Name: automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)
Uploaded: 2022-02-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من قبل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2018YFA0901500) ، والمشروع الوطني الرئيسي للأدوات والمعدات العلمية التابعة للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (21627812) ، وبرنامج البحث العلمي لمبادرة جامعة تسينغهوا (20161080108). كما نشكر البروفيسورة جوليا أ. فورهولت (معهد علم الأحياء الدقيقة، قسم علم الأحياء، ETH زيورخ، زيوريخ 8093، سويسرا) على توفير النسخة 2.2 من سلالة الإشريكية القولونية الأساسية من الميثانول (MeSV2.2).

1. تركيب الأدوات والبرامج
<ol><li>اختر بيئة نظيفة ومعقمة (مثل مقعد نظيف) كمساحة دائمة مخصصة ل MMC. تثبيت MMC بثبات في الفضاء. ملاحظة: حافظ على MMC بعيدا عن تداخل المجالات الكهربائية القوية والمجالات المغناطيسية ومصادر الإشعاع الحراري القوية. تجنب الاهتزاز الشديد من التأثير على مكونات ا?...

<ol>
	<li>Lewis, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms.">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li><li>Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+technology+in+industrial+biotechnology.">High-throughput screening technology in industrial biotechnology.</a> Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).</li><li>Kim, J., Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+analysis+for+the+optimization+of+Campylobacter+isolation+from+chicken+carcasses+using+selective+media.">Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).</li><li>Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microscale+processing+technologies+for+quantification+of+biocatalytic+Baeyer-Villiger+oxidation+kinetics.">The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).</li><li>Harms, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+a+24-station+high+throughput+microbioreactor.">Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).</li><li>Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-four+well+plate+miniature+bioreactor+system+as+a+scale-down+model+for+cell+culture+process+development.">Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo-Lector+-+a+novel+platform+for+automated+high-throughput+cultivations+in+microtiter+plates+with+high+information+content.">Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content.</a> Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+a+kinetics+analysis+of+the+high-pressure+inactivation+of+microorganisms+using+microplates.">High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).</li><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics.">Droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li><li>Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+microbiology:+techniques,+applications+and+challenges.">Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).</li><li>Liao, P. Y., Huang, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divide+and+conquer:+analytical+chemistry+of+nucleic+acids+in+droplets.">Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets.</a> Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).</li><li>Jian, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+microdroplet+culture+system+(MMC):+An+integrated+platform+for+automated,+high-throughput+microbial+cultivation+and+adaptive+evolution.">Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).</li><li>Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empowering+a+methanol-dependent+Escherichia+coli+via+adaptive+evolution+using+a+high-throughput+microbial+microdroplet+culture+system.">Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).</li><li>Meyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-essential+growth+of+Escherichia+coli.">Methanol-essential growth of Escherichia coli.</a> Nature Communications. 9, 1508 (2018).</li><li>Gru&#776;nberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+growth+rate+0.6:+Corynebacterium+glutamicum+cultivated+in+highly+diluted+environments.">Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).</li><li>Kaganovitch, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+single-cell+analysis+in+picoliter-sized+batch+cultivation+chambers.">Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers.</a> New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).</li><li>Baraban, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millifluidic+droplet+analyser+for+microbiology.">Millifluidic droplet analyser for microbiology.</a> Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).</li><li>Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+adaptation+in+microdroplet+chemostats.">Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).</li><li>Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+droplet-based+microfluidic+platform+for+multiplexed+analysis+of+biochemical+markers+in+small+volumes.">Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes.</a> Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).</li><li>Watterson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+high-throughput+cultivation+for+accurate+screening+of+antibiotic+resistant+gut+microbes.">Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes.</a> eLife. 9, 56998 (2020).</li><li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactants+in+droplet-based+microfluidics.">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li><li>Nitschke, M., Pastore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+properties+of+a+surfactant+obtained+from+Bacillus+subtilis+grown+on+cassava+wastewater.">Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater.</a> Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).</li><li>Jiang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+biofuels+and+biochemicals+production+from+sustainable+resources+using+co-cultivation+systems.">Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems.</a> Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).</li></ol>

يقدم هذا البروتوكول كيفية استخدام نظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC) لإجراء الزراعة الميكروبية الآلية والتطور التكيفي طويل الأجل. MMC هو نظام زراعة ميكروبية مصغر وآلي وعالي الإنتاجية. بالمقارنة مع طرق وأدوات الزراعة الميكروبية التقليدية عالية الإنتاجية ، تتمتع MMC بالعديد من المزا?...

تعد الزراعة الميكروبية أساسا مهما للبحث العلمي الميكروبيولوجي والتطبيقات الصناعية ، والتي تستخدم على نطاق واسع في عزل وتحديد وإعادة بناء وفحص وتطور الكائنات الحية الدقيقة1،2،3. تستخدم طرق الزراعة الميكروبية التقليدية بشكل أساسي أنابيب الاختبار ، وقوارير الاهتزاز ، والألواح الصلبة كحاويات زراعة ، إلى جانب حاضنات الاهتزاز ، وأجهزة قياس الطيف الضوئي ، وقارئات الصفائح الدقيقة ، وغيرها من المعدات للزراعة الميكروبية والكشف عنها وفحصها. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لديها العديد من المشاكل ، مثل العمليات المرهقة ، والإنتاجية المنخفضة ، والكفاءة المنخفضة ، والاستهلاك الكبير للعمالة والكواشف. تعتمد طرق الزراعة عالية الإنتاجية التي تم تطويرها في السنوات الأخيرة بشكل أساسي على الصفائح الدقيقة. لكن الصفيحة الدقيقة لديها مستوى منخفض من الأكسجين المذاب ، وخاصية خلط ضعيفة ، وتبخر شديد وتأثير حراري ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى ضعف حالة النمو وتجربة توازي الكائنات الحية الدقيقة4،5،6،7 ؛ من ناحية أخرى ، يجب أن تكون مجهزة بمعدات باهظة الثمن ، مثل محطات العمل التي تتعامل مع السوائل وأجهزة قراءة الصفائح الدقيقة ، لتحقيق الزراعة الآلية والكشف عن العملية 8,9.
كفرع مهم من تكنولوجيا الموائع الدقيقة ، تم تطوير الموائع الدقيقة بالقطيرات في السنوات الأخيرة بناء على أنظمة الموائع الدقيقة التقليدية ذات التدفق المستمر. إنها تقنية ميكروفلويديك منفصلة التدفق تستخدم مرحلتين سائلتين غير قابلتين للامتزاج (عادة ما يكون الزيت والماء) لتوليد قطرات صغيرة مشتتة والعمل عليها10. نظرا لأن القطرات الدقيقة لها خصائص الحجم الصغير ، ومساحة السطح المحددة الكبيرة ، وارتفاع معدل نقل الكتلة الداخلية ، وعدم وجود تلوث متقاطع ناتج عن التقسيم ، ومزايا التحكم القوي والإنتاجية العالية للقطرات ، فقد كانت هناك أنواع كثيرة من الأبحاث التي تطبق تقنية الموائع الدقيقة للقطرات في زراعة الكائنات الحية الدقيقة وفحصها وتطورهاعالية الإنتاجية 11 . ومع ذلك ، لا تزال هناك سلسلة من القضايا الرئيسية لجعل تكنولوجيا الموائع الدقيقة القطيرات شائعة وتطبق على نطاق واسع. أولا ، يعد تشغيل الموائع الدقيقة بالرذاذ مرهقا ومعقدا ، مما يؤدي إلى متطلبات تقنية عالية للمشغلين. ثانيا ، تجمع تقنية الموائع الدقيقة بالقطرات بين المكونات البصرية والميكانيكية والكهربائية ويجب أن ترتبط بسيناريوهات تطبيق التكنولوجيا الحيوية. من الصعب على مختبر واحد أو فريق واحد بناء أنظمة فعالة للتحكم في الموائع الدقيقة بالقطرات إذا لم يكن هناك تعاون متعدد التخصصات. ثالثا ، نظرا لصغر حجم القطرات الدقيقة (من بيكوليتر (pL) إلى ميكرولتر (μL)) ، يتطلب الأمر صعوبة كبيرة لتحقيق التحكم الآلي الدقيق والكشف الفوري عبر الإنترنت عن القطرات لبعض العمليات الميكروبية الأساسية مثل الزراعة الفرعية والفرز وأخذ العينات ، ومن الصعب أيضا بناء نظام معدات متكامل12.
من أجل معالجة المشاكل المذكورة أعلاه ، تم تطوير نظام تلقائي لزراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC) بنجاح استنادا إلى تقنية الموائع الدقيقةللقطرات 13. يتكون MMC من أربع وحدات وظيفية: وحدة التعرف على القطرات ، ووحدة الكشف عن طيف القطرات ، ووحدة رقاقة الموائع الدقيقة ، ووحدة أخذ العينات. من خلال تكامل النظام والتحكم في جميع الوحدات ، يتم إنشاء نظام التشغيل الآلي بما في ذلك التوليد والزراعة والقياس (الكثافة البصرية (OD) والتألق) ، والانقسام ، والانصهار ، وفرز القطرات بدقة ، وتحقيق تكامل وظائف مثل التلقيح والزراعة والرصد والزراعة الفرعية والفرز وأخذ العينات التي تتطلبها عملية زراعة القطرات الميكروبية. يمكن أن تستوعب MMC ما يصل إلى 200 وحدة زراعة قطرات مكررة بحجم 2-3 ميكرولتر ، وهو ما يعادل 200 وحدة زراعة قارورة اهتزاز. يمكن لنظام زراعة القطرات الدقيقة تلبية متطلبات عدم التلوث والأكسجين المذاب والخلط وتبادل الطاقة الكتلية أثناء نمو الكائنات الحية الدقيقة ، وتلبية الاحتياجات المختلفة للبحوث الميكروبية من خلال وظائف متكاملة متعددة ، على سبيل المثال ، قياس منحنى النمو ، والتطور التكيفي ، والتحليل متعدد المستويات أحادي العامل ، وأبحاث وتحليل الأيض (استنادا إلى الكشف عن التألق)13،14.
هنا ، يقدم البروتوكول كيفية استخدام MMC لإجراء الزراعة الآلية والميكروبية والتطور التكيفي بالتفصيل (الشكل 1). أخذنا الإشريكية القولونية من النوع البري (E. coli) MG1655 كمثال لإثبات قياس منحنى النمو وسلالة E. coli الأساسية للميثانول MeSV2.215 لإثبات التطور التكيفي في MMC. تم تطوير برنامج تشغيل ل MMC ، مما يجعل العملية بسيطة وواضحة للغاية. في العملية برمتها ، يحتاج المستخدم إلى إعداد محلول البكتيريا الأولي ، وتعيين شروط MMC ، ثم حقن محلول البكتيريا والكواشف ذات الصلة في MMC. في وقت لاحق ، ستقوم MMC تلقائيا بتنفيذ عمليات مثل توليد القطرات ، والتعرف عليها وترقيمها ، والزراعة ، والتطور التكيفي. كما سيقوم بإجراء الكشف عبر الإنترنت (OD والتألق) للقطرات بدقة زمنية عالية وعرض البيانات ذات الصلة (التي يمكن تصديرها) في البرنامج. يمكن للمشغل إيقاف عملية الزراعة في أي وقت وفقا للنتائج واستخراج القطرات المستهدفة للتجارب اللاحقة. إن MMC سهل التشغيل ، ويستهلك كمية أقل من العمالة والكواشف ، ولديه إنتاجية تجريبية عالية نسبيا وتوازي جيد للبيانات ، مما يتمتع بمزايا كبيرة مقارنة بطرق الزراعة التقليدية. ويوفر منصة تجريبية منخفضة التكلفة وسهلة التشغيل وقوية للباحثين لإجراء البحوث الميكروبية ذات الصلة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m PVDF filter membrane</td>
			<td>Merck Millipore Ltd.</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Sterilize the MMC oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-289BSW</td>
			<td>For reagent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>For solid plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20011160</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.</td>
			<td>DL-CJ-INDII</td>
			<td>For aseptic operation and UV sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10007216</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>E450</td>
			<td>Software installation and MMC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Shanghai qixin scientific instrument co., LTD</td>
			<td>LRH 250</td>
			<td>For the microbial cultivation using solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>AR 3130</td>
			<td>For reagent weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>For droplet collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10011928</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>2.0 mL</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2054</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G66258A</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Pressure Steam Sterilization Pot</td>
			<td>SANYO Electric</td>
			<td>MLS3020</td>
			<td>For autoclaved sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>420322</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>P815661</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>M813895</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>BIOBYING</td>
			<td>1305715</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial Microdroplet Culture System (MMC)</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;MMC-I</td>
			<td>Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&#38;id=110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-ALE-OD</td>
			<td>For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC oil</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-M/S-OD</td>
			<td>The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20026118</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G81793J</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G10267B</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10001518</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>90 mm</td>
			<td>For the preparation of solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>2.5 &#956;L, 10 &#956;L, 100&#956;L, 1000&#956;L</td>
			<td>For liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick connector A</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent bottle</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-PCB</td>
			<td>Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flask</td>
			<td>Union-Biotech</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>For microbial cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.</td>
			<td>SKY-210 2B</td>
			<td>For the microbial cultivation in shake flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8290</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>Draw liquid and inject it into the reagent bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>OUBEL Hardware Store</td>
			<td>22G</td>
			<td>Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature refrigerator</td>
			<td>SANYO Ultra-low</td>
			<td>MDF-U4086S</td>
			<td>For strain preservation (-80 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV&#8211;Vis spectrophotometer</td>
			<td>General Electric Company</td>
			<td>Ultrospec 3100 pro</td>
			<td>For the measurement of OD values</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SV8080</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)

عادة ما يكون لطرق زراعة الميكروبات التقليدية عمليات مرهقة ، وإنتاجية منخفضة ، وكفاءة منخفضة ، واستهلاك كبير للعمالة والكواشف. وعلاوة على ذلك، فإن طرق الزراعة عالية الإنتاجية القائمة على الصفائح الدقيقة التي تم تطويرها في السنوات الأخيرة لها حالة نمو ميكروبية ضعيفة وتوازي تجريبي بسبب انخفاض الأكسجين المذاب، وضعف الخليط، والتبخر الشديد والتأثير الحراري. نظرا للعديد من مزايا القطرات الدقيقة ، مثل الحجم الصغير ، والإنتاجية العالية ، والقدرة القوية على التحكم ، يمكن لتقنية الموائع الدقيقة القائمة على القطرات التغلب على هذه المشكلات ، والتي تم استخدامها في العديد من أنواع الأبحاث حول زراعة الميكروبات عالية الإنتاجية وفحصها وتطورها. ومع ذلك ، لا تزال معظم الدراسات السابقة في مرحلة بناء المختبرات وتطبيقها. بعض القضايا الرئيسية ، مثل المتطلبات التشغيلية العالية ، وصعوبة البناء العالية ، ونقص تكنولوجيا التكامل الآلي ، تحد من التطبيق الواسع لتكنولوجيا الموائع الدقيقة بالقطرات في البحوث الميكروبية. هنا ، تم تطوير نظام آلي لزراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC) بنجاح استنادا إلى تقنية الموائع الدقيقة للقطرات ، مما يحقق تكامل وظائف مثل التلقيح والزراعة والمراقبة عبر الإنترنت والزراعة الفرعية والفرز وأخذ العينات التي تتطلبها عملية زراعة القطرات الميكروبية. في هذا البروتوكول ، تم أخذ الإشريكية القولونية من النوع البري (E. coli) MG1655 وسلالة E. coli الأساسية للميثانول (MeSV2.2) كأمثلة لتقديم كيفية استخدام MMC لإجراء الزراعة الميكروبية الآلية وعالية الإنتاجية نسبيا والتطور التكيفي بالتفصيل. هذه الطريقة سهلة التشغيل ، وتستهلك كمية أقل من العمالة والكواشف ، ولها إنتاجية تجريبية عالية وتوازي جيد للبيانات ، والتي تتمتع بمزايا كبيرة مقارنة بطرق الزراعة التقليدية. ويوفر منصة تجريبية منخفضة التكلفة وصديقة للعمليات وموثوقة النتائج للباحثين العلميين لإجراء البحوث الميكروبية ذات الصلة.

يستخدم هذا البروتوكول E. coli MG1655 وسلالة MeSV2.2 كأمثلة لإثبات الزراعة الميكروبية والتطور التكيفي الأساسي للميثانول مع استراتيجية آلية وعالية الإنتاجية نسبيا في MMC. تم استخدام قياس منحنى النمو بشكل رئيسي لتوصيف الزراعة الميكروبية. تم إجراء التطور التكيفي عن طريق الزراعة الفرعية المستمرة ...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC at JoVE.com

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC

يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام نظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC) لإجراء الزراعة الميكروبية الآلية والتطور التكيفي. يمكن ل MMC زراعة الكائنات الحية الدقيقة وزراعتها بشكل تلقائي ومستمر ومراقبة نموها عبر الإنترنت بإنتاجية عالية نسبيا وتوازي جيد ، مما يقلل من استهلاك العمالة والكواشف.

الزراعة الميكروبية الآلية والتطور التكيفي باستخدام نظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC)

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في حل المشكلات المتعلقة بطرق زراعة الميكروبات التقليدية. وهو يوفر منصة تجريبية منخفضة التكلفة وسهلة التشغيل وموثوقة النتائج للزراعة الميكروبية الآلية والتطور التكيفي. تعمل هذه التقنية على أتمتة العمليات وتقليل استهلاك العمالة بشكل أكبر.وفي الوقت نفسه ، لديها أداء ثقافي جيد مع نتائج موثوقة وعمليات بسيطة. وتستخدم هذه التقنية بشكل رئيسي في مجالات أبحاث علم الأحياء الدقيقة، مثل قياس منحنى النمو، والتطور المختبري التكيفي، وتحليل عامل واحد متعدد المستويات. ابدأ الاستعدادات للتجربة عن طريق توصيل إبرة المحقنة بقطر داخلي يبلغ 0.41 ملم وقطر خارجي يبلغ 0.71 ملم بموصل سريع A وزجاجة كاشف.ثم تعقيم جميع المعدات عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. لتثبيت رقاقة الموائع الدقيقة ، افتح باب غرفة التشغيل وارفع مسبار الألياف البصرية. بعد محاذاة ثقوب المجال الكهربائي مع الإبر ، ضع الشريحة برفق على قاعدة التمثال ، ثم أدخل عمودي تحديد المواقع في فتحات تحديد المواقع ووضع مسبار الألياف البصرية.بعد ذلك ، قم بتوصيل الموصل السريع A الموجود على الشريحة بالمنفذ المقابل لنظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية أو MMC وفقا لرقم الموضع كما هو موضح في المخطوطة. عند الانتهاء ، أغلق باب غرفة العمليات. قم بتخفيف تعليق الإشريكية القولونية MG1655 المزروع بمتوسط OD600 من 0.05 إلى 0.1 للحصول على 10 ملليلتر من محلول البكتيريا الأولي.لتهيئة MMC ، انقر فوق علامة التبويب تهيئة. عندما تظهر واجهة التهيئة ، اضبط درجة حرارة الزراعة على 37 درجة مئوية وقيمة الإشارة الكهروضوئية على 0.6. ستستغرق التهيئة حوالي 20 دقيقة.في وقت لاحق ، ضع زجاجة كاشف معقمة على المقعد النظيف وشد الغطاء. استخدم حقنة معقمة سعة 10 ملليلترات لحقن ثلاثة إلى خمسة ملليلترات من زيت MMC من إبرة المحقنة إلى الأنبوب الجانبي في زجاجة الكاشف. ثم قم بإمالة وتدوير زجاجة الكاشف ببطء لجعل الزيت يتسلل بالكامل إلى الجدار الداخلي.بعد حقن خمسة ملليلترات من محلول البكتيريا الأولي في الزجاجة ، املأ زجاجة الكاشف عن طريق حقن خمسة إلى سبعة ملليلترات من زيت MMC. اسحب الموصل السريع المستقل A من زجاجة الكاشف وأدخل الموصل السريع A في الموصل السريع B للزجاجة لإكمال عملية حقن العينة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، افتح باب غرفة العمليات لوضع زجاجة الكاشف في الحمام المعدني.اسحب موصل C2 الخاص بالشريحة والموصل السريع A لزجاجة الكاشف. قم بتوصيل موصل الأنبوب الجانبي لزجاجة الكاشف بموصل C2 وموصل الأنبوب العلوي بموصل O2. ثم أغلق باب غرفة العمليات.لاختيار وظيفة قياس منحنى النمو ، انقر فوق منحنى النمو في واجهة إعداد المعلمة أدخل الرقم ك 15. ثم قم بتشغيل مفتاح اكتشاف OD واضبط الطول الموجي على 600 نانومتر. انقر فوق علامة التبويب ابدأ لبدء توليد القطيرات.ستستغرق العملية 15 دقيقة حتى تكتمل. عندما تظهر نافذة منبثقة على الواجهة الرئيسية تطالب برسالة ، افتح باب غرفة التشغيل لإخراج زجاجة الكاشف وتوصيل موصلات C2 و O2. بعد إغلاق الباب ، انقر فوق الزر موافق ( OK) في النافذة المنبثقة لزراعة القطرات تلقائيا واكتشاف قيم OD.عندما يصل منحنى النمو إلى المرحلة الثابتة، انقر فوق الزر تصدير البيانات لتصدير بيانات OD. حدد مسار حفظ البيانات وقم بتصدير قيمة OD المسجلة خلال فترة الزراعة بتنسيق CVS لرسم منحنى النمو، استخدم برنامج تعيين مثل Excel وOrigin 9.0. حقن الكميات المطلوبة من محلول البكتيريا الأولي ، الوسط الطازج ، وزيت MMC في زجاجات الكاشف المعقمة المنفصلة لمحلول البكتيريا الأولي في الوسط الطازج كما هو موضح سابقا.لاختيار وظيفة التطور التكيفي ، انقر فوق ALE في البرنامج. في واجهة إعداد المعلمات، قم بتشغيل مفتاح اكتشاف OD، ثم قم بتعيين جميع المعلمات الموضحة في المخطوطة واضغط على علامة التبويب ابدأ لبدء توليد القطيرات. ستستغرق العملية حوالي 25 دقيقة.خلال كل فترة زراعة فرعية ، لاحظ ما إذا كانت قيم OD القصوى للقطرات قد زادت بشكل كبير. إذا حدثت الزيادة وتلبي متطلبات التجربة ، فانقر فوق زر تصدير البيانات لتصدير بيانات OD. لاستخراج القطرات المستهدفة من MMC ، انقر فوق علامة التبويب الفحص لتحديد وظيفة استخراج القطيرات.ثم اختر خيار التجميع وانقر على أرقام القطرات المستهدفة. عند الانتهاء ، انقر فوق موافق. انتظر النافذة المنبثقة التي تطالب بظهور رسالة. ثم ضع الموصل السريع CF في أنبوب الطرد المركزي الدقيق للجمع وانقر فوق موافق. بعد دقيقة إلى دقيقتين عندما تنبثق واجهة البرنامج نافذة جديدة تطالب برسالة ، أدخل الموصل السريع CF مرة أخرى وانقر فوق موافق لجعل MMC يستمر في التشغيل.عندما تصل القطرة المستهدفة التالية إلى موقع التعرف على القطيرات ، قم بجمعها كما هو محدد من قبل. استخدم ماصة سعة 2.5 ميكرولتر لإخراج القطيرة ووضعها على صفيحة صلبة بحجم 90 ملم ، تليها نشر القطرة بالتساوي باستخدام قضيب زجاجي مطلي بمثلث بطول جانبي يبلغ ثلاثة سنتيمترات ، ثم قم بزراعة القطرة في حاضنة درجة حرارة ثابتة 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. في وقت لاحق ، اختر ثلاث إلى خمس مستعمرات مستقلة من البكتيريا لزراعة كل مستعمرة على حدة في قارورة مخفوق سعة 50 ملليلتر مع 10 ملليلتر من الوسط الطازج في حاضنة تهتز بمعدل 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 48 إلى 72 ساعة.بعد الحضانة ، اتبع اللوائح القياسية ذات الصلة لتخزين محلول البكتيريا المستزرعة في أنبوب الجلسرين. يظهر التحليل التمثيلي منحنيات نمو 50 قطرة في عملية التطور التكيفي بأكملها. لوحظ أن سلالة الإشريكية القولونية الأساسية للميثانول أو MeSV2.2 أظهرت نموا بطيئا أوليا يليه نمو سريع.تم رسم منحنى نمو القطيرة السادسة في عملية التطور التكيفية بأكملها بشكل منفصل. كان الحد الأقصى لقيمة OD600 في الجيل الأول 0.37 ، والذي ارتفع إلى 0.58 في فترة الزراعة الفرعية الأخيرة ، مما يشير إلى أن السلالة في القطرة الستة قد حققت تطورا تكيفيا واضحا. علاوة على ذلك ، تمت مقارنة منحنيات نمو سلالة القطرة الستة والسلالة الأولية.أظهرت سلالة القطيرات الستة معدل نمو محدد أقصى وتركيز خلية أعلى في المرحلة الثابتة من السلالة الأولية. الشيء الأكثر أهمية هو التأكد من أن اتصال شريحة الأداة وزجاجة الكاشف صحيح ، وهو قطرات للعمليات للمضي قدما بشكل طبيعي. توفر هذه الطريقة للباحثين فكرة جديدة لزراعة الكائنات الحية الدقيقة وتوفر أيضا منصة فعالة ومنخفضة التكلفة للتطور التكيفي للسلالات.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC)

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

زراعة خلايا الثدييات عن طريق استخدام المفرد نظام هوائي تفاعلات الاحيائية

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

الدراسات انجذاب كهربي من الرئة خلايا سرطان باستخدام القنوات المتعددة ثنائي الكهربائية الميدان ميكروفلويديك رقاقة

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

مفاعل حيوي رواية لزراعة ارتفاع كثافة المجتمعات الميكروبية متنوعة

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

تصميم وتنفيذ لإلقاء الضوء الآلي، التثقيف، ونظام أخذ العينات للتطبيقات الميكروبية علم البصريات الوراثي

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

تجميع وتتبع التنمية المجتمعية الميكروبية داخل منصة ميكرويل صفيف

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

التنقيب عن سلالات الميكروبية للمعالجة الحيوية وتطوير البروبيوتيك للبحوث Metaorganism والحفاظ عليها

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

عملية التحسين باستخدام الإنتاجية العالية الإنتاجية المفاعلات الحيوية الدقيقة الآلية في زراعة الخلايا المبيض الهامستر الصينية

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

توليد المناظر الطبيعية الكيميائية الديناميكية الخاضعة للرقابة لدراسة السلوك الميكروبي

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

تعريف عالي الإنتاجية للمقاومة لـ Pseudomonas syringae pv. الطماطم في الطماطم باستخدام الشتلات الفيضانات أساي

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...