Name: automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)
Uploaded: 2022-02-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door het National Key Research and Development Program van China (2018YFA0901500), het National Key Scientific Instrument and Equipment Project van de National Natural Science Foundation of China (21627812) en het Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). We danken ook Prof. Julia A. Vorholt (Instituut voor Microbiologie, Afdeling Biologie, ETH Zürich, Zürich 8093, Zwitserland) voor de levering van de methanol-essentiële E. coli stam versie 2.2 (MeSV2.2).

1. Installatie van instrumenten en software
<ol><li>Kies een schone en steriele omgeving (zoals een schone bank) als speciale permanente ruimte voor MMC. Installeer de MMC gestaag in de ruimte. OPMERKING: Houd de MMC uit de buurt van de interferentie van sterke elektrische velden, magnetische velden en sterke warmtestralingsbronnen. Voorkom dat ernstige trillingen de optische detectiecomponenten aantasten. Zorg voor de voeding van AC220 V, 50 HZ naar de MMC. Voor meer informatie over MMC verwijzen w...

<ol>
	<li>Lewis, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms.">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li><li>Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+technology+in+industrial+biotechnology.">High-throughput screening technology in industrial biotechnology.</a> Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).</li><li>Kim, J., Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+analysis+for+the+optimization+of+Campylobacter+isolation+from+chicken+carcasses+using+selective+media.">Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).</li><li>Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microscale+processing+technologies+for+quantification+of+biocatalytic+Baeyer-Villiger+oxidation+kinetics.">The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).</li><li>Harms, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+a+24-station+high+throughput+microbioreactor.">Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).</li><li>Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-four+well+plate+miniature+bioreactor+system+as+a+scale-down+model+for+cell+culture+process+development.">Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo-Lector+-+a+novel+platform+for+automated+high-throughput+cultivations+in+microtiter+plates+with+high+information+content.">Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content.</a> Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+a+kinetics+analysis+of+the+high-pressure+inactivation+of+microorganisms+using+microplates.">High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).</li><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics.">Droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li><li>Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+microbiology:+techniques,+applications+and+challenges.">Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).</li><li>Liao, P. Y., Huang, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divide+and+conquer:+analytical+chemistry+of+nucleic+acids+in+droplets.">Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets.</a> Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).</li><li>Jian, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+microdroplet+culture+system+(MMC):+An+integrated+platform+for+automated,+high-throughput+microbial+cultivation+and+adaptive+evolution.">Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).</li><li>Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empowering+a+methanol-dependent+Escherichia+coli+via+adaptive+evolution+using+a+high-throughput+microbial+microdroplet+culture+system.">Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).</li><li>Meyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-essential+growth+of+Escherichia+coli.">Methanol-essential growth of Escherichia coli.</a> Nature Communications. 9, 1508 (2018).</li><li>Gru&#776;nberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+growth+rate+0.6:+Corynebacterium+glutamicum+cultivated+in+highly+diluted+environments.">Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).</li><li>Kaganovitch, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+single-cell+analysis+in+picoliter-sized+batch+cultivation+chambers.">Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers.</a> New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).</li><li>Baraban, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millifluidic+droplet+analyser+for+microbiology.">Millifluidic droplet analyser for microbiology.</a> Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).</li><li>Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+adaptation+in+microdroplet+chemostats.">Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).</li><li>Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+droplet-based+microfluidic+platform+for+multiplexed+analysis+of+biochemical+markers+in+small+volumes.">Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes.</a> Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).</li><li>Watterson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+high-throughput+cultivation+for+accurate+screening+of+antibiotic+resistant+gut+microbes.">Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes.</a> eLife. 9, 56998 (2020).</li><li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactants+in+droplet-based+microfluidics.">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li><li>Nitschke, M., Pastore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+properties+of+a+surfactant+obtained+from+Bacillus+subtilis+grown+on+cassava+wastewater.">Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater.</a> Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).</li><li>Jiang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+biofuels+and+biochemicals+production+from+sustainable+resources+using+co-cultivation+systems.">Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems.</a> Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).</li></ol>

Dit protocol presenteert hoe het microbiële microdruppelcultuursysteem (MMC) kan worden gebruikt om geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie op lange termijn uit te voeren. MMC is een geminiaturiseerd, geautomatiseerd en high-throughput microbieel teeltsysteem. In vergelijking met conventionele microbiële teeltmethoden en -instrumenten met hoge doorvoer heeft MMC veel voordelen, zoals een laag arbeids- en reagensverbruik, eenvoudige bediening, online detectie (OD en fluorescentie), gegevensverzameling m...

Microbiële teelt is een belangrijke basis voor microbiologisch wetenschappelijk onderzoek en industriële toepassingen, die veel wordt gebruikt bij de isolatie, identificatie, reconstructie, screening en evolutie van micro-organismen 1,2,3. Conventionele microbiële teeltmethoden gebruiken voornamelijk reageerbuizen, schudkolven en vaste platen als teeltcontainers, gecombineerd met schudincubators, spectrofotometers, microplaatlezers en andere apparatuur voor microbiële teelt, detectie en screening. Deze methoden hebben echter veel problemen, zoals omslachtige bewerkingen, lage doorvoer, lage efficiëntie en groot verbruik van arbeid en reagentia. De teeltmethoden met hoge doorvoer die de afgelopen jaren zijn ontwikkeld, zijn voornamelijk gebaseerd op de microplaat. Maar de microplaat heeft een laag niveau van opgeloste zuurstof, slechte mengeigenschappen en ernstige verdamping en thermisch effect, wat vaak leidt tot een slechte groeistatus en experimentlillaatologie van micro-organismen 4,5,6,7; aan de andere kant moet het worden uitgerust met dure apparatuur, zoals vloeistofbehandelingswerkstations en microplaatlezers, om geautomatiseerde teelt- en procesdetectiete bereiken 8,9.
Als een belangrijke tak van microfluïdische technologie is de afgelopen jaren druppelmicrofluïdica ontwikkeld op basis van traditionele continustromende microfluïdische systemen. Het is een discrete flow microfluïdische technologie die twee onmengbare vloeibare fasen (meestal olie-water) gebruikt om gedispergeerde microdruppels te genereren en erop te werken10. Omdat microdruppels de kenmerken hebben van een klein volume, een groot specifiek oppervlak, een hoge interne massaoverdrachtsnelheid en geen kruisbesmetting veroorzaakt door compartimentering, en de voordelen van sterke controleerbaarheid en hoge doorvoer van druppels, zijn er vele soorten onderzoek geweest waarbij druppelmicrofluïdische technologie wordt toegepast in de teelt, screening en evolutie van micro-organismen met hoge doorvoer11 . Er zijn echter nog steeds een aantal belangrijke problemen om druppelmicrofluïdische technologie populair te maken en op grote schaal toe te passen. Ten eerste is de werking van druppelmicrofluïdica omslachtig en ingewikkeld, wat resulteert in hoge technische vereisten voor operators. Ten tweede combineert druppelmicrofluïdische technologie optische, mechanische en elektrische componenten en moet deze worden geassocieerd met biotechnologische toepassingsscenario's. Het is moeilijk voor een enkel laboratorium of team om efficiënte druppelmicrofluïdische controlesystemen te bouwen als er geen multidisciplinaire samenwerking is. Ten derde kost het vanwege het kleine volume microdruppels (van picoliter (pL) tot microliter (μL)) veel moeite om de nauwkeurige geautomatiseerde controle en real-time online detectie van druppels te realiseren voor enkele elementaire microbiële bewerkingen zoals subteelt, sortering en bemonstering, en het is ook moeilijk om een geïntegreerd apparatuursysteem te bouwen12.
Om de bovenstaande problemen aan te pakken, werd met succes een automatisch microbieel microdruppelcultuursysteem (MMC) ontwikkeld op basis van druppelmicrofluïdische technologie13. Het MMC bestaat uit vier functionele modules: een druppelherkenningsmodule, een druppelspectrumdetectiemodule, een microfluïdische chipmodule en een bemonsteringsmodule. Door de systeemintegratie en -controle van alle modules wordt het geautomatiseerde besturingssysteem inclusief de generatie, teelt, meting (optische dichtheid (OD) en fluorescentie), splitsen, fusie, sortering van druppels nauwkeurig vastgesteld, waardoor de integratie van functies zoals inenting, teelt, monitoring, subteelt, sortering en bemonstering die nodig is voor het proces van microbiële druppelteelt wordt bereikt. MMC kan tot 200 replicerende druppelteelteenheden van 2-3 μL volume bevatten, wat overeenkomt met 200 schudkolf teelteenheden. Het microdruppelteeltsysteem kan voldoen aan de vereisten van niet-contaminatie, opgeloste zuurstof, mengen en massa-energie-uitwisseling tijdens de groei van micro-organismen, en voldoen aan de verschillende behoeften van microbieel onderzoek door middel van meerdere geïntegreerde functies, bijvoorbeeld groeicurvemeting, adaptieve evolutie, single factor multi-level analyse en metabolietonderzoek en -analyse (gebaseerd op fluorescentiedetectie)13,14.
Hier introduceert het protocol hoe de MMC te gebruiken om geautomatiseerde en microbiële teelt en adaptieve evolutie in detail uit te voeren (figuur 1). We namen wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 als voorbeeld om de groeicurvemeting en een methanol-essentiële E. coli-stam MeSV2.215 aan te tonen om de adaptieve evolutie in MMC aan te tonen. Er is een bedieningssoftware voor MMC ontwikkeld, die de bediening zeer eenvoudig en duidelijk maakt. In het hele proces moet de gebruiker de initiële bacterieoplossing bereiden, de voorwaarden van de MMC instellen en vervolgens de bacterieoplossing en gerelateerde reagentia in de MMC injecteren. Vervolgens zal de MMC automatisch bewerkingen uitvoeren zoals druppelgeneratie, herkenning en nummering, teelt en adaptieve evolutie. Het zal ook online detectie (OD en fluorescentie) van de druppels met een hoge tijdresolutie uitvoeren en de gerelateerde gegevens (die kunnen worden geëxporteerd) in de software weergeven. De operator kan het teeltproces op elk moment stoppen op basis van de resultaten en de doeldruppels extraheren voor volgende experimenten. De MMC is eenvoudig te bedienen, verbruikt minder arbeid en reagentia en heeft een relatief hoge experimentele doorvoer en een goede gegevensparallelliteit, wat aanzienlijke voordelen heeft in vergelijking met conventionele teeltmethoden. Het biedt een goedkoop, bedrijfsvriendelijk en robuust experimenteel platform voor onderzoekers om gerelateerd microbieel onderzoek uit te voeren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m PVDF filter membrane</td>
			<td>Merck Millipore Ltd.</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Sterilize the MMC oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-289BSW</td>
			<td>For reagent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>For solid plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20011160</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.</td>
			<td>DL-CJ-INDII</td>
			<td>For aseptic operation and UV sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10007216</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>E450</td>
			<td>Software installation and MMC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Shanghai qixin scientific instrument co., LTD</td>
			<td>LRH 250</td>
			<td>For the microbial cultivation using solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>AR 3130</td>
			<td>For reagent weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>For droplet collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10011928</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>2.0 mL</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2054</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G66258A</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Pressure Steam Sterilization Pot</td>
			<td>SANYO Electric</td>
			<td>MLS3020</td>
			<td>For autoclaved sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>420322</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>P815661</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>M813895</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>BIOBYING</td>
			<td>1305715</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial Microdroplet Culture System (MMC)</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;MMC-I</td>
			<td>Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&#38;id=110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-ALE-OD</td>
			<td>For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC oil</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-M/S-OD</td>
			<td>The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20026118</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G81793J</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G10267B</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10001518</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>90 mm</td>
			<td>For the preparation of solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>2.5 &#956;L, 10 &#956;L, 100&#956;L, 1000&#956;L</td>
			<td>For liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick connector A</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent bottle</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-PCB</td>
			<td>Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flask</td>
			<td>Union-Biotech</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>For microbial cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.</td>
			<td>SKY-210 2B</td>
			<td>For the microbial cultivation in shake flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8290</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>Draw liquid and inject it into the reagent bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>OUBEL Hardware Store</td>
			<td>22G</td>
			<td>Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature refrigerator</td>
			<td>SANYO Ultra-low</td>
			<td>MDF-U4086S</td>
			<td>For strain preservation (-80 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV&#8211;Vis spectrophotometer</td>
			<td>General Electric Company</td>
			<td>Ultrospec 3100 pro</td>
			<td>For the measurement of OD values</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SV8080</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)

Conventionele microbiële teeltmethoden hebben meestal omslachtige bewerkingen, lage doorvoer, lage efficiëntie en groot verbruik van arbeid en reagentia. Bovendien hebben microplaatgebaseerde teeltmethoden met hoge doorvoer die in de afgelopen jaren zijn ontwikkeld, een slechte microbiële groeistatus en experimentparallellisatie vanwege hun lage opgeloste zuurstof, slechte mengsel en ernstige verdamping en thermisch effect. Vanwege de vele voordelen van microdruppels, zoals een klein volume, een hoge doorvoer en een sterke controleerbaarheid, kan de op druppels gebaseerde microfluïdische technologie deze problemen overwinnen, die is gebruikt in vele soorten onderzoek naar microbiële teelt, screening en evolutie met hoge doorvoer. De meeste eerdere studies bevinden zich echter nog in het stadium van laboratoriumconstructie en -toepassing. Enkele belangrijke kwesties, zoals hoge operationele vereisten, hoge constructiemoeilijkheden en gebrek aan geautomatiseerde integratietechnologie, beperken de brede toepassing van druppelmicrofluïdische technologie in microbieel onderzoek. Hier werd met succes een geautomatiseerd microbieel microdruppelcultuursysteem (MMC) ontwikkeld op basis van druppelmicrofluïdische technologie, waarmee de integratie van functies zoals inenting, teelt, online monitoring, subteelt, sortering en bemonstering werd bereikt die vereist zijn voor het proces van microbiële druppelteelt. In dit protocol werden wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 en een methanol-essentiële E. coli-stam (MeSV2.2) als voorbeelden genomen om te introduceren hoe de MMC kan worden gebruikt om geautomatiseerde en relatief hoge doorvoer microbiële teelt en adaptieve evolutie in detail uit te voeren. Deze methode is eenvoudig te bedienen, verbruikt minder arbeid en reagentia en heeft een hoge experimentele doorvoer en een goede gegevensparallelliteit, wat grote voordelen heeft in vergelijking met conventionele teeltmethoden. Het biedt een goedkoop, bedrijfsvriendelijk en resultaatbetrouwbaar experimenteel platform voor wetenschappelijke onderzoekers om gerelateerd microbieel onderzoek uit te voeren.

Dit protocol gebruikt E. coli MG1655 en een MeSV2.2-stam als voorbeelden om de microbiële teelt en methanol-essentiële adaptieve evolutie aan te tonen met een geautomatiseerde en relatief hoge doorvoerstrategie in MMC. De groeicurvemeting werd vooral gebruikt om microbiële teelt te karakteriseren. De adaptieve evolutie werd uitgevoerd door geautomatiseerde continue subteelt en het toevoegen van een hoge concentratie methanol als de selectieve druk tijdens elke subteelt. Of adaptieve evolutie was gerealiseerd,...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC at JoVE.com

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC

Dit protocol beschrijft hoe het Microbial Microdroplet Culture-systeem (MMC) kan worden gebruikt om geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie uit te voeren. MMC kan micro-organismen automatisch en continu cultiveren en subcultureren en online hun groei volgen met een relatief hoge doorvoer en goede parallellisatie, waardoor het arbeids- en reagensverbruik wordt verminderd.

Geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie met behulp van microbieel microdruppelcultuursysteem (MMC)

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and ...

Deze methode kan helpen bij het oplossen van de problemen met de conventionele microbiële teeltmethoden. Het biedt een goedkoop, bedrijfsvriendelijk en resultaatbetrouwbaar experimenteel platform voor geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie. Deze technologie automatiseert bewerkingen en vermindert het arbeidsverbruik aanzienlijk.En tegelijkertijd heeft het goede cultuurprestaties met betrouwbare resultaten en eenvoudige bewerkingen. De technologie wordt voornamelijk gebruikt in de microbiologische onderzoeksvelden, zoals het meten van de groeicurve, adaptieve laboratoriumevolutie en een single factor multi-level analyse. Start de voorbereidingen van het experiment door de naald van de spuit met een binnendiameter van 0,41 millimeter en een buitendiameter van 0,71 millimeter aan te sluiten op een snelkoppeling A en reagensfles.Autoclaaf vervolgens alle apparatuur op 121 graden Celsius gedurende 15 minuten. Om de microfluïdische chip te installeren, opent u de deur van de operatiekamer en tilt u de optische vezelsonde op. Nadat u de elektrische veldgaten met de naalden hebt uitgelijnd, plaatst u de chip voorzichtig op het spaanakkel, plaatst u vervolgens de twee positioneringskolommen in de positioneringsgaten en plaatst u de optische vezelsonde.Sluit vervolgens de snelkoppeling A op de chip aan op de overeenkomstige poort van het microbiële microdruppelcultuursysteem of MMC volgens het positienummer zoals beschreven in het manuscript. Als u klaar bent, sluit u de deur van de operatiekamer. Verdun de gekweekte Escherichia coli MG1655 suspensie met het medium tot een OD600 van 0,05 tot 0,1 om 10 milliliter initiële bacterieoplossing te verkrijgen.Om de MMC te initialiseren, klikt u op het tabblad Initialisatie. Wanneer de initialisatie-interface verschijnt, stelt u de teelttemperatuur in op 37 graden Celsius en de foto-elektrische signaalwaarde op 0,6. De initialisatie duurt ongeveer 20 minuten.Plaats later een gesteriliseerde reagensfles op de schone bank en draai de dop vast. Gebruik een steriele spuit van 10 milliliter om drie tot vijf milliliter MMC-olie van de naald van de spuit naar de zijbuis in de reagensfles te injecteren. Kantel en draai vervolgens de reagensfles langzaam om de olie volledig in de binnenwand te laten infiltreren.Na het injecteren van vijf milliliter van een initiële bacterie-oplossing in de fles, vult u de reagensfles door vijf tot zeven milliliter van de MMC-olie te injecteren. Trek de onafhankelijke snelkoppeling A van de reagensfles eruit en steek de snelkoppeling A in de snelkoppeling B van de fles om de monsterinjectie te voltooien. Als u klaar bent, opent u de deur van de operatiekamer om de reagensfles in het metalen bad te plaatsen.Trek de C2-connector van de chip en de snelkoppeling A van de reagensfles eruit. Sluit de zijbuisconnector van de reagensfles aan op de C2-connector en de bovenbuisconnector op de O2-connector. Sluit vervolgens de deur van de operatiekamer.Om de functie van het meten van de groeicurve te kiezen, klikt u op Groeicurve in de interface voor parameterinstellingen en voert u het getal in als 15. Schakel vervolgens de OD-detectieschakelaar in en stel de golflengte in op 600 nanometer. Klik op het tabblad Start om het genereren van druppels te starten.Het proces duurt 15 minuten om te voltooien. Wanneer er een pop-upvenster op de hoofdinterface verschijnt met een bericht, opent u de deur van de operatiekamer om de reagensfles eruit te halen en de C2- en O2-connectoren aan te sluiten. Nadat u de deur hebt gesloten, klikt u op de knop OK in het pop-upvenster om de druppels automatisch te cultiveren en de OD-waarden te detecteren.Wanneer de groeicurve de stationaire fase bereikt, klikt u op de knop Gegevensexport om de OD-gegevens te exporteren. Selecteer het gegevensopslagpad en exporteer de OD-waarde die tijdens de teeltperiode is geregistreerd in de CVS-indeling Om de groeicurve te plotten, gebruikt u kaartsoftware zoals Excel en Origin 9.0. Injecteer de vereiste volumes van de initiële bacterieoplossing, het verse medium en MMC-olie in de afzonderlijke gesteriliseerde reagensflessen voor de initiële bacterieoplossing in het verse medium, zoals eerder uitgelegd.Om de functie van adaptieve evolutie te kiezen, klikt u op ALE in de software. Schakel in de interface voor parameterinstellingen de OD-detectieschakelaar in, stel vervolgens alle parameters in die in het manuscript worden beschreven en klik op het tabblad Start om het genereren van druppels te starten. Het proces duurt ongeveer 25 minuten.Observeer tijdens elke subkweekperiode of de maximale OD-waarden van de druppels aanzienlijk zijn toegenomen. Als de toename optreedt en voldoet aan de experimentvereisten, klikt u op de knop Gegevensexport om de OD-gegevens te exporteren. Om de doeldruppels uit de MMC te extraheren, klikt u op het screeningstabblad om de functie van druppelextractie te selecteren.Kies vervolgens de optie Verzamelen en klik op het aantal doeldruppels. Als u klaar bent, klikt u op OK. Wacht op het pop-upvenster waarin een bericht wordt gevraagd. Plaats vervolgens de CF-snelkoppeling in de microcentrifugebuis voor verzameling en klik op OK. Na één tot twee minuten wanneer de software-interface een nieuw venster opent met een bericht, plaatst u de CF-snelkoppeling terug en klikt u op OK om MMC te laten doorgaan met werken.Wanneer de volgende doeldruppel de druppelherkenningsplaats bereikt, verzamelt u deze zoals eerder opgegeven. Gebruik een pipet van 2,5 microliter om de druppel eruit te halen en op een massieve plaat van 90 millimeter te plaatsen, gevolgd door de druppel gelijkmatig te verdelen met een glazen driehoekige gecoate staaf met een zijlengte van drie centimeter, en cultiveer de druppel vervolgens gedurende 72 uur in een incubator met constante temperatuur van 37 graden Celsius. Kies later drie tot vijf onafhankelijke kolonies bacteriën om elke kolonie afzonderlijk te kweken in een schudkolf van 50 milliliter met 10 milliliter vers medium in een schudincubator met 200 rotaties per minuut en 37 graden Celsius gedurende 48 tot 72 uur.Volg na de incubatie de bijbehorende standaardvoorschriften om de gekweekte bacterie-oplossing in de glycerolbuis op te slaan. De representatieve analyse toont de groeicurves van 50 druppels in het hele adaptieve evolutieproces. Er werd waargenomen dat de methanol essentiële Escherichia coli stam of MeSV2.2 initiële langzame groei vertoonde, gevolgd door snelle groei.De groeicurve van druppel zes in het hele adaptieve evolutieproces werd afzonderlijk uitgezet. De maximale OD600-waarde in de eerste generatie was 0,37, wat steeg tot 0,58 in de laatste subkweekperiode, wat aangeeft dat de stam in de druppel zes een duidelijke adaptieve evolutie heeft gerealiseerd. Verder werden de groeicurves van de druppel zes stam en de initiële stam vergeleken.De druppel zes stam vertoonde een hogere maximale specifieke groeisnelheid en celconcentratie in de stationaire fase dan de initiële stam. Het belangrijkste is om ervoor te zorgen dat de verbinding van de instrumentchip en de reagensfles correct is, dat zijn de druppels voor bewerkingen om normaal te verlopen. Deze methode biedt onderzoekers een nieuw idee voor het kweken van micro-organismen en biedt ook een efficiënt en goedkoop platform voor de adaptieve evolutie van stammen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC)

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Teelt van zoogdiercellen met behulp van een Single-use Pneumatische bioreactorsysteem

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studies van longkanker-cellen met behulp van een Multichannel Dual-elektrisch veld Microfluïdische Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A Novel Bioreactor voor High Density Teelt van Diverse microbiële gemeenschappen

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Ontwerp en implementatie van een Automated Verlichten, kweken, en Sampling System voor Microbiële optogenetische Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Montage en Tracking van Microbiële Community Development binnen een Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Prospectie van microbiële stammen voor bioremediatie en probiotica ontwikkeling voor Metaorganisme onderzoek en conservering

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Proces optimalisatie met behulp van high throughput geautomatiseerde micro-bioreactoren in de Chinese Hamster Eierstok celteelt

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Het genereren van gecontroleerde, dynamische chemische landschappen om microbieel gedrag te bestuderen

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identificatie van resistentie tegen Pseudomonas syringae pv. Tomaat in Tomaat met seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...