Name: simultaneous brightfield, fluorescence, and optical coherence tomographic imaging of contracting cardiac trabeculae ex vivo
Uploaded: 2021-10-02T15:00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo at JoVE.com

Denne studien ble finansiert av Doktorgradsstipend fra University of Auckland (tildelt JD og MC), Sir Charles Hercus Health Research Fellowships (20/011 og 21/116) fra Health Research Council of New Zealand (tildelt J-CH til KT, henholdsvis), et doktorgradsstipend tildelt av National Heart Foundation (tildelt AA), Marsden Fast-Start-tilskudd (UOA1504 og UOA1703) fra Royal Society of New Zealand (tildelt J-CH og KT, henholdsvis), og et James Cook Research Fellowship fra Royal Society of New Zealand (tildelt AT). Den opprinnelige utviklingen av dette instrumentet ble finansiert av et Marsden-stipend (11-UOA-199) fra Royal Society of New Zealand (tildelt AT og PN).

<ol>
	<li>Han, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+stress+production+in+isolated+cardiac+trabeculae+from+the+rat.">Energetics of stress production in isolated cardiac trabeculae from the rat.</a> American Journal of Physiology. Heart and circulatory physiology. 299 (5), 1382-1394 (2010).</li><li>Ter Keurs, H. E. D. J., Rijnsburger, W. H., Van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+development+and+sarcomere+length+in+rat+cardiac+trabeculae.+Evidence+of+length-dependent+activation.">Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation.</a> Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).</li><li>Shen, X., Cannell, M. B., Ward, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+SR+load+and+pH+regulatory+mechanisms+on+stretch-dependent+Ca2++entry+during+the+slow+force+response.">Effect of SR load and pH regulatory mechanisms on stretch-dependent Ca2+ entry during the slow force response.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 63, 37-46 (2013).</li><li>Dowrick, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+force+response+to+stretch:+Controversy+and+contradictions.">The slow force response to stretch: Controversy and contradictions.</a> Acta Physiologica. 226 (1), 13250 (2019).</li><li>Stuyvers, B. D. M. Y., Miura, M., Ter Keurs, H. E. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diastolic+viscoelastic+properties+of+rat+cardiac+muscle;+involvement+of+Ca2+.">Diastolic viscoelastic properties of rat cardiac muscle; involvement of Ca2+.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 13-28 (1997).</li><li>Tang, E. J. L. P., Laven, R. C., Hajirassouliha, A., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+displacement+in+isolated+heart+muscle+cells+using+markerless+subpixel+image+registration.">Measurement of displacement in isolated heart muscle cells using markerless subpixel image registration.</a> Conference Record - IEEE International Instrumentation and Measurement Technology Conference. , (2019).</li><li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+excitation-contraction+coupling.">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li><li>Cheuk, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+markerless+tracking+of+the+strain+distribution+of+actively+contracting+cardiac+muscle+preparations.">A method for markerless tracking of the strain distribution of actively contracting cardiac muscle preparations.</a> Experimental Mechanics. 61 (1), 95-106 (2020).</li><li>Lippok, N., Coen, S., Nielsen, P., Vanholsbeeck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersion+compensation+in+Fourier+domain+optical+coherence+tomography+using+the+fractional+Fourier+transform.">Dispersion compensation in Fourier domain optical coherence tomography using the fractional Fourier transform.</a> Optics Express. 20 (21), 23398 (2012).</li><li>Cheuk, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-Dimensional+imaging+of+cardiac+trabeculae+contracting+in+vitro+using+gated+OCT.">Four-Dimensional imaging of cardiac trabeculae contracting in vitro using gated OCT.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 64 (1), 218-224 (2017).</li><li>Ritland, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+between+refractive+index+and+density+of+a+glass+at+constant+temperature.">Relation between refractive index and density of a glass at constant temperature.</a> Journal of the American Ceramic Society. 38 (2), 86-88 (1955).</li><li>Tuchina, D. K., Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+glucose+and+glycerol+diffusion+in+myocardium.">Quantification of glucose and glycerol diffusion in myocardium.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 8 (3), (2015).</li><li>Taberner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamometer+for+nature's+engines.">A dynamometer for nature's engines.</a> IEEE Instrumentation and Measurement Magazine. 22 (2), 10-16 (2019).</li><li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trainable+Weka+Segmentation:+A+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification.">Trainable Weka Segmentation: A machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li><li>Jiang, Y., Julian, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacing+rate,+halothane,+and+BDM+affect+fura+2+reporting+of+[Ca2+](i)+in+intact+rat+trabeculae.">Pacing rate, halothane, and BDM affect fura 2 reporting of [Ca2+](i) in intact rat trabeculae.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273 (6), 2046-2056 (1997).</li><li>Miura, M., Boyden, P. A., Ter Keurs, H. E. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+during+triggered+propagated+contractions+in+intact+trabeculae.">Ca2+ waves during triggered propagated contractions in intact trabeculae.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 274 (1), (1998).</li><li>Han, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radius-dependent+decline+of+performance+in+isolated+cardiac+muscle+does+not+reflect+inadequacy+of+diffusive+oxygen+supply.">Radius-dependent decline of performance in isolated cardiac muscle does not reflect inadequacy of diffusive oxygen supply.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (4), 1222-1236 (2011).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

I denne studien presenterer vi en konfigurasjon som gjør det mulig å montere tre optiske systemer som kombinerer brightfield, fluorescens og OCT-avbildning for å samle inn data fra en aktivt kontraherende ex vivo hjertetrabecula (figur 1 og figur 2). En slik orkestrert integrasjon er mulig på grunn av utformingen av målekammeret (figur 3) for å muliggjøre det ortogonale arrangementet av OCT til brightfield-fluorescensaksen. Muskelmonteringssystemet spiller en like viktig rolle i suksessen med samtidige kvantifiseringer av viktige indekser i karakterisering av hjertemuskeleksitasjons-sammentrekningsdynamikk. Nyheten ligger i å muliggjøre muskelskanningsprosedyrer uten tilsynelatende forstyrrelser i muskelens mekaniske ytelse (figur 6). Med den kombinerte bildekonfigurasjonen og motorisert kroksystem for kraftmåling, kan dette systemet evaluere regional heterogenitet i Ca2+ forbigående, forskyvning og sarkomerlengde, sammen med makroskopisk geometrisk informasjon om en kontraherende trabecula gjennom hele rykningen (Figur 7 og Figur 8).
Gitt allestedsnærværende brightfield-epifluorescence bildesystemer innen hjerteforskningslaboratorier, kan reproduksjonen av disse resultatene oppnås med noen mindre maskinvarehensyn. Her presenterer vi bildebehandlingsverktøysettet for å kombinere brightfield-epifluorescence og OCT, noe som er viktig for å analysere den underliggende kontraktile heterogeniteten. Integrasjonen av Oct krever en uhindret optisk bane, mens den inngjerdede avbildningen krever en ekstern utløserlinje mellom stimulansen og både OCT og brightfield bildekamera, og muskelmonteringskroker som er i stand til å flytte prøven gjennom målekammeret. Den nødvendige etterbehandlingsprogramvaren og metodene er fritt tilgjengelige. Spesielt er segmenteringsprogramvaren som brukes, WEKA14, åpen kildekode. Teknikken for markørløs sporing av materialpunkter8, sarcomere lengde, inngjerdet volumetrisk bildebehandling10og mesh-generasjonskoder er like tilgjengelige og kan gjøres tilgjengelig på forespørsel fra den tilsvarende forfatteren.
Muskel levedyktighet, optimal lasting av Fura-2, og bildefokus er de tre søylene som danner grunnlaget for et vellykket eksperiment. Ved hjelp av en disseksjonsløsning som inneholder BDM for å forhindre kontraktur, transport av muskelen i en sprøyte, kontinuerlig oksygenering av løsningen og utarbeide nye eksperimentelle løsninger på dagen for et eksperiment, bidrar alle til høy muskel levedyktighet. Før du laster trabecula med Fura-2AM, må autofluorescence samles inn for hver tilstand man er interessert i å studere, da det kan ha en betydelig effekt på den målte Ca2 + forbigående15. Oksygenering av Fura-2AM lasteløsning er komplisert ved nødvendig inkludering av overflateaktiv pluronic-F127 for å hjelpe fargestoffbelastning. For å bekjempe den resulterende overflødige bobleformasjonen forårsaket av dette overflateaktive middelet, gjør en liten dråpe anti-skum i lasteløsningen brukeren i å øke oksygeneringshastigheten, og dermed forbedre sjansen for at trabecula opprettholder funksjonell levedyktighet gjennom hele lastingsprosessen. Til slutt må bildefokuset være jevnt langs muskellengden for å maksimere signal-til-støy-forholdet mellom brightfield- og fluorescensinformasjonen.
Det er to begrensninger å vurdere med metodene som presenteres her. Først er den romlige oppløsningen av fluorescensmikroskopet. Mens de romlige oppløsningene til OCT og brightfield-avbildningen er høye, er oppløsningen av fluorescensmikroskopet begrenset til integralet av fluorescensen fra volumet som er fanget innen et 540 μm ved 540 μm bildevindu. Det er romlig oppløsning av fluorescensmikroskopet ved å bruke et høy-gain ladekoblet enhetskamera, i stedet for en PMT, for å fange fluorescenssignalet på bekostning av signal-til-støy-forholdet16. For det andre er diameteren på trabecula som kan studeres når det gjelder målbar sarkomerlengde og geometrisk dybde. Den vindusbaserte FFT-tilnærmingen for databehandling av sarcomere-lengde utnytter fordelen med forbedret romlig oppløsning, men er forbundet med redusert robusthet (Figur 8D). I tilfeller der turbid eller stor diameter trabeculae skal studeres, vil solvensen av FFT bli sterkt redusert på grunn av den reduserte kontrasten forbundet med sarkomerisk banding i større vevsprøver. På samme måte, i Oct, vil bakrefleksjonene fra en bildedybde på mer enn 300 μm være for svake til å løses i segmenteringsfasen. Derfor er teknikken vår begrenset til trabeculae av en diameter mindre enn 300 μm. Det anbefales imidlertid ikke å studere prøver med stor diameter, da det kan være problemer med diffusiv oksygenering av muskelkjernen under høye stimuleringshastigheter17.
Vår metode muliggjør vurdering av ionisk mekanisk funksjon i forbindelse med muskelgeometri i sunn og syk muskel, noe som gir en kraftig tilnærming til å forstå hjertemuskelfysiologi, patofysiologi og farmakologi. Bildebehandlingssamlebåndet som er skissert her, trekker ut data som vil være avgjørende for å få en dypere forståelse av kontraktil heterogenitet. En mulighet til å fullt ut realisere potensialet til et så rikt datasett er i byggingen av matematiske modeller som integrerer og tolker disse dataene, og å lage spådommer som kan testes eksperimentelt ved hjelp av enheten vår.

Superfusjon av isolerte hjertemuskelvevspreparater er en standard og mye brukt protokoll for å studere hjerteionisk aktivering ogmekanikk 1. Spesielt har isolasjonen av trabekulære, stanglignende strukturer fra ventrikkelveggene aktivert vurdering av fenomener, inkludert lengdeavhengig aktivering av sammentrekning2, strekkavhengig respons av sammentrekning3,4og diastolisk viskoelastisitet5 av hjertevev. Ter Keurs, initiativtaker til denne teknikken for superfusing isolert trabeculae, først brukt en kombinasjon av fluorescens avbildning for Ca2 + målinger og laser diffraksjon for å bestemme sarcomere lengder2,5. Siden disse tidlige studiene har det blitt stadig vanligere å trekke ut sarkomerlengdeinformasjon med større romlig oppløsning ved hjelp av 2D-raske Fouriertransformasjonsteknikker (FFT)6 på brightfield-mikroskopibilder. De to bildesystemene tillater en delvis vurdering av det underliggende forholdet mellom Ca2+ release og sarcomere lengdeavhengig kraftproduksjon.
Hjertemuskelen er striated, med synlig banding forbundet med en underliggende serie av kontraktile enheter som består av tykke og tykke filamenter. Samspillet mellom disse bestanddelene som utgjør sarcomeres ligger til grunn for kraftgenerering, som starter som følger: et depolariserende elektrisk signal, eller handlingspotensial, fører til at spenningsavhengige L-type Ca2 + kanaler i cellemembranen åpnes; den påfølgende cellulære tilstrømningen av Ca2+ induserer utgivelsen av Ca2+ fra sarkoplasmic retikulum (SR), en intracellulær Ca2 + butikk, i en prosess kjent som Ca2 +-indusert Ca2 + utgivelse7; denne plutselige økningen i intracellulær Ca2 + konsentrasjon fra nanomolar til mikromolar rekkevidde gjør det mulig å produsere kraft; Ca2+ pumper ekstruderer kontinuerlig Ca2+ ut av cytosolen tilbake i SR og ekstracellulært rom; når den intracellulære Ca2 + konsentrasjonen vender tilbake til nanomolarområdet, opphører kraftproduksjonen, og muskelen slapper av. Under kraftproduksjon glir de bestanddelene tykke og tynne filamenter over hverandre. Sarcomere-lengden dikterer den relative omfanget av overlapping og derfor potensialet for kraftproduksjon av muskelen makroskopisk.
I dette dokumentet utvider vi disse fluorescens-brightfield avbildningsteknikkene for å inkludere optisk koherenstomografi (OCT). OCT utnytter det fysiske prinsippet om forstyrrelser og er i stand til å skaffe geometrisk deformasjon av vev for å forstå muskelkontrahert heterogeneitet8. Enheten vår (figur 1) bruker et spektraldomene OCT (SD-OCT) system. I SD-OCT deler en strålesplitter lyset fra en kort koherenslengde superluminescent diode i referanse- og målearmer. Referansearmen inneholder et fast speil, og målearmen inneholder et 2D-galvanisometer for å styre lyset. Lys som er tilbakevist fra prøven samles inn og forstyrrer det reflekterte lyset i referansearmen for å danne et interferensmønster. Dybdeinformasjonen er kodet i hyppigheten av spektralkanten. For å trekke ut informasjonen, sendes signalet gjennom et spektrometer og en omvendt FFT påføres resultatet. Det tilsvarende 1D-signalet representerer strukturene på forskjellige dybder, tilsvarende endringer i brytningsindeks9 (A-skanning). Ved å styre laseren i en enkelt akse, kan man konstruere et tverrsnitt av prøven av interesse (B-skanning) og på samme måte ved å gjenta prosessen i et trinnvis mønster i den gjenværende aksen, kan et tredimensjonalt bilde genereres (C-skanning). I forlengelsen kan man samle en serie B-skanninger på ett enkelt stykke for et gjentatt tidsvarierende motiv basert på en ekstern utløser og gjenta for å generere en tredimensjonal skanning, som representerer et tidsvarierende planbilde10.
Ved integrering av de tre bildesystemene har vi vurdert følgende to prinsipper. For det første bør bildesensorer ikke oppdage lys fra en alternativ bildemodalitet, og for det andre bør den fysiske designen inneholde ledig plass til minst tre samtidige bildeplan. For å løse det første kravet bruker brightfield-mikroskopet en 660 nm bølgelengde-LED for å belyse prøven i en invertert konfigurasjon. Fluorescensmikroskopet er i en epifluorescenskonfigurasjon der den samme objektive linsen brukes til både eksitasjon og innsamling av det avgitte lyset. Eksitasjonslyset har en bølgelengde på mellom 340 nm og 380 nm, og et fotomultiplierrør (PMT) måler det avgitte lyset med en bølgelengde på 510 nm. Et par dikroiske speil gjør det mulig for disse to optiske banene å dele samme fysiske fotavtrykk uten å forstyrre motsatt måling (figur 2). Til slutt bruker OCT bredbåndslys (100 nm spektral bredde) med en sentral bølgelengde på 840 nm, forskjellig fra de to andre modalitetene. På grunn av lysets lave sammenheng som brukes til OCT, vil ikke spredt lys fra brightfield-fluorescenskildene bidra til interferensmønsteret som koder dybdeinformasjon. For det andre kravet har boligdesignet for kapillærrøret tilgjengelige optiske veier til de fremre, dårligere og overlegne planene i prøven. Under eksperimenter holder to platinakroker en trabecula i et kapillærrør som er perfundert med oksygenert Krebs-Henseleit (KH) løsning. Galvanometerhodet til OCT er orientert ortogonalt til brightfield-fluorescensavbildningsveien for å dra nytte av det tredje ortogonale optiske planet (figur 3).
Dette dokumentet skisserer designhensynene for å bygge en enhet som er i stand til samtidig avbildning av kalsium, sarkomerlengde og muskelgeometri. For å demonstrere disse målemulighetene beskriver vi prosessen med å isolere en ventrikulær trabecula, utarbeidelsen av de nødvendige bufferløsningene, sammen med de kritiske trinnene som er involvert i håndtering og fluorescensbelastning av en ex vivo trabecula. Til slutt skisserer dette dokumentet prosessene som kreves for å oversette datasettet til mer nyttige visualiseringer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>150375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215; microscope lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Super Fluor 20&#215;</td>
			<td>NA 0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D Galvanometer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVSM002/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-50 beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FC850-40-50-APC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-10 beam-splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TW850R2A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analogue input module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-9205</td>
			<td>Records the PMT signal at 200 kHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield imaging light source</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>PE-2</td>
			<td>660&#160;nm LAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broadband light source</td>
			<td>Superlum</td>
			<td>Broadlighter-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cameralink card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-1429</td>
			<td>Brightfield imaging frame grabber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen 5</td>
			<td>BOC</td>
			<td>Gas code: 181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condensor lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>LWD 0.52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAQ</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6259</td>
			<td>Triggers the galvanometer movement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror 1</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF409-Di03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF552-Di02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffraction grating</td>
			<td>Wasatch Photonics</td>
			<td>1200 lines/mm @840 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-Q 3 UV System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ZRQSVR3WW</td>
			<td>Distilled water machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6875-SB</td>
			<td>LSE digital dry bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Open-source image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2AM pentapotassium salt</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>F14186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware FPGA card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-7813R</td>
			<td>Also controls the triggering of the brightfield capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>61024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-DH illumination pillar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>MedSource</td>
			<td>VAPDRUGISO250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Line-scan camera</td>
			<td>Basler</td>
			<td>spL2048-70km</td>
			<td>Spectrometer camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3810000</td>
			<td>RCT basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Data processing code</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT FPGA card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-1483R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tank</td>
			<td>BOC</td>
			<td>Gas code: 100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MP220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerload</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P10020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superluminescent diode</td>
			<td>Broadlighter</td>
			<td>D-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transimpedance amplifier</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wistar rat</td>
			<td>Vernon Jansen Unit</td>
			<td></td>
			<td>8 &#8211; 10 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon arc lamp</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>DG-4</td>
			<td>Lambda DG-4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous brightfield, fluorescence, and optical coherence tomographic imaging of contracting cardiac trabeculae ex vivo

I hjertemuskelen aktiverer intracellulære Ca2+ transienter kontraktile myofilaments, forårsaker sammentrekning, makroskopisk forkortelse og geometrisk deformasjon. Vår forståelse av de interne relasjonene mellom disse hendelsene har vært begrenset fordi vi verken kan "se" inne i muskelen eller nøyaktig spore den romlige-temporale naturen til eksitasjons-sammentrekningsdynamikk. For å løse disse problemene har vi konstruert en enhet som kombinerer en pakke med bildemodaliteter. Spesielt integrerer den et brightfield-mikroskop for å måle lokale endringer av sarcomere lengde og vevsstamme, et fluorescensmikroskop for å visualisere Ca2 + forbigående, og en optisk koherenstomografi for å fange vevets geometriske endringer gjennom hele hjertesyklusen. Her presenterer vi bildeinfrastrukturen og tilhørende rammeverk for datainnsamling. Data samles inn fra isolerte stanglignende vevsstrukturer kjent som trabekulær carneae. I vårt instrument holder et par posisjonskontrollerte platinakroker hver ende av en ex vivo muskelprøve mens den kontinuerlig superfunderes med næringsrik saltløsning. Krokene er under uavhengig kontroll, noe som tillater sanntidskontroll av muskellengde og kraft. På langsgående oversettelse muliggjør den stykkevise skanningen av prøven, overvinne begrensninger knyttet til den relative størrelsen på mikroskopets bildevindu (540 μm med 540 μm) og lengden på en typisk trabecula (>2000 μm). Platinaelektroder i hver ende av muskelkammeret stimulerer trabecula i en brukerdefinert hastighet. Vi utnytter stimuleringssignalet som en utløser for synkronisering av dataene fra hvert bildevindu for å rekonstruere hele prøverykningen under steady-state-forhold. Bruk av bildebehandlingsteknikker på disse brightfield-bildedataene gir vevsforskyvning og sarcomere lengdekart. En slik innsamling av data, når de innlemmes i en eksperimentmodelleringsrørledning, vil gi en dypere forståelse av muskelkontraktil homogenitet og heterogenitet i fysiologi og patofysiologi.

For å fange den regionale Ca2 + og brightfield informasjon for hele lengden av trabecula presentert her, var det nødvendig med syv muskelstillinger. Figur 6 antyder at rykninger kraften var uforstyrret av denne bevegelsen, og avslørte at det ikke var noen posisjonsavhengighet av den aktive kraftproduksjonen.
B-skanninger samlet inn ved hjelp av optisk koherenstomografi med en hastighet på 100 Hz ble segmentert ved hjelp av ImageJ-plugin WEKA14 (figur 7A). Hvert tverrsnitt vises forvrengt på grunn av forskjellen mellom sideoppløsningen (10 μm) og dybden (1,73 μm (i myokardi)). Denne forvrengningen ble korrigert ved å skalere bildets dybdeakse etter forholdet mellom sideoppløsning og dybdeoppløsning. Figur 7B,C viser at etter skalering av den rå C-skanningen av trabecula er det omtrent sylindrisk i geometri. Refleksjonen av målekammerveggen kan noen ganger overlappe med muskeldataene (Figur 7A,B), men segmenteringsprogramvaren kan trenes til å gjøre rede for dette (Figur 7D,E). Når det er segmentert, kan tverrsnittsområdet langs muskelens lengde beregnes gjennom rykningen (Figur 7F). Legg merke til at denne spesielle trabecula har et lite vedlegg som forgrener seg fra den. Grenens bevegelse er tydelig ~ 0, 75 mm langs trabecula. Til slutt kan de segmenterte bildene konverteres til nett for å hjelpe konstruksjonen av geometriske modeller (Figur 7G).
Bildedata som ble tatt ved hver av de forskjellige trabeculaposisjonene med en hastighet på 100 fps, ble sydd sammen for å skape et enkelt komplett bilde av trabecula (Figur 8A). Oppløsningen på disse bildene er 0,535 μm/piksel. Bruken av lineære vektingsfunksjoner i de overlappende områdene i nærliggende vinduer bidrar til visualisering og minimerer virkningen av vignetten som finnes i brightfield-bildene. For å måle fluorescerende signal, er et 540 μm med 540 μm vindu av trabecula syklisk opplyst med 340 nm, 365 nm og 380 nm bølgelengdelys med en hastighet på 600 Hz. Forholdet mellom den avgitte fluorescensen forbundet med eksitasjonslyset på 340 nm og 380 nm korrelerer med det intracellulære kalsiumet etter at trabecula er lastet med Fura-2. Siden denne målingen er et forhold, er den effektive målehastigheten 200 Hz. Gjennomsnittet (n = 10) intracellulære Ca2+ forbigående fra hvert vindu er justert etter regionen de ble avbildet (Figur 8B). Mens toppen av transientene virker rimelig konsistent, er den diastoliske [Ca2 +] lavere innenfor området mellom 900 μm og 1800 μm langs trabecula. På samme måte indikerer resultatene av beregningene av forskyvningssporing (figur 8C) og sarcomere lengde (figur 8D) også tilstedeværelsen av regional variasjon. Den markørløse sporingsteknikken som brukes, er i stand til å behandle forskyvningen av hver piksel, gitt nok kontrast. Ved tilordning av fordelingen av sarcomere lengder i innlegg, ble et krysskorrelasjonsområde på 128 piksler med 128 piksler (~ 67 μm med 67 μm) brukt til å beregne regional sarcomere lengde. Dette området innkapsler ca. 29 sarcomeres når du lukker prøven er nær optimal sarcomere lengde. Trinnstørrelsen (i både x- og y-retningen)mellom sentroiden i hvert krysskorrelasjonsvindu ble satt til 50 piksler (~ 26 μm) for behandling av disse dataene. Egnetheten til sarcomere lengdeestimater ble testet basert på bredden og amplituden til den gaussiske passformen til FFT-signalet. Disse forholdene ble ikke oppfylt i muskelområdet mellom 0 μm og 500 μm, slik at ingen sarcomere lengdeinformasjon kunne beregnes der. Gitt de tilknyttede forskyvningene, er det sannsynlig at sarkomerne i denne regionen langstrakt under kontraktilfasen. I tråd med denne spekulasjonen forkortes de gjennomsnittlige sarcomere-lengdene på høyre side av trabecula i løpet av den perioden. Ved å kombinere informasjonen fra hvert av panelene, ser det ut til at regionen med det største tverrsnittsområdet ikke produserer den viktigste kraften. På antagelsen om at den regionale variasjonen av Ca2+ transienter har en omtrent jevn gradient, indikerer figur 8B at den største amplituden Ca2 + forbigående forekommer et sted mellom 1300 μm og 1600 μm langs trabecula. Forskyvningskartet indikerer at regionen som gjennomgår minst bevegelse, stemmer godt overens med toppen Ca2+ forbigående. Denne regionen har imidlertid de minste tverrsnittsområdene i utvalget. Med disse dataene i tankene, kan man antyde at denne regionen genererte mest stress.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig01.jpg"> Figur 1: Kommentert bilde av kardiomyometeret. Hver av de viktigste optiske komponentene er skissert. Innsettet inneholder et nærbilde, bakfra, av mikroskopmålet in situ, under målekammeret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig02.jpg"> Figur 2: Optisk bane for samtidig brightfield og fluorescensmikroskopi. Belysningskilden for fluorescensmikroskopet er en Xenon lysbuelampe, hvorav utgangen syklisk skifter mellom 340 nm, 365 nm og 380 nm lys. Lysbuelampens utgangsbane inneholder et dikroisk speil med en avskåret bølgelengde på 409 nm som reflekterer UV-lyset på et speil som leder lyset inn i et fluorescensmikroskopmål. Linsen fokuserer eksitasjonslyset på prøven og samler det avgitte lyset, som har en lengre bølgelengde på 510 nm. Dette avgitte lyset passerer gjennom det første dikroiske speilet, men ikke det andre, da det har en avskåret bølgelengde på 552 nm. Et feltobjektiv fokuserer deretter det reflekterte lyset på sensoren til PMT. I mellomtiden er belysningskilden (660 nm LED) for brightfield-mikroskopet plassert over prøven. Det overførte lyset er fokusert på prøven av en kondensatorlinse, og det 20× fluorescensmålet fanger det resulterende overføringsbildet. Bølgelengden som brukes til brightfield-belysning overskrider den avskårne bølgelengden til hvert dikroiske speil, slik at den passerer gjennom dem begge før bildet er fokusert på sensoren til et CMOS-kamera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig03.jpg"> Figur 3: Design avmålekammerholder. (A) Isometrisk visning av målekammerholderen med optiske baner lagt over. Brightfield belysning oppstår fra den overlegne overflaten (z-aksen); fluorescensbelysning oppstår fra den dårligere overflaten (z-aksen), og målearmens OCT-signal er ortogonalt til den andrebelysningsaksen ( y -aksen). Under eksperimentet holder to platinakroker en trabecula i et glasskapillært rør som fungerer som målekammer. Stemmespolemotorer kontrollerer hver krok, og posisjonene deres måles ved hjelp av laserinterferometri. Gjeldende posisjon sammenlignes med et brukerdefinert settpunkt, og ved hjelp av en PID-kontroller som er kodet i en FPGA, minimeres feilen. (B) Målekammer in situ med brightfield-belysningen slått på. Bakvisningen vises i innside for figur 1 . (C) Skjematisk for superfusatstrømmen gjennom målekammerholderen. Superfusate kommer inn på baksiden av blokken og strømmer i den retningen som indikeres av piler. Oppstrøms- og nedstrømselselektrodene etablerer feltstimulering for å fremkalle sammentrekning av en montert trabecula i målekammeret. Blå skyggelegging angir områdene der superfusatet flyter under et eksperiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig04.jpg"> Figur 4: Frontpanelet i bildeanskaffelses- og kontrollprogramvaren. (A) Brightfield imaging-brukergrensesnittet. (B) Oct bildebehandling brukergrensesnitt. (C) Brukergrensesnitt for maskinvarekontroll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig05.jpg"> Figur 5: Trabecula disseksjons- og monteringsprotokoll. (A) Langendorff-perfused rottehjerte i disseksjonskammeret. (B ) Det samme hjertet med atriene fjernet. Stiplede linjer angir eksisjonsbanen for å åpne ventriklene. (C) Et åpnet hjerte for å eksponere innsiden av begge ventriklene. Den stiplede boksen angir området der trabeculae vanligvis finnes. (D) Utskilt høyre-ventrikulær veggområde (det samme som angitt av den stiplede boksen i C). Stiplede linjer uthever tre trabeculae. (E) En trabecula valgt fra de tre i D. (F) Trabecula fra panel E med veggvevet fjernet. (G) Den isolerte trabecula i enden av en 1 ml sprøyte. (H) Trabecula i monteringskammeret. (I) Trabecula montert mellom to platina kroker. (J) Trabecula, montert mellom kroker, innenfor målekammeret (Figur 3B). Det grønne stedet er en gjenstand fra det første dikroiske filteret. (K) Sekundær vinkel på den monterte trabeculaen i målekammeret. Avstanden mellom trabecula og mikroskop objektiv linsen er ca 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig05large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig06.jpg"> Figur 6: Posisjonsavhengighet for kraftmålingen. Kraften som produseres av muskelen fra hver av bildeposisjonene (n = 7) overlaid. Gjennomsnittlig aktiv kraftproduksjon var 0,527 mN ± 0,003 mN, tid til 50 % sammentrekning 77,1 ms ± 0,3 ms, og tid til 50 % avslapning 328,1 ms ± 0,9 ms (alle data presenteres som gjennomsnittlig ± SE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig7v2.jpg"> Figur 7: Analyse av OKT-bildebehandling. (A) Eksempel på WEKA-segmentering. Det segmenterte tverrsnittet av muskelen er uthevet i rødt, og bakgrunnen er uthevet i grønt. (B) Overlegen visning av rå C-skannedata for en trabecula. Den lyse vinklede linjen mot toppen av bildet er refleksjonen av målekammerveggen. (C) Lateral visning av rå C-skanning data av en trabecula. (D) Overlegen visning av segmenterte OCT-data. (E) Lateral visning av segmenterte OCT-data. (F) Tverrsnittsområdet langs lengden av trabecula(x-aksen)til og med(y -aksen). Det gjennomsnittlige tverrsnittsområdet langs muskellengden var 0,0326 mm2 ± 0,0005 mm2 (gjennomsnittlig ± S.E.) (G) Et nett av trabecula. Nettet har blitt omtrent justert med tverrsnittsområdet av panel F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig7v2lage.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig08.jpg"> Figur 8: Brightfield og fluorescensavbildningsanalyse. (A) Sydd bilde (syv bildevinduer) av trabecula. (B) Ca2+ transienter langs lengden av trabecula. (C) Gjennomsnittlig x-forskyvning fra hvert bildevindu. En positiv forskyvning representerer en bevegelse til høyre og negativ til venstre. (D) Gjennomsnittlige sarcomere-lengder fra hvert bildevindu som hadde den nødvendige bildekontrasten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig08large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tabell 1: Løsningstabell <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/Tables_of_solutions.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo at JoVE.com

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

Denne protokollen presenterer en samling sarkomer, kalsium og makroskopiske geometriske data fra en aktivt kontraherende hjertetrabecula ex vivo. Disse samtidige målingene er muliggjort ved integrering av tre bildemodaliteter.

Samtidig Brightfield, fluorescens og optisk sammenheng Tomografisk bilde av kontraherende hjertetrabekulær ex vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and ...

Det overordnede målet med denne prosedyren er å demonstrere integrasjonen av tre bildesystemer i en enkelt enhet, noe som muliggjør en samtidig måling av mekanisk funksjon, ionisk dynamikk og geometrisk endring av kontraherende hjertevev. Spesielt måler vi vevets kraftproduksjon, kalsiumtransienter, lokale forskyvninger og formendring. Kombinasjon av disse avbildningsmodalitetene kan bidra til å svare på viktige spørsmål ved hjertesykdom, med store implikasjoner for utvikling av effektive behandlingsstrategier.Den største fordelen med denne teknikken er at den gjør det mulig for oss å studere heterogeniteten til muskelaktivitet. Enheten som brukes i denne protokollen inneholder tre bildesystemer som er i stand til å forestille seg den samme prøven, et brightfield-mikroskop, fluorescensmikroskop og en optisk koherenstomografi. En rekke dikroiske speil brukes til å skille fluorescensutslippet og brightfield-overføringsbildet.De grunnleggende egenskapene til denne enheten er to uavhengig aktiverte monteringskroker, et målekammer med tre optisk klare akser og en ekstern utløserlinje som synkroniserer brightfield- og OCT-kameraene med en stimulator. I denne videoen demonstrerer vi hvordan du isolerer, forbereder og bilder hjertetrabeculae og presenterer noen representative resultater. Etter å ha utskilt et hjerte fra en bedøvet rotte, overfør det til disseksjonskammeret.Bruk to buede tang, trekk aorta over perfusjonskanylen. Hold aortaen på plass med en tang. I mellomtiden åpner du rørlinjen slik at disseksjonsløsningen kan strømme gjennom perfusjonskanylen.Når koronarvaskulaturen er ryddet av blod og hjertet er helt perfundert med disseksjonsløsning, sikre aortaen på plass ved hjelp av en sutur. Plasser hjertet ved å rotere kanylen slik at venstre koronararterie er synlig på den overlegne overflaten. Fest hjertets toppunkt til bunnen av disseksjonskammeret.Kutt av begge atriene. Klipp langs høyre side av septumet til toppen av hjertet. Fest den åpne venstre ventrikelen til bunnen av disseksjonskammeret.Deretter skjærer du langs venstre side av septumet, åpner høyre ventrikel og fester den til bunnen av disseksjonskammeret også. Identifiser en frittgående trabecula i høyre ventrikel. Bruk vårsaksen og en tang, kutt veggvevet rundt trabecula.Klipp deretter veggvevet i halvparten, ortogonalt i retning av trabecula. Trim veggvevet til dimensjonen passer for monteringskonfigurasjonen som brukes. La den utskilte trabecula i disseksjonskammeret.Skyll varmt vann, destillert vann, og overdimensjoner deretter løsningen gjennom målekammeret. Slå på lyskilden for brightfield-mikroskopet, og trykk F1 for å aktivere opptak. Juster nedstrømskroken manuelt til den er sentrert i brightfield-bildet.Klikk på null nedstrøms akse, og deaktiver deretter nedstrøms for å aktivere motoren. Flytt glidebryteren for nedstrøms settpunkt til enden av kroken justeres etter kanten av standard interesseområde. Nullstill nedstrømsaksen, og flytt deretter glidebryteren for nedstrøms settpunkt til 1 000.Gjenta prosessen med oppstrømskroken, men ikke flytt glidebryteren for oppstrøms settpunkt etter at oppstrømsaksen er nullstilt på nytt. Klikk flytt til montering. Start lysstoffrørsystemet ved å slå på lampebryteren før du raskt slår på kontrollerdelsystemene ved å slå på hovedbryteren.Bytt driftsmodus til turbo blanking ved å trykke på modusknappen på frontpanelet, etterfulgt av to, deretter en. Trykk på online-knappen for å aktivere ekstern kontroll. Sett superfusatstrømmen på pause gjennom målekammeret.Fyll monteringskammeret med disseksjonsløsning. Bruk en sprøyte med én milliliter til å transportere trabecula fra disseksjonskammeret til monteringskammeret. La trabeculaen falle ned i monteringskammeret via tyngdekraften.Senk væskenivået i monteringskammeret slik at det er i vater med midtseksjonen av krokene. Juster avstanden mellom krokene for å gjenspeile slakklengden på trabecula ved å flytte nedstrøms setpoint slider. Bruk et mikroskop for å hjelpe visualisering, grip lett på et av endevevsstykkene med tang og monter det på oppstrømskroken.Monter det andre stykke endevev på nedstrømskroken. Når trabeculaen er godt montert, flytter du trabeculaen tilbake til målekammeret ved å trykke på flytt til kammeret og gjenoppta superfusatstrømmen. Sett stimulusfrekvensen til en stimulusvarighet til 10, og stimulansspenning til 10.Start stimuleringen ved å trykke på stimulansen. Slå på brightfield-belysningssystemet. Trykk F1, og velg et interesseområde som omslutter et område i brukergrensesnittet.Klikk beregn sarcomere-lengde for å beregne gjennomsnittlig sarcomere-lengde i det uthevede området. Øk muskellengden til den gjennomsnittlige sarkomerlengden er ca. 2,32 mikron. Flytt muskelen ved å justere den midterste glidebryteren for settpunkt på midten og separasjonskontrollfanen slik at kanten på nedstrømskroken bare er synlig i brightfield-bildet.Samle fluorescensinformasjonen for 10 rykninger. Øk den midterste setpoint-verdien med 200 og samle inn ytterligere 10 rykninger verdt fluorescensinformasjon. Gjenta denne prosessen til brightfield-bildet inneholder oppstrømskroken.Samle inn det endelige vinduets verdi av fluorescensinformasjon. Sett trabecula tilbake til en sentral posisjon ved å sette den midterste settpunktverdien til null. Reduser stimulusfrekvensen til 0,2 Hertz og bytt fra K-H superfusate til Fura-2 lasteløsning.Mål fluorescenssignalet hvert 10. Visualiser signalet i kategorien PMT-signal. Etter at 360 nanometersignalet har økt med en faktor på 10, returner stimulusfrekvensen til en Hertz og bytt tilbake til K-H superfusate-løsningen.Kontroller forholdsmålingen hvert 10. Returner muskelen til posisjonen der kanten på nedstrømskroken bare er til stede i brightfield-bildet. Fang opp fluorescensinformasjon ved å klikke på aktiver fluorescenskilde.Start direkteavspilling av maskinvaredata. På brukergrensesnittet for brightfield imaging setter du opptaksmodusen til ekstern utløser, øker bildefrekvensen til 100 Hertz og angir antall bilder som skal tas til 100. Trykk control-shift-S etterfulgt av F1 for å registrere lysfeltavbildningsdataene for dette vinduet.Øk den midterste setpoint-verdien med 200, og gjenta brightfield-opptaksprosessen. Fortsett med skanneprotokollen til bildedataene er samlet inn for det endelige vinduet. Sett trabecula tilbake til en sentral posisjon ved å sette den midterste settpunktverdien til null.Slå på OKT-belysningskilden ved å dreie på hovedtasten, trykke på av/på-knappen, etterfulgt av SLD-knappen. Dekk galvanometerhodet og klikk på få bakgrunn for å måle bakgrunnsforstyrrelsesmønsteret og trekke det fra målingen. Sett bildeopptaksmodusen til live view.Midtstill trabecula i X- og Y-aksene ved å justere X- og Y-forskyvningsverdiene. Med trabecula sentrert, skann langs y-aksen ved å justere Y-posisjonen for å finne posisjonene som tilsvarer oppstrøms- og nedstrømskrokene. Legg merke til disse posisjonene.Sett område Y til den absolutte forskjellen mellom disse verdiene dividert med 10. Sett bildeopptaksmodusen til stimulus utløst, område X til 100, og klikk på den angitte aktive parameterknappen. Klikk på strømdata, og hent deretter.For å fange den regionale kalsium- og brightfield-informasjonen for hele lengden av trabecula presentert her, var det nødvendig med syv muskelstillinger. Denne figuren av den gjennomsnittlige kraften fra hver av stillingene overlagt antyder at rykninger kraften var uforstyrret av denne bevegelsen, og avslørte at det ikke var noen posisjonsavhengighet av kraftproduksjon. Disse skanningene samlet inn ved hjelp av optisk koherenstomografi med en hastighet på 100 Hertz ble segmentert ved hjelp av ImageJ-plugin, Weka.Hvert tverrsnitt vises forvrengt på grunn av forskjellen mellom side- og dybdeoppløsningene. Dette ble korrigert ved å skalere hver akse uavhengig av den respektive oppløsningen. Etter å ha skalert den rå C-skanningen av trabecula, er muskelen omtrent sylindrisk.Refleksjonen av målekammerveggen kan noen ganger overlappe med muskeldataene, men segmenteringsprogramvaren kan trenes til å ta hensyn til dette. Når det er segmentert, kan tverrsnittsområdet langs muskelens lengde beregnes gjennom rykningen. Legg merke til at denne spesielle trabecula har en liten gren.Grenens bevegelse er tydelig omtrent halvveis langs trabecula. Til slutt kan de segmenterte bildene konverteres til masker for å hjelpe konstruksjonen av geometriske modeller. Bildedata som ble tatt i hver av de syv posisjonene med en hastighet på 100 bilder per sekund, ble sydd sammen for å skape et enkelt komplett bilde av trabecula.Forholdet mellom den utelatte fluorescensen forbundet med eksitasjonslyset på 340 og 380 nanometer korrelerer med det intracellulære kalsiumet etter at trabecula er lastet med Fura-2. Gjennomsnittet av 10 intracellulære kalsiumtransienter fra hvert vindu er på linje med regionen de ble avbildet. Mens toppen av transientene for denne trabecula virker rimelig konsistent, reduserte det diastoliske kalsiumet langs lengden.På samme måte indikerer resultatene av forskyvningssporingen og sarcomere lengdeberegninger også tilstedeværelsen av regional variasjon. Den markørløse sporingsteknikken som brukes, er i stand til å beregne forskyvningen av hver piksel. Egnetheten til sarcomere lengde estimatene ble testet basert på bredden og amplituden til den gaussiske passformen til FFT-signalet.Disse forholdene ble ikke oppfylt i muskelområdet mellom null og 500 mikron, så ingen sarkomre lengdeinformasjon kunne beregnes der. Gitt de tilknyttede forskyvningene, er det sannsynlig at sarkomerne i denne regionen langstrakte under den kontraktile fasen av rykningen. Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du isolerer hjertetrabekulær og forbereder dem på multimodal avbildning pålitelig.Denne prosessen etablerer en vei for innsamling av et datasett som kreves for bygging av fysiologisk informerte elementmodeller av hjertevevskontraksjon.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Optisk Frequency Domain Imaging av<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lunge Reseksjon prøver: Innhenting One to One bildet for å Histopatologi Korrelasjon

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Integrert Photoacoustic ophthalmoscopy og Spectral-domene optisk koherens tomografi

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Wideband optisk detektor av ultralyd for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Imaging denaturert kollagen Strands<em&gt; In vivo</em&gt; Og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Via Photo-utløst Hybridisering av Caged Kollagen Mimetic Peptider

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-slukking av en Liposomalinnkapslet Nær-infrarød fluoroforen som et verktøy for<em&gt; I Vivo</em&gt; Optisk Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Med ekstraordinære optisk girkasse å kvantifisere Cardiac Biomarkers i humant Serum

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Byttbar akustisk og optisk oppløsning Photoacoustic Microscopy for<em&gt; In vivo</em&gt; Små dyr blodprodusering av blodkar

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the ...

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy oSLO and Optical Coherence Tomography OCT

Flere volumetriske Retinal Imaging skrå skanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) og Optical Coherence tomografi (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...