Name: automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)
Uploaded: 2022-02-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), National Key Scientific Instrument and Equipment Project fra National Natural Science Foundation of China (21627812) og Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). Vi takker også professor Julia A. Vorholt (Institut for Mikrobiologi, Biologisk Institut, ETH Zürich, Zürich 8093, Schweiz) for leveringen af den methanol-essentielle E. coli-stamme version 2.2 (MeSV2.2).

1. Installation af instrument og software
<ol><li>Vælg et rent og sterilt miljø (såsom en ren bænk) som et dedikeret permanent rum til MMC. Installer MMC støt i rummet. BEMÆRK: Hold MMC væk fra interferens fra stærke elektriske felter, magnetfelter og stærke varmestrålingskilder. Undgå, at alvorlige vibrationer påvirker de optiske detektionskomponenter. Giv strømforsyningen til AC220 V, 50 HZ til MMC. For detaljer om MMC henvises til tabellen over materialer og hjemmesi...

<ol>
	<li>Lewis, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms.">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li><li>Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+technology+in+industrial+biotechnology.">High-throughput screening technology in industrial biotechnology.</a> Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).</li><li>Kim, J., Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+analysis+for+the+optimization+of+Campylobacter+isolation+from+chicken+carcasses+using+selective+media.">Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).</li><li>Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microscale+processing+technologies+for+quantification+of+biocatalytic+Baeyer-Villiger+oxidation+kinetics.">The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).</li><li>Harms, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+a+24-station+high+throughput+microbioreactor.">Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).</li><li>Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-four+well+plate+miniature+bioreactor+system+as+a+scale-down+model+for+cell+culture+process+development.">Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo-Lector+-+a+novel+platform+for+automated+high-throughput+cultivations+in+microtiter+plates+with+high+information+content.">Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content.</a> Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+a+kinetics+analysis+of+the+high-pressure+inactivation+of+microorganisms+using+microplates.">High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).</li><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics.">Droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li><li>Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+microbiology:+techniques,+applications+and+challenges.">Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).</li><li>Liao, P. Y., Huang, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divide+and+conquer:+analytical+chemistry+of+nucleic+acids+in+droplets.">Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets.</a> Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).</li><li>Jian, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+microdroplet+culture+system+(MMC):+An+integrated+platform+for+automated,+high-throughput+microbial+cultivation+and+adaptive+evolution.">Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).</li><li>Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empowering+a+methanol-dependent+Escherichia+coli+via+adaptive+evolution+using+a+high-throughput+microbial+microdroplet+culture+system.">Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).</li><li>Meyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-essential+growth+of+Escherichia+coli.">Methanol-essential growth of Escherichia coli.</a> Nature Communications. 9, 1508 (2018).</li><li>Gru&#776;nberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+growth+rate+0.6:+Corynebacterium+glutamicum+cultivated+in+highly+diluted+environments.">Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).</li><li>Kaganovitch, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+single-cell+analysis+in+picoliter-sized+batch+cultivation+chambers.">Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers.</a> New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).</li><li>Baraban, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millifluidic+droplet+analyser+for+microbiology.">Millifluidic droplet analyser for microbiology.</a> Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).</li><li>Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+adaptation+in+microdroplet+chemostats.">Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).</li><li>Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+droplet-based+microfluidic+platform+for+multiplexed+analysis+of+biochemical+markers+in+small+volumes.">Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes.</a> Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).</li><li>Watterson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+high-throughput+cultivation+for+accurate+screening+of+antibiotic+resistant+gut+microbes.">Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes.</a> eLife. 9, 56998 (2020).</li><li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactants+in+droplet-based+microfluidics.">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li><li>Nitschke, M., Pastore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+properties+of+a+surfactant+obtained+from+Bacillus+subtilis+grown+on+cassava+wastewater.">Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater.</a> Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).</li><li>Jiang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+biofuels+and+biochemicals+production+from+sustainable+resources+using+co-cultivation+systems.">Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems.</a> Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).</li></ol>

Denne protokol præsenterer, hvordan man bruger det mikrobielle mikrodropletkultursystem (MMC) til at udføre automatiseret mikrobiel dyrkning og langsigtet adaptiv evolution. MMC er et miniaturiseret, automatiseret og mikrobielt dyrkningssystem med høj gennemstrømning. Sammenlignet med konventionelle mikrobielle dyrkningsmetoder og instrumenter med høj gennemstrømning har MMC mange fordele såsom lavt arbejds- og reagensforbrug, enkel betjening, online detektion (OD og fluorescens), dataindsamling med høj tidsoplø...

Mikrobiel dyrkning er et vigtigt fundament for mikrobiologisk videnskabelig forskning og industrielle anvendelser, som i vid udstrækning anvendes til isolering, identifikation, rekonstruktion, screening og udvikling af mikroorganismer 1,2,3. Konventionelle mikrobielle dyrkningsmetoder bruger hovedsageligt reagensglas, rystekolber og faste plader som dyrkningsbeholdere kombineret med rystende inkubatorer, spektrofotometre, mikropladelæsere og andet udstyr til mikrobiel dyrkning, detektion og screening. Disse metoder har imidlertid mange problemer, såsom besværlige operationer, lav gennemstrømning, lav effektivitet og stort forbrug af arbejdskraft og reagenser. De dyrkningsmetoder med høj kapacitet, der er udviklet i de senere år, er hovedsageligt baseret på mikropladen. Men mikropladen har et lavt niveau af opløst ilt, dårlig blandingsegenskab og alvorlig fordampning og termisk effekt, hvilket ofte fører til dårlig vækststatus og eksperimentparallalisering af mikroorganismer 4,5,6,7; på den anden side skal den udstyres med dyrt udstyr, såsom væskehåndteringsarbejdsstationer og mikropladelæsere, for at opnå automatiseret dyrkning og procesdetektion 8,9.
Som en vigtig gren af mikrofluidisk teknologi er dråbemikrofluidik blevet udviklet i de senere år baseret på traditionelle kontinuerlige flow mikrofluidiske systemer. Det er en diskret flowmikrofluidisk teknologi, der bruger to utilgængelige væskefaser (normalt olie-vand) til at generere dispergerede mikrodråber og fungere på dem10. Fordi mikrodråber har karakteristika som lille volumen, stort specifikt overfladeareal, høj intern masseoverførselshastighed og ingen krydskontaminering forårsaget af opdeling og fordelene ved stærk styrbarhed og høj gennemstrømning af dråber, har der været mange former for forskning, der anvender dråbemikrofluidisk teknologi i dyrkning, screening og udvikling af mikroorganismer med høj gennemstrømning11 . Der er dog stadig en række nøgleproblemer for at gøre dråbemikrofluidisk teknologi populariseret og bredt anvendt. For det første er driften af dråbemikrofluidik besværlig og indviklet, hvilket resulterer i høje tekniske krav til operatørerne. For det andet kombinerer dråbemikrofluidisk teknologi optiske, mekaniske og elektriske komponenter og skal forbindes med bioteknologiske applikationsscenarier. Det er vanskeligt for et enkelt laboratorium eller team at bygge effektive dråbemikrofluidiske kontrolsystemer, hvis der ikke er noget tværfagligt samarbejde. For det tredje kræver det på grund af den lille mængde mikrodråbe (fra picoliter (pL) til mikroliter (μL)) meget vanskelighed at realisere den præcise automatiserede kontrol og onlinedetektion i realtid af dråber til nogle grundlæggende mikrobielle operationer såsom underdyrkning, sortering og prøveudtagning, og det er også vanskeligt at konstruere et integreret udstyrssystem12.
For at løse ovenstående problemer blev der med succes udviklet et automatisk mikrobielt mikrodråbekultursystem (MMC) baseret på dråbemikrofluidisk teknologi13. MMC består af fire funktionelle moduler: et dråbegenkendelsesmodul, et dråbespektrumdetektionsmodul, et mikrofluidisk chipmodul og et prøveudtagningsmodul. Gennem systemintegration og kontrol af alle moduler etableres automatiseret driftssystem, herunder produktion, dyrkning, måling (optisk densitet (OD) og fluorescens), opdeling, fusion, sortering af dråber nøjagtigt, idet der opnås integration af funktioner såsom podning, dyrkning, overvågning, underdyrkning, sortering og prøveudtagning, der kræves ved processen med mikrobiel dråbedyrkning. MMC kan rumme op til 200 replikate dråbedyrkningsenheder på 2-3 μL volumen, hvilket svarer til 200 dyrkningsenheder for rystekolber. Mikrodråbedyrkningssystemet kan opfylde kravene til ikke-kontaminering, opløst ilt, blanding og masseenergiudveksling under vækst af mikroorganismer og opfylde de forskellige behov for mikrobiel forskning gennem flere integrerede funktioner, f.eks. vækstkurvemåling, adaptiv evolution, enkeltfaktoranalyse på flere niveauer og metabolitforskning og -analyse (baseret på fluorescensdetektion)13,14.
Her introducerer protokollen, hvordan man bruger MMC til at udføre automatiseret og mikrobiel dyrkning og adaptiv evolution i detaljer (figur 1). Vi tog vildtype Escherichia coli (E. coli) MG1655 som et eksempel for at demonstrere vækstkurvemålingen og en methanol-essentiel E. coli-stamme MeSV2.215 for at demonstrere den adaptive udvikling i MMC. Der blev udviklet en driftssoftware til MMC, hvilket gør operationen meget enkel og klar. I hele processen skal brugeren forberede den oprindelige bakterieopløsning, indstille MMC-betingelserne og derefter injicere bakterieopløsningen og relaterede reagenser i MMC' tilstand. Derefter udfører MMC automatisk operationer såsom dråbegenerering, genkendelse og nummerering, dyrkning og adaptiv evolution. Det udfører også online detektion (OD og fluorescens) af dråberne med høj tidsopløsning og viser de relaterede data (som kan eksporteres) i softwaren. Operatøren kan til enhver tid stoppe dyrkningsprocessen i henhold til resultaterne og udtrække måldråberne til efterfølgende forsøg. MMC er let at betjene, bruger mindre arbejdskraft og reagenser og har relativt høj eksperimentel gennemstrømning og god dataparallensitet, hvilket har betydelige fordele sammenlignet med konventionelle dyrkningsmetoder. Det giver en billig, driftsvenlig og robust eksperimentel platform for forskere til at udføre relateret mikrobiel forskning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m PVDF filter membrane</td>
			<td>Merck Millipore Ltd.</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Sterilize the MMC oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-289BSW</td>
			<td>For reagent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>For solid plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20011160</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.</td>
			<td>DL-CJ-INDII</td>
			<td>For aseptic operation and UV sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10007216</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>E450</td>
			<td>Software installation and MMC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Shanghai qixin scientific instrument co., LTD</td>
			<td>LRH 250</td>
			<td>For the microbial cultivation using solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>AR 3130</td>
			<td>For reagent weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>For droplet collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10011928</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>2.0 mL</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2054</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G66258A</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Pressure Steam Sterilization Pot</td>
			<td>SANYO Electric</td>
			<td>MLS3020</td>
			<td>For autoclaved sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>420322</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>P815661</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>M813895</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>BIOBYING</td>
			<td>1305715</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial Microdroplet Culture System (MMC)</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;MMC-I</td>
			<td>Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&#38;id=110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-ALE-OD</td>
			<td>For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC oil</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-M/S-OD</td>
			<td>The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20026118</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G81793J</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G10267B</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10001518</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>90 mm</td>
			<td>For the preparation of solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>2.5 &#956;L, 10 &#956;L, 100&#956;L, 1000&#956;L</td>
			<td>For liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick connector A</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent bottle</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-PCB</td>
			<td>Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flask</td>
			<td>Union-Biotech</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>For microbial cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.</td>
			<td>SKY-210 2B</td>
			<td>For the microbial cultivation in shake flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8290</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>Draw liquid and inject it into the reagent bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>OUBEL Hardware Store</td>
			<td>22G</td>
			<td>Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature refrigerator</td>
			<td>SANYO Ultra-low</td>
			<td>MDF-U4086S</td>
			<td>For strain preservation (-80 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV&#8211;Vis spectrophotometer</td>
			<td>General Electric Company</td>
			<td>Ultrospec 3100 pro</td>
			<td>For the measurement of OD values</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SV8080</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)

Konventionelle mikrobielle dyrkningsmetoder har normalt besværlige operationer, lav gennemstrømning, lav effektivitet og stort forbrug af arbejdskraft og reagenser. Desuden har mikropladebaserede dyrkningsmetoder med høj gennemstrømning, der er udviklet i de senere år, dårlig mikrobiel vækststatus og eksperimentparallalisering på grund af deres lave opløste ilt, dårlige blanding og alvorlige fordampning og termiske virkning. På grund af mange fordele ved mikrodråber, såsom lille volumen, høj gennemstrømning og stærk styrbarhed, kan den dråbebaserede mikrofluidiske teknologi overvinde disse problemer, som er blevet brugt i mange former for forskning i mikrobiel dyrkning, screening og evolution med høj gennemstrømning. De fleste tidligere undersøgelser forbliver dog på laboratoriets konstruktion og anvendelse. Nogle centrale spørgsmål, såsom høje driftskrav, høje konstruktionsvanskeligheder og mangel på automatiseret integrationsteknologi, begrænser den brede anvendelse af dråbemikrofluidisk teknologi i mikrobiel forskning. Her blev et automatiseret mikrobielt mikrodråbekultursystem (MMC) med succes udviklet baseret på dråbemikrofluidisk teknologi, der opnåede integration af funktioner som podning, dyrkning, online overvågning, underdyrkning, sortering og prøveudtagning, der kræves af processen med mikrobiel dråbedyrkning. I denne protokol blev vildtype Escherichia coli (E. coli) MG1655 og en methanol-essentiel E. coli-stamme (MeSV2.2) taget som eksempler for at introducere, hvordan man bruger MMC til at udføre automatiseret og relativt høj gennemstrømning mikrobiel dyrkning og adaptiv evolution i detaljer. Denne metode er nem at betjene, bruger mindre arbejdskraft og reagenser og har høj eksperimentel gennemstrømning og god dataparallensitet, hvilket har store fordele sammenlignet med konventionelle dyrkningsmetoder. Det giver en billig, driftsvenlig og resultatpåståelig eksperimentel platform for videnskabelige forskere til at udføre relateret mikrobiel forskning.

Denne protokol bruger E. coli MG1655 og en MeSV2.2-stamme som eksempler til at demonstrere den mikrobielle dyrkning og methanol-essentielle adaptive evolution med en automatiseret og relativt høj gennemstrømningsstrategi i MMC. Vækstkurvemålingen blev hovedsageligt brugt til at karakterisere mikrobiel dyrkning. Den adaptive evolution blev udført ved automatiseret kontinuerlig underdyrkning og tilsætning af en høj koncentration af methanol som det selektive tryk under hver underdyrkning. Hvorvidt adaptiv e...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC at JoVE.com

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC

Denne protokol beskriver, hvordan man bruger det mikrobielle mikrodropletkultursystem (MMC) til at udføre automatiseret mikrobiel dyrkning og adaptiv evolution. MMC kan dyrke og underdyrke mikroorganismer automatisk og kontinuerligt og overvåge deres vækst online med relativt høj gennemstrømning og god parallelisering, hvilket reducerer arbejdskraft- og reagensforbruget.

Automatiseret mikrobiel dyrkning og adaptiv evolution ved hjælp af mikrobielt mikrodrøblekultursystem (MMC)

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and ...

Denne metode kan hjælpe med at løse problemerne med de konventionelle mikrobielle dyrkningsmetoder. Det giver en billig, driftsvenlig og resultatanbeholdelig eksperimentel platform til automatiseret mikrobiel dyrkning og adaptiv evolution. Denne teknologi automatiserer operationer, og større reducerer arbejdsforbruget.Og samtidig har den god kulturpræstation med pålidelige resultater og enkle operationer. Teknologien anvendes hovedsageligt inden for mikrobiologiske forskningsområder, såsom vækstkurvemåling, adaptiv laboratorieudvikling og en enkeltfaktoranalyse på flere niveauer. Start præparaterne af eksperimentet ved at forbinde sprøjtenålen med en indvendig diameter på 0,41 millimeter og en ydre diameter på 0,71 millimeter til et hurtigt stik A og reagensflaske.Derefter autoklaver alt udstyr ved 121 grader Celsius i 15 minutter. For at installere den mikrofluidiske chip skal du åbne døren til driftskammeret og løfte den optiske fibersonde. Når du har justeret de elektriske felthuller med nålene, skal du forsigtigt placere chippen på chippiedestalen, derefter indsætte de to positioneringskolonner i positionshullerne og lægge den optiske fibersonde ned.Tilslut derefter hurtigstikket A på chippen til den tilsvarende port i det mikrobielle mikrodrøblekultursystem eller MMC i henhold til positionsnummeret som beskrevet i manuskriptet. Når du er færdig, skal du lukke døren til operationskammeret. Fortynd den dyrkede Escherichia coli MG1655-suspension med mediet til en OD600 på 0,05 til 0,1 for at opnå 10 ml indledende bakterieopløsning.For at initialisere MMC skal du klikke på fanen Initialisering. Når initialiseringsgrænsefladen vises, skal du indstille dyrkningstemperaturen til 37 grader Celsius og den fotoelektriske signalværdi til 0,6. Initialisering tager cirka 20 minutter.Senere skal du placere en steriliseret reagensflaske på den rene bænk og stramme hætten. Brug en steril sprøjte på 10 ml til at injicere tre til fem milliliter MMC-olie fra sprøjtenålen til siderøret i reagensflasken. Vip derefter og drej reagensflasken langsomt for at få olien til at infiltrere den indre væg fuldt ud.Efter injektion af fem milliliter af en indledende bakterieopløsning i flasken fyldes reagensflasken ved at injicere fem til syv ml MMC-olie. Træk det uafhængige hurtigstik A på reagensflasken ud, og sæt hurtigstikket A i flaskens hurtigstik B for at fuldføre prøveinjektionen. Når det er gjort, skal du åbne døren til operationskammeret for at sætte reagensflasken i metalbadet.Træk C2-stikket på chippen og hurtigstikket A på reagensflasken ud. Tilslut reagensflaskens siderørsstik til C2-stikket og det øverste rørstik til O2-stikket. Luk derefter døren til operationskammeret.For at vælge funktionen af vækstkurvemåling skal du klikke på Vækstkurve i parameterindstillingsgrænsefladen indtast tallet som 15. Tænd derefter OD-detektionskontakten, og indstil bølgelængden til 600 nanometer. Klik på fanen Start for at starte dråbegenerering.Processen tager 15 minutter at gennemføre. Når der vises et popup-vindue på hovedgrænsefladen, der beder om en meddelelse, skal du åbne døren til operationskammeret for at tage reagensflasken ud og tilslutte C2- og O2-stikkene. Når du har lukket døren, skal du klikke på knappen OK i pop op-vinduet for automatisk at dyrke dråberne og registrere OD-værdierne.Når vækstkurven når den stationære fase, skal du klikke på knappen Dataeksport for at eksportere OD-dataene. Vælg datasparestien, og eksporter od-værdien, der er registreret i dyrkningsperioden, i CVS-formatet Hvis du vil afbilde vækstkurven, skal du bruge tilknytningssoftware som Excel og Origin 9.0. Injicer de nødvendige mængder af den oprindelige bakterieopløsning, frisk medium og MMC-olie i de separate steriliserede reagensflasker til den oprindelige bakterieopløsning i det friske medium som forklaret tidligere.For at vælge funktionen af adaptiv evolution skal du klikke på ALE i softwaren. I parameterindstillingsgrænsefladen skal du tænde OD-detektionskontakten, derefter indstille alle de parametre, der er beskrevet i manuskriptet, og trykke på fanen Start for at starte dråbegenerering. Processen tager cirka 25 minutter.I løbet af hver deldyrkningsperiode skal du observere, om dråbernes maksimale OD-værdier er steget betydeligt. Hvis stigningen sker og opfylder eksperimentkravene, skal du klikke på knappen Dataeksport for at eksportere OD-dataene. For at udtrække måldråberne fra MMC skal du klikke på screeningsfanen for at vælge funktionen af dråbeekstraktion.Vælg derefter Saml mulighed og klik på antallet af måldråber. Når du er færdig, skal du klikke på OK. Vent på popup-vinduet, der beder om en besked. Sæt derefter CF-hurtigstikket i mikrocentrifugerøret til opsamling, og klik på OK. Efter et til to minutter, når softwaregrænsefladen dukker op i et nyt vindue, der beder om en meddelelse, skal du indsætte CF quick connector tilbage og klikke på OK for at få MMC til at fortsætte med at køre.Når den næste måldråbe når dråbegenkendelsesstedet, skal du indsamle den som angivet før. Brug en 2,5 mikroliter pipette til at tage ud og placere dråben på en 90 millimeter solid plade, efterfulgt af at sprede dråben jævnt med en glas trekantet belagt stang med en sidelængde på tre centimeter, og dyrk derefter dråben i en 37 grader Celsius konstant temperatur inkubator i 72 timer. Senere skal du vælge tre til fem uafhængige kolonier af bakterier for at dyrke hver koloni separat i en 50 ml rystekolbe med 10 ml frisk medium i en rystende inkubator ved 200 rotationer i minuttet og 37 grader Celsius i 48 til 72 timer.Efter inkubationen skal du følge de relaterede standardbestemmelser for at opbevare den dyrkede bakterieopløsning i glycerolrøret. Den repræsentative analyse viser vækstkurverne for 50 dråber i hele den adaptive udviklingsproces. Det blev observeret, at methanol essentielle Escherichia coli stamme eller MeSV2.2 viste indledende langsom vækst efterfulgt af hurtig vækst.Vækstkurven for dråbe seks i hele den adaptive udviklingsproces blev plottet separat. Den maksimale OD600-værdi i første generation var 0,37, hvilket steg til 0,58 i den sidste underdyrkningsperiode, hvilket indikerer, at stammen i dråbe seks har realiseret en åbenlys adaptiv udvikling. Desuden blev vækstkurverne for dråbe seks-stammen og den oprindelige stamme sammenlignet.Dråbe seks-stammen udviste en højere maksimal specifik væksthastighed og cellekoncentration i den stationære fase end den oprindelige stamme. Det vigtigste er at sikre, at forbindelsen mellem instrumentchippen og reagensflasken er korrekt, hvilket er dråberne til operationer, der skal fortsætte normalt. Denne metode giver forskere en ny idé til dyrkning af mikroorganismer og giver også en effektiv og billig platform til adaptiv udvikling af stammer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC)

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Dyrkning af pattedvrceller hjælp af en enkelt brug Pneumatic bioreaktorsystem

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier af lungecancerceller ved hjælp af en Multichannel Dual-elektriske-felt Mikrofluid Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A Novel bioreaktor for High Density Dyrkning af Diverse mikrobielle samfund

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design og implementering af en automatiseret lysende, Dyrkning, og Sampling System for Mikrobiel optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Samling og sporing af mikrobiell fællesskabsudvikling inden for en Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Prospektering mikrobielle stammer for bioremediation og probiotika udvikling for meta organ forskning og konservering

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Procesoptimering ved hjælp af høj gennemløb automatiseret mikro-bioreaktorer i kinesisk Hamster Ovary Cell Dyrkning

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Generering af kontrollerede, dynamiske kemiske landskaber til undersøgelse af mikrobiel adfærd

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identifikation af resistens over for Pseudomonas syringae pv. Tomat i tomat ved hjælp af sætteplante Oversvømmelse Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...