen 900 μm en 1800 μm langs de trabecula. Evenzo wijzen de resultaten van de berekeningen van verplaatsingsvolging (figuur 8C) en sarcomerelengte (figuur 8D) ook op de aanwezigheid van regionale variabiliteit. De gebruikte markerloze trackingtechniek is in staat om de verplaatsing van elke pixel te verwerken, met voldoende contrast. Bij het in kaart brengen van de verdeling van sarcomerelengten in post werd een kruiscorrelatiegebied van 128 pixels bij 128 pixels (~ 67 μm bij 67 μm) gebruikt om de regionale sarcomerelengte te berekenen. Dit gebied omvat ongeveer 29 sarcomen wanneer het monster dicht bij de optimale sarcoomlengte ligt. De stapgrootte (in zowel de x- als de y-richting)tussen het zwaartepunt van elk kruiscorrelatievenster werd ingesteld op 50 pixels (~ 26 μm) voor het verwerken van deze gegevens. De geschiktheid van schattingen van de sarcoomlengte werd getest op basis van de breedte en amplitude van de Gaussiaanse pasvorm voor het FFT-signaal. Aan deze voorwaarden werd niet voldaan in het spiergebied tussen 0 μm en 500 μm, zodat daar geen informatie over de lengte van sarcomen kon worden berekend. Gezien de bijbehorende verplaatsingen is het waarschijnlijk dat de sarcomen in dit gebied langwerpig zijn tijdens de contractiele fase. In overeenstemming met deze speculatie verkorten de gemiddelde sarcomerelengtes aan de rechterkant van de trabecula in die periode. Door de informatie van elk van de panelen te combineren, blijkt dat het gebied met het grootste dwarsdoorsnedegebied niet de belangrijkste kracht produceert. In de veronderstelling dat de regionale variatie van Ca2+ transiënten een ongeveer vloeiende gradiënt heeft, geeft figuur 8B aan dat de grootste amplitude Ca2+ transiënt ergens tussen 1300 μm en 1600 μm langs de trabecula voorkomt. De verplaatsingskaart geeft aan dat het gebied dat de minste beweging ondergaat, goed aansluit op de piek Ca2+ transiënt. Deze regio heeft echter de kleinste dwarsdoorsnedegebieden van de steekproef. Met deze gegevens in gedachten zou men kunnen concluderen dat deze regio de meeste stress veroorzaakte.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig01.jpg"> Figuur 1: Geannoteerde afbeelding van de cardiomyometer. Elk van de belangrijkste optische componenten wordt beschreven. De inzet bevat een close-up, achteraanzicht, van de microscoop objectief in situ,onder de meetkamer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig02.jpg"> Figuur 2: Optische route voor gelijktijdige brightfield en fluorescentie microscopie. De verlichtingsbron voor de fluorescentiemicroscoop is een Xenonbooglamp, waarvan de output cyclisch schakelt tussen 340 nm, 365 nm en 380 nm licht. Het uitgangspad van de booglamp bevat een dichroïsche spiegel met een afgesneden golflengte van 409 nm die het UV-licht reflecteert op een spiegel die het licht in een fluorescentiemicroscoopdoelstelling richt. De lens richt het excitatielicht op het monster en verzamelt het uitgestraalde licht, dat een langere golflengte van 510 nm heeft. Dit uitgezonden licht gaat door de eerste dichroïsche spiegel, maar niet door de tweede, omdat het een afgesneden golflengte van 552 nm heeft. Een veldlens richt het gereflecteerde licht vervolgens op de sensor van de PMT. Ondertussen bevindt de verlichtingsbron (660 nm LED) voor de brightfieldmicroscoop zich boven het monster. Het overgebrachte licht wordt door een condensatorlens op het monster gericht en de 20× fluorescentiedoelstelling vangt het resulterende transmissiebeeld op. De golflengte die wordt gebruikt voor brightfield-verlichting overschrijdt de afgesneden golflengte van elke dichroïsche spiegel, dus het gaat door beide voordat het beeld wordt gericht op de sensor van een CMOS-camera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig03.jpg"> Figuur 3: Ontwerp van de meetkamerhouder. (A) Isometrisch zicht op de meetkamerhouder met optische paden eroverheen. Brightfield-verlichting vindt plaats vanaf het superieure oppervlak(z-as); fluorescentieverlichting vindt plaats vanaf het inferieure oppervlak(z-as) en het OCT-signaal van de meetarm is orthogonale naar de andere verlichtingsas(y-as). Tijdens het experiment houden twee platina haken een trabecula vast in een glazen capillaire buis die fungeert als de meetkamer. Stemspoelmotoren regelen elke haak en hun posities worden gemeten met behulp van laserinterferometrie. De huidige positie wordt vergeleken met een door de gebruiker gedefinieerd instelpunt en met behulp van een PID-controller die is gecodeerd in een FPGA, wordt de fout geminimaliseerd. (B) Meetkamer ter plaatse met de brightfield verlichting ingeschakeld. De achteraanzicht wordt weergegeven in de set van figuur 1 . (C) Schematisch van de superfusaatstroom door de meetkamerhouder. Superfusaat komt in de achterkant van het blok en stroomt in de richting aangegeven door pijlen. De upstream- en downstreamelektroden bepalen de veldstimulatie voor het opwekken van de samentrekking van een gemonteerde trabecula in de meetkamer. Blauwe arcering geeft de gebieden aan waar het superfusaat stroomt tijdens een experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig04.jpg"> Figuur 4: Voorpaneel van de beeldverwervings- en besturingssoftware. (A) Brightfield imaging gebruikersinterface. (B) OCT imaging gebruikersinterface. (C) Hardware controle gebruikersinterface. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig05.jpg"> Figuur 5: Trabecula dissectie- en montageprotocol. (A) Langendorff-doordrenkt rattenhart in de dissectiekamer. (B ) Hetzelfde hart met de atria verwijderd. Stippellijnen geven de excisiebaan aan om de ventrikels te openen. (C) Een geopend hart om het interieur van beide ventrikels bloot te leggen. Het onderbroken vak geeft het gebied aan waar trabeculae meestal worden gevonden. (D) Het rechts-ventriculaire wandgebied (hetzelfde als aangegeven door het onderbroken vak in C). Stippellijnen markeren drie trabeculae. (E) Een trabecula geselecteerd uit de drie in D. (F) De trabecula van paneel E met het wandweefsel verwijderd. (G) De geïsoleerde trabecula aan het einde van een spuit van 1 ml. (H) De trabecula in de montagekamer. (I) De trabecula gemonteerd tussen twee platina haken. (J) De trabecula, gemonteerd tussen haken, in de meetkamer (figuur 3B). De groene vlek is een artefact uit het eerste dichroïsche filter. (K) Secundaire hoek van de gemonteerde trabecula in de meetkamer. De afstand tussen de trabecula en de microscoop objectief is ongeveer 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig06.jpg"> Figuur 6: Positieafhankelijkheid van de krachtmeting. De kracht die door de spier wordt geproduceerd vanuit elk van de beeldvormingsposities (n = 7) bedekt. De gemiddelde productie van actieve kracht bedroeg 0,527 mN ± 0,003 mN, tijd tot 50 % krimp 77,1 ms ± 0,3 ms en tijd tot 50 % ontspanning 328,1 ms ± 0,9 ms (alle gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig7v2.jpg"> Figuur 7: OCT beeldvormingsanalyse. (A) Voorbeeld van WEKA-segmentatie. De gesegmenteerde doorsnede van de spier wordt rood gemarkeerd en de achtergrond wordt groen gemarkeerd. (B) Superieure weergave van de ruwe C-scan gegevens van een trabecula. De heldere schuine lijn naar de bovenkant van het beeld is de reflectie van de wand van de meetkamer. (C) Zijdelingse weergave van de ruwe C-scangegevens van een trabecula. (D) Superieure weergave van de gesegmenteerde LGO-gegevens. (E) Zijdelingse weergave van de gesegmenteerde LGO-gegevens. (F) Het dwarsdoorsnedegebied over de lengte van de trabecula (x-as)door de tijd (y-as). Het gemiddelde dwarsdoorsnedegebied langs de spierlengte was 0,0326 mm2 ± 0,0005 mm2 (gemiddelde ± S.E.) (G) Een gaas van de trabecula. De mesh is ongeveer uitgelijnd met het dwarsdoorsnedegebiedplot van paneel F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig7v2lage.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig08.jpg"> Figuur 8: Brightfield en fluorescentie beeldvormingsanalyse. (A) Gestikt beeld (zeven beeldvensters) van de trabecula. (B) Ca2+ transiënten over de lengte van de trabecula. (C) Gemiddelde x-verplaatsing van elk beeldvenster. Een positieve verplaatsing vertegenwoordigt een beweging naar rechts en negatief naar links. (D) Gemiddelde sarcomerelengtes van elk beeldvenster met het nodige beeldcontrast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
Tabel 1: Tabel met oplossingen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/Tables_of_solutions.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo at JoVE.com

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

Dit protocol presenteert een verzameling sarcomere, calcium en macroscopische geometrische gegevens van een actief samentrekkende cardiale trabecula ex vivo. Deze gelijktijdige metingen worden mogelijk gemaakt door de integratie van drie beeldvormende modaliteiten.

Gelijktijdige Brightfield, Fluorescentie en Optische Coherentie Tomografische Beeldvorming van Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and ...

Het algemene doel van deze procedure is om de integratie van drie beeldvormingssystemen in één apparaat aan te tonen, waardoor een gelijktijdige meting van de mechanische functie, ionische dynamiek en geometrische verandering van samentrekkend hartweefsel mogelijk is. In het bijzonder meten we de krachtproductie van het weefsel, calcium transients, lokale verplaatsingen en vormverandering. De combinatie van deze beeldvormende modaliteiten kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen bij hartaandoeningen, met grote gevolgen voor de ontwikkeling van effectieve behandelingsstrategieën.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om de heterogeniteit van spieractiviteit te bestuderen. Het apparaat dat in dit protocol wordt gebruikt, bevat drie beeldvormingssystemen die hetzelfde monster kunnen weergeven, een brightfield-microscoop, fluorescentiemicroscoop en een optische coherentietomografie. Een reeks dichroïsche spiegels wordt gebruikt om de fluorescentie-emissie en het brightfield-transmissiebeeld te scheiden.De fundamentele kenmerken van dit apparaat zijn twee onafhankelijk bediende montagehaken, een meetkamer met drie optisch heldere assen en een externe triggerlijn die de brightfield- en OCT-camera's synchroniseert met een stimulator. In deze video laten we zien hoe we harttrabeculae kunnen isoleren, voorbereiden en in beeld kunnen brengt en presenteren we enkele representatieve resultaten. Nadat je een hart hebt geëesdeerd van een verdoofde rat, breng je het over naar de dissectiekamer.Trek met twee gebogen tangen de aorta over de perfusiekanule. Houd de aorta op zijn plaats met één tang. Open ondertussen de buisleiding om dissectieoplossing door de perfusiekanule te laten stromen.Zodra de coronaire vasculatuur is ontdaan van bloed en het hart volledig is doordrenkt met dissectieoplossing, zet u de aorta vast met behulp van een hechting. Plaats het hart door de canule zo te draaien dat de linker kransslagader zichtbaar is op het superieure oppervlak. Speld de top van het hart op de bodem van de dissectiekamer.Snij beide atria af. Snijd langs de rechterkant van het septum naar de top van het hart. Speld de geopende linkerventrikel vast aan de basis van de dissectiekamer.Knip vervolgens langs de linkerkant van het septum, open de rechterventrikel en speld deze ook vast aan de basis van de dissectiekamer. Identificeer een vrijlopende trabecula in de rechterventrikel. Knip met behulp van de veerschaar en een tang het wandweefsel rond de trabecula.Snijd vervolgens het wandweefsel doormidden, orthogonale naar de richting van de trabecula. Knip het wandweefsel af tot de afmeting geschikt is voor de gebruikte montageconfiguratie. Laat de accijnstrabecula in de dissectiekamer.Spoel heet water, gedestilleerd water en vervolgens superfusaatoplossing door de meetkamer. Schakel de lichtbron van de brightfieldmicroscoop in en druk op F1 om opname mogelijk te maken. Pas de downstreamhaak handmatig aan totdat deze in het brightfield-beeld is gecentreerd.Klik op nul stroomafwaartse as en schakel vervolgens stroomafwaarts uit om de motor in te schakelen. Verplaats de schuifregelaar downstream-instelpunt totdat het einde van de haak is uitgelijnd met de rand van het standaard interessegebied. Plaats de stroomafwaartse as opnieuw nul en verplaats de schuifregelaar voor het stroomafwaartse instelpunt naar 1.000.Herhaal het proces met de upstream-haak, maar verplaats de schuifregelaar upstream-instelpunt niet nadat u de upstream-as opnieuw hebt nul. Klik op verplaatsen naar montage. Start het fluorescentieverlichtingssysteem door de lampschakelaar te draaien voordat u snel de subsystemen van de controller inschakelt door de hoofdschakelaar te draaien.Schakel de bedrijfsmodus om naar turbo blanking door op de modusknop op het voorpaneel te drukken, gevolgd door twee en vervolgens één. Druk op de online knop om externe bediening in te schakelen. Pauzeer de superfusaatstroom door de meetkamer.Vul de montagekamer met dissectieoplossing. Transporteer de trabecula met een spuit van één milliliter van de dissectiekamer naar de montagekamer. Laat de trabecula via de zwaartekracht in de montagekamer afdalen.Verlaag het vloeistofniveau in de montagekamer zodat het waterpas staat met het midden van de haken. Pas de afstand tussen de haken aan om de slappe lengte van de trabecula weer te geven door de schuifregelaar stroomafwaarts in te stellen. Gebruik een microscoop om visualisatie te helpen, pak een van de stukjes eindweefsel licht vast met een tang en monteer deze op de upstreamhaak.Monteer het andere stukje eindweefsel op de stroomafwaartse haak. Eenmaal stevig gemonteerd, verplaatst u de trabecula terug naar de meetkamer door op verplaatsen naar kamer te drukken en de superfusaatstroom te hervatten. Stel de stimulusfrequentie in op één, stimulusduur op 10 en stimulusspanning op 10.Start de stimulatie door op stimulus te drukken. Schakel het brightfield-verlichtingssysteem in. Druk op F1 en selecteer een interessegebied dat een geried gebied van de gebruikersinterface omsluit.Klik op sarcoomlengte berekenen om de gemiddelde sarcoomlengte in het gemarkeerde gebied te berekenen. Verhoog de spierlengte tot de gemiddelde sarcoomlengte ongeveer 2,32 micron is. Verplaats de spier door de schuifregelaar voor het middeninstelpunt op het tabblad midden- en scheidingsbesturingselement aan te passen, zodat de rand van de stroomafwaartse haak net zichtbaar is in de brightfield-afbeelding.Verzamel de fluorescentie-informatie voor 10 twitches. Verhoog de centruminstelpuntwaarde met 200 en verzamel nog eens 10 twitches aan fluorescentie-informatie. Herhaal dit proces totdat de brightfield-afbeelding de upstream-haak bevat.Verzamel de laatste ruiten aan fluorescentie-informatie. Breng de trabecula terug naar een centrale positie door de middelste instelpuntwaarde op nul in te stellen. Verminder de stimulusfrequentie tot 0,2 Hertz en schakel over van het K-H superfusaat naar de Fura-2 laadoplossing.Meet het fluorescentiesignaal elke 10 minuten. Visualiseer het signaal op het PMT-signaaltabblad. Nadat het signaal van 360 nanometer met een factor 10 is toegenomen, geeft u de stimulusfrequentie terug aan één Hertz en schakelt u terug naar de K-H superfusaatoplossing.Controleer de verhoudingsmeting elke 10 minuten totdat het signaal stabiliseert, waarna de gegevensverzameling kan beginnen. Breng de spier terug naar de positie waar de rand van de stroomafwaartse haak net aanwezig is in het brightfield-beeld. Leg fluorescentie-informatie vast door op fluorescentiebron inschakelen te klikken.Begin met het streamen van hardwaregegevens. Stel op de gebruikersinterface van Brightfield Imaging de opnamemodus in op externe trigger, verhoog de framesnelheid tot 100 Hertz en stel het aantal beelden in op 100. Druk op control-shift-S, gevolgd door F1, om de brightfield imaging-gegevens voor dit venster op te nemen.Verhoog de middelste instelpuntwaarde met 200 en herhaal het proces voor het vastleggen van brightfields. Ga door met het scanprotocol totdat de beeldvormingsgegevens zijn verzameld voor het laatste venster. Breng de trabecula terug naar een centrale positie door de middelste instelpuntwaarde op nul in te stellen.Schakel de OCT-verlichtingsbron in door aan de hoofdtoets te draaien, op de aan / uit-knop te drukken, gevolgd door de SLDs-knop. Bedek de galvanometerkop en klik op achtergrond kregen om het achtergrondinterferentiepatroon te meten en af te trekken van de meting. Stel de beeldopnamemodus in op livebeeld.Centreer de trabecula in de X- en Y-assen door de X- en Y-offsetwaarden aan te passen. Scan met de trabecula gecentreerd langs de y-as door de Y-positie aan te passen om de posities te vinden die overeenkomen met de upstream- en downstreamhaken. Noteer deze posities naar beneden.Stel bereik Y in op het absolute verschil tussen deze waarden gedeeld door 10. Stel de beeldopnamemodus in op stimulus geactiveerd, bereik X tot 100 en klik op de knop actieve parameters instellen. Klik op gegevens streamen en verken deze vervolgens.Om de regionale calcium- en brightfield-informatie over de gehele lengte van de hier gepresenteerde trabecula vast te leggen, waren zeven spierposities vereist. Dit cijfer van de gemiddelde kracht van elk van de posities bedekt suggereert dat twitch kracht ongestoord was door deze beweging, waaruit blijkt dat er geen positie afhankelijkheid van de daad van kracht productie. Deze scans verzameld met behulp van optische coherentie tomografie met een snelheid van 100 Hertz werd gesegmenteerd met behulp van de ImageJ plugin, Weka.Elke doorsnede lijkt vervormd door het verschil tussen de laterale en diepteresoluties. Dit werd gecorrigeerd door elke as onafhankelijk te schalen met de bijbehorende resolutie. Na het schalen van de ruwe C-scan van de trabecula is de spier ongeveer cilindrisch.De reflectie van de wand van de meetkamer kan soms overlappen met de spiergegevens, maar de segmentatiesoftware kan worden getraind om dit te verantwoorden. Eenmaal gesegmenteerd, kan het dwarsdoorsnedegebied langs de lengte van de spier gedurende de twitch worden berekend. Merk op dat deze specifieke trabecula een kleine tak heeft.De beweging van de tak is ongeveer halverwege de trabecula duidelijk. Ten slotte kunnen de gesegmenteerde afbeeldingen worden omgezet in mazen om de constructie van geometrische modellen te helpen. Beeldvormingsgegevens die op elk van de zeven posities met een snelheid van 100 frames per seconde werden vastgelegd, werden aan elkaar gestikt om een enkel volledig beeld van de trabecula te creëren.De verhouding van de weggelaten fluorescentie geassocieerd met het excitatielicht van 340 en 380 nanometer correleert met het intracellulaire calcium nadat de trabecula is geladen met Fura-2. Het gemiddelde van 10 intracellulaire calcium transients uit elk venster is afgestemd op het gebied waarin ze werden afgebeeld. Hoewel de piek van de transiënten voor deze trabecula redelijk consistent lijkt, verminderde het diastolische calcium langs de lengte.Evenzo wijzen de resultaten van de berekeningen van verplaatsingstracking en sarcomerelengte ook op de aanwezigheid van regionale variabiliteit. De gebruikte markerloze trackingtechniek kan de verplaatsing van elke pixel berekenen. De geschiktheid van de schattingen van de sarcoomlengte werd getest op basis van de breedte en amplitude van de Gaussiaanse pasvorm voor het FFT-signaal.Aan deze voorwaarden werd niet voldaan in het spiergebied tussen nul en 500 micron, zodat daar geen informatie over de lengte van sarcomen kon worden berekend. Gezien de bijbehorende verplaatsingen is het waarschijnlijk dat de sarcomen in dit gebied langwerpig zijn tijdens de contractiele fase van de twitch. Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u harttrabeculae kunt isoleren en ze op betrouwbare wijze kunt voorbereiden op multimodale beeldvorming.Dit proces legt een pad vast voor het verzamelen van een dataset die nodig is voor de constructie van fysiologisch geïnformeerde eindige-elementenmodellen van hartweefselcontractie.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Hoge resolutie 3D-beeldvorming van Ex-Vivo Biologische monsters door Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Drie-dimensionale Optische resolutie Fotoakoestisch Microscopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Optische Frequency Domain Imaging van<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pulmonale Resectie Specimens: Het verkrijgen van een op een afbeelding om histopathologie Correlatie

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Geïntegreerde Fotoakoestische oftalmoscopie en Spectral-domein Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Wideband Optische Detector van Echografie voor Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Beeldvorming Gedenatureerd Collageen Strengen<em&gt; In vivo</em&gt; En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Via-Foto getriggerd Hybridisatie van Caged Collageen Mimetic Peptiden

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescentie-blussen van een liposomaal ingekapseld nabij-infrarood Fluorofoor als een instrument voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Met behulp van buitengewone optische transmissie te kwantificeren cardiale Biomarkers in menselijk Serum

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Schakelbare akoestische en optische resolutie Photoacoustic Microscopy voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Kleine dieren Bloedvasculaire Imaging

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the ...

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy oSLO and Optical Coherence Tomography OCT

Multimodale volumetrische Retinal Imaging door schuine scannen Laser Ophthalmoscopy (oSLO) en optische coherentie tomografie (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...