Name: automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)
Uploaded: 2022-02-18T12:30:00
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Cette étude a été soutenue par le National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), le National Key Scientific Instrument and Equipment Project de la National Natural Science Foundation of China (21627812) et le Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). Nous remercions également le professeur Julia A. Vorholt (Institut de microbiologie, Département de biologie, ETH Zurich, Zurich 8093, Suisse) pour la fourniture de la souche d’E. coli essentielle au méthanol version 2.2 (MeSV2.2).

1. Installation de l’instrument et du logiciel
<ol><li>Choisissez un environnement propre et stérile (comme un banc propre) comme espace permanent dédié à MMC. Installez la console MMC régulièrement dans l’espace. REMARQUE: Gardez la MMC à l’écart des interférences des champs électriques forts, des champs magnétiques et des sources de rayonnement thermique fortes. Évitez les vibrations sévères qui affectent les composants de détection optique. Fournissez l’alimentation de AC22...

<ol>
	<li>Lewis, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms.">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li><li>Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. 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S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+adaptation+in+microdroplet+chemostats.">Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).</li><li>Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+droplet-based+microfluidic+platform+for+multiplexed+analysis+of+biochemical+markers+in+small+volumes.">Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes.</a> Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).</li><li>Watterson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+high-throughput+cultivation+for+accurate+screening+of+antibiotic+resistant+gut+microbes.">Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes.</a> eLife. 9, 56998 (2020).</li><li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactants+in+droplet-based+microfluidics.">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li><li>Nitschke, M., Pastore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+properties+of+a+surfactant+obtained+from+Bacillus+subtilis+grown+on+cassava+wastewater.">Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater.</a> Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).</li><li>Jiang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+biofuels+and+biochemicals+production+from+sustainable+resources+using+co-cultivation+systems.">Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems.</a> Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).</li></ol>

Ce protocole montre comment utiliser le système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC) pour effectuer une culture microbienne automatisée et une évolution adaptative à long terme. MMC est un système de culture microbienne miniaturisé, automatisé et à haut débit. Par rapport aux méthodes et instruments de culture microbiens à haut débit conventionnels, la MMC présente de nombreux avantages tels qu’une faible consommation de main-d’œuvre et de réactifs, un fonctionnement simple, une détectio...

La culture microbienne est une base importante pour la recherche scientifique microbiologique et les applications industrielles, qui est largement utilisée dans l’isolement, l’identification, la reconstruction, le criblage et l’évolution des micro-organismes 1,2,3. Les méthodes de culture microbienne conventionnelles utilisent principalement des tubes à essai, des flacons à agiter et des plaques solides comme récipients de culture, combinés à des incubateurs à secouer, des spectrophotomètres, des lecteurs de microplaques et d’autres équipements pour la culture, la détection et le dépistage microbiens. Cependant, ces méthodes présentent de nombreux problèmes, tels que des opérations fastidieuses, un faible débit, une faible efficacité et une grande consommation de main-d’œuvre et de réactifs. Les méthodes de culture à haut débit développées ces dernières années sont principalement basées sur la microplaque. Mais la microplaque a un faible niveau d’oxygène dissous, une mauvaise propriété de mélange et une évaporation et un effet thermique sévères, ce qui conduit souvent à un mauvais état de croissance et à une parallélisation expérimentale des micro-organismes 4,5,6,7; d’autre part, il doit être équipé d’équipements coûteux, tels que des postes de travail de manipulation de liquides et des lecteurs de microplaques, pour réaliser une culture automatisée et une détection de processus 8,9.
En tant que branche importante de la technologie microfluidique, la microfluidique des gouttelettes a été développée ces dernières années sur la base de systèmes microfluidiques traditionnels à flux continu. Il s’agit d’une technologie microfluidique à écoulement discret qui utilise deux phases liquides non miscibles (généralement huile-eau) pour générer des micro-gouttelettes dispersées et opérer sur elles10. Étant donné que les micro-gouttelettes présentent les caractéristiques d’un petit volume, d’une grande surface spécifique, d’un taux de transfert de masse interne élevé et d’aucune contamination croisée causée par la compartimentation, ainsi que les avantages d’une forte contrôlabilité et d’un débit élevé de gouttelettes, il existe de nombreux types de recherche appliquant la technologie microfluidique des gouttelettes dans la culture, le criblage et l’évolution à haut débit des micro-organismes11 . Cependant, il reste encore une série de questions clés pour rendre la technologie microfluidique des gouttelettes popularisée et largement appliquée. Tout d’abord, le fonctionnement de la microfluidique des gouttelettes est lourd et complexe, ce qui entraîne des exigences techniques élevées pour les opérateurs. Deuxièmement, la technologie microfluidique des gouttelettes combine des composants optiques, mécaniques et électriques et doit être associée à des scénarios d’application de la biotechnologie. Il est difficile pour un seul laboratoire ou une seule équipe de construire des systèmes efficaces de contrôle microfluidique des gouttelettes s’il n’y a pas de collaboration multidisciplinaire. Troisièmement, en raison du faible volume de micro-gouttelettes (du picoliter (pL) au microlitre (μL)), il faut beaucoup de difficulté pour réaliser le contrôle automatisé précis et la détection en ligne en temps réel des gouttelettes pour certaines opérations microbiennes de base telles que la sous-culture, le tri et l’échantillonnage, et il est également difficile de construire un système d’équipement intégré12.
Afin de résoudre les problèmes ci-dessus, un système automatique de culture microbienne de microgouttelettes (MMC) a été développé avec succès sur la base de la technologie microfluidique des gouttelettes13. La MMC se compose de quatre modules fonctionnels : un module de reconnaissance de gouttelettes, un module de détection de spectre de gouttelettes, un module de puce microfluidique et un module d’échantillonnage. Grâce à l’intégration du système et au contrôle de tous les modules, le système d’exploitation automatisé comprenant la génération, la culture, la mesure (densité optique (OD) et fluorescence), le fractionnement, la fusion, le tri des gouttelettes est établi avec précision, réalisant l’intégration de fonctions telles que l’inoculation, la culture, la surveillance, la sous-culture, le tri et l’échantillonnage requis par le processus de culture de gouttelettes microbiennes. MMC peut contenir jusqu’à 200 unités de culture de gouttelettes répliquées de 2 à 3 μL de volume, ce qui équivaut à 200 unités de culture de flacons agités. Le système de culture de micro-gouttelettes peut satisfaire aux exigences de non-contamination, d’oxygène dissous, de mélange et d’échange masse-énergie pendant la croissance des micro-organismes, et répondre aux divers besoins de la recherche microbienne grâce à de multiples fonctions intégrées, par exemple, la mesure de la courbe de croissance, l’évolution adaptative, l’analyse multi-niveaux à facteur unique et la recherche et l’analyse des métabolites (basées sur la détection de fluorescence)13,14.
Ici, le protocole présente en détail comment utiliser la MMC pour effectuer une culture automatisée et microbienne et une évolution adaptative (Figure 1). Nous avons pris comme exemple Escherichia coli (E. coli) MG1655 de type sauvage pour démontrer la mesure de la courbe de croissance et une souche d’E. coli essentielle au méthanol MeSV2.215 pour démontrer l’évolution adaptative de la MMC. Un logiciel d’exploitation pour MMC a été développé, ce qui rend l’opération très simple et claire. Dans l’ensemble du processus, l’utilisateur doit préparer la solution bactérienne initiale, définir les conditions de la MMC, puis injecter la solution bactérienne et les réactifs connexes dans la MMC. Par la suite, la MMC effectuera automatiquement des opérations telles que la génération de gouttelettes, la reconnaissance et la numérotation, la culture et l’évolution adaptative. Il effectuera également la détection en ligne (OD et fluorescence) des gouttelettes avec une résolution temporelle élevée et affichera les données associées (qui peuvent être exportées) dans le logiciel. L’opérateur peut arrêter le processus de culture à tout moment en fonction des résultats et extraire les gouttelettes cibles pour des expériences ultérieures. Le MMC est facile à utiliser, consomme moins de main-d’œuvre et de réactifs, et a un débit expérimental relativement élevé et une bonne parallélisation des données, ce qui présente des avantages significatifs par rapport aux méthodes de culture conventionnelles. Il fournit une plate-forme expérimentale peu coûteuse, conviviale et robuste permettant aux chercheurs de mener des recherches microbiennes connexes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m PVDF filter membrane</td>
			<td>Merck Millipore Ltd.</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Sterilize the MMC oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-289BSW</td>
			<td>For reagent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>For solid plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20011160</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.</td>
			<td>DL-CJ-INDII</td>
			<td>For aseptic operation and UV sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10007216</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>E450</td>
			<td>Software installation and MMC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Shanghai qixin scientific instrument co., LTD</td>
			<td>LRH 250</td>
			<td>For the microbial cultivation using solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>AR 3130</td>
			<td>For reagent weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>For droplet collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10011928</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>2.0 mL</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2054</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G66258A</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Pressure Steam Sterilization Pot</td>
			<td>SANYO Electric</td>
			<td>MLS3020</td>
			<td>For autoclaved sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>420322</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>P815661</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>M813895</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>BIOBYING</td>
			<td>1305715</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial Microdroplet Culture System (MMC)</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;MMC-I</td>
			<td>Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&#38;id=110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-ALE-OD</td>
			<td>For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC oil</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-M/S-OD</td>
			<td>The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20026118</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G81793J</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G10267B</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10001518</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>90 mm</td>
			<td>For the preparation of solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>2.5 &#956;L, 10 &#956;L, 100&#956;L, 1000&#956;L</td>
			<td>For liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick connector A</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent bottle</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-PCB</td>
			<td>Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flask</td>
			<td>Union-Biotech</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>For microbial cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.</td>
			<td>SKY-210 2B</td>
			<td>For the microbial cultivation in shake flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8290</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>Draw liquid and inject it into the reagent bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>OUBEL Hardware Store</td>
			<td>22G</td>
			<td>Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature refrigerator</td>
			<td>SANYO Ultra-low</td>
			<td>MDF-U4086S</td>
			<td>For strain preservation (-80 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV&#8211;Vis spectrophotometer</td>
			<td>General Electric Company</td>
			<td>Ultrospec 3100 pro</td>
			<td>For the measurement of OD values</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SV8080</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)

Les méthodes de culture microbienne conventionnelles ont généralement des opérations lourdes, un faible débit, une faible efficacité et une grande consommation de main-d’œuvre et de réactifs. De plus, les méthodes de culture à haut débit à base de microplaques développées ces dernières années ont un faible statut de croissance microbienne et une parallélisation expérimentale en raison de leur faible teneur en oxygène dissous, de leur mauvais mélange et de leur effet d’évaporation et thermique sévères. En raison de nombreux avantages des micro-gouttelettes, tels qu’un petit volume, un débit élevé et une forte contrôlabilité, la technologie microfluidique à base de gouttelettes peut surmonter ces problèmes, qui a été utilisée dans de nombreux types de recherche sur la culture, le criblage et l’évolution microbiens à haut débit. Cependant, la plupart des études antérieures restent au stade de la construction et de l’application du laboratoire. Certains problèmes clés, tels que les exigences opérationnelles élevées, la difficulté de construction élevée et l’absence de technologie d’intégration automatisée, limitent l’application généralisée de la technologie microfluidique des gouttelettes dans la recherche microbienne. Ici, un système automatisé de culture microbienne de microgouttelettes (MMC) a été développé avec succès sur la base de la technologie microfluidique des gouttelettes, permettant l’intégration de fonctions telles que l’inoculation, la culture, la surveillance en ligne, la sous-culture, le tri et l’échantillonnage requis par le processus de culture de gouttelettes microbiennes. Dans ce protocole, Escherichia coli (E. coli) MG1655 de type sauvage et une souche d’E. coli essentielle au méthanol (MeSV2.2) ont été prises comme exemples pour présenter comment utiliser le MMC pour effectuer une culture microbienne automatisée et à débit relativement élevé et une évolution adaptative en détail. Cette méthode est facile à utiliser, consomme moins de main-d’œuvre et de réactifs, et a un débit expérimental élevé et une bonne parallélisation des données, ce qui présente de grands avantages par rapport aux méthodes de culture conventionnelles. Il fournit une plate-forme expérimentale peu coûteuse, conviviale et fiable en termes de résultats pour permettre aux chercheurs scientifiques de mener des recherches microbiennes connexes.

Ce protocole utilise E. coli MG1655 et une souche MeSV2.2 comme exemples pour démontrer la culture microbienne et l’évolution adaptative essentielle au méthanol avec une stratégie automatisée et à débit relativement élevé dans la MMC. La mesure de la courbe de croissance a été principalement utilisée pour caractériser la culture microbienne. L’évolution adaptative a été réalisée par la sous-culture continue automatisée et l’ajout d’une forte concentration de méthanol comme pression s?...

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Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC

Ce protocole décrit comment utiliser le système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC) pour effectuer une culture microbienne automatisée et une évolution adaptative. MMC peut cultiver et sous-cultiver des micro-organismes automatiquement et en continu et surveiller en ligne leur croissance avec un débit relativement élevé et une bonne parallélisation, réduisant ainsi la consommation de main-d’œuvre et de réactifs.

Culture microbienne automatisée et évolution adaptative à l’aide d’un système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC)

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and ...

Cette méthode peut aider à résoudre les problèmes avec les méthodes de culture microbienne conventionnelles. Il fournit une plate-forme expérimentale peu coûteuse, conviviale et fiable en termes de résultats pour la culture microbienne automatisée et l’évolution adaptative. Cette technologie automatise les opérations et réduit davantage la consommation de main-d’œuvre.Et en même temps, il a de bonnes performances culturelles avec des résultats fiables et des opérations simples. La technologie est principalement utilisée dans les domaines de recherche en microbiologie, tels que la mesure de la courbe de croissance, l’évolution adaptative en laboratoire et une analyse multiniveau à facteur unique. Commencez les préparatifs de l’expérience en connectant l’aiguille de la seringue d’un diamètre intérieur de 0,41 millimètre et d’un diamètre extérieur de 0,71 millimètre à un connecteur rapide A et à un flacon de réactif.Ensuite, autoclavez tout l’équipement à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pour installer la puce microfluidique, ouvrez la porte de la chambre de commande et soulevez la sonde à fibre optique. Après avoir aligné les trous de champ électrique avec les aiguilles, placez doucement la puce sur le piédestal de la puce, puis insérez les deux colonnes de positionnement dans les trous de positionnement et posez la sonde à fibre optique.Ensuite, connectez le connecteur rapide A de la puce au port correspondant du système de culture de microgouttelettes microbiennes ou MMC en fonction du numéro de position décrit dans le manuscrit. Lorsque vous avez terminé, fermez la porte de la chambre d’opération. Diluer la suspension cultivée d’Escherichia coli MG1655 avec le milieu à une OD600 de 0,05 à 0,1 pour obtenir 10 millilitres de solution bactérienne initiale.Pour initialiser la console MMC, cliquez sur l’onglet Initialisation. Lorsque l’interface d’initialisation apparaît, réglez la température de culture sur 37 degrés Celsius et la valeur du signal photoélectrique sur 0,6. L’initialisation prendra environ 20 minutes.Plus tard, placez un flacon de réactif stérilisé sur le banc propre et serrez le bouchon. Utilisez une seringue stérile de 10 millilitres pour injecter trois à cinq millilitres d’huile MMC de l’aiguille de la seringue au tube latéral dans le flacon de réactif. Ensuite, inclinez et faites pivoter lentement le flacon de réactif pour que l’huile s’infiltre complètement dans la paroi interne.Après avoir injecté cinq millilitres d’une solution bactérienne initiale dans le flacon, remplissez le flacon de réactif en injectant cinq à sept millilitres d’huile MMC. Retirez le connecteur rapide indépendant A du flacon de réactif et insérez le connecteur rapide A dans le connecteur rapide B du flacon pour terminer l’opération d’injection de l’échantillon. Une fois cela fait, ouvrez la porte de la chambre d’opération pour mettre le flacon de réactif dans le bain métallique.Retirez le connecteur C2 de la puce et le connecteur rapide A de la bouteille de réactif. Connectez le connecteur de tube latéral de la bouteille de réactif au connecteur C2 et le connecteur de tube supérieur au connecteur O2. Fermez ensuite la porte de la chambre d’opération.Pour choisir la fonction de mesure de la courbe de croissance, cliquez sur Courbe de croissance dans l’interface de paramétrage, entrez le nombre 15. Allumez ensuite le commutateur de détection OD et réglez la longueur d’onde sur 600 nanomètres. Cliquez sur l’onglet Démarrer pour lancer la génération de gouttelettes.Le processus prendra 15 minutes. Lorsqu’une fenêtre contextuelle apparaît sur l’interface principale pour demander un message, ouvrez la porte de la chambre de commande pour retirer le flacon de réactif et connecter les connecteurs C2 et O2. Après avoir fermé la porte, cliquez sur le bouton OK dans la fenêtre contextuelle pour cultiver automatiquement les gouttelettes et détecter les valeurs OD.Lorsque la courbe de croissance atteint la phase stationnaire, cliquez sur le bouton Exportation de données pour exporter les données OD. Sélectionnez le chemin d’enregistrement des données et exportez la valeur OD enregistrée pendant la période de culture au format CVS Pour tracer la courbe de croissance, utilisez des logiciels de cartographie tels qu’Excel et Origin 9.0. Injecter les volumes requis de la solution bactérienne initiale, du milieu frais et de l’huile MMC dans les flacons de réactif stérilisés séparés pour la solution bactérienne initiale dans le milieu frais, comme expliqué précédemment.Pour choisir la fonction d’évolution adaptative, cliquez sur ALE dans le logiciel. Dans l’interface de paramétrage, activez le commutateur de détection OD, puis définissez tous les paramètres décrits dans le manuscrit et appuyez sur l’onglet Démarrer pour lancer la génération de gouttelettes. Le processus prendra environ 25 minutes.Au cours de chaque période de sous-culture, observez si les valeurs maximales de DO des gouttelettes ont augmenté de manière significative. Si l’augmentation se produit et répond aux exigences de l’expérience, cliquez sur le bouton d’exportation des données pour exporter les données OD. Pour extraire les gouttelettes cibles de la console MMC, cliquez sur l’onglet de criblage pour sélectionner la fonction d’extraction des gouttelettes.Choisissez ensuite l’option Collecter et cliquez sur le nombre de gouttelettes cibles. Lorsque vous avez terminé, cliquez sur OK. Attendez que la fenêtre contextuelle vous invite à envoyer un message. Ensuite, placez le connecteur rapide CF dans le tube de microcentrifugation pour la collecte et cliquez sur OK. Après une à deux minutes, lorsque l’interface du logiciel affiche une nouvelle fenêtre invitant un message, insérez le connecteur rapide CF et cliquez sur OK pour que MMC continue à fonctionner.Lorsque la gouttelette cible suivante atteint le site de reconnaissance des gouttelettes, collectez-la comme spécifié précédemment. Utilisez une pipette de 2,5 microlitres pour retirer et placer la gouttelette sur une plaque solide de 90 millimètres, suivie d’étaler la goutte uniformément avec une tige recouverte de verre triangulaire d’une longueur latérale de trois centimètres, puis cultivez la goutte dans un incubateur à température constante de 37 degrés Celsius pendant 72 heures. Plus tard, choisissez trois à cinq colonies indépendantes de bactéries pour cultiver chaque colonie séparément dans une fiole agitée de 50 millilitres avec 10 millilitres de milieu frais dans un incubateur à agitation à 200 rotations par minute et 37 degrés Celsius pendant 48 à 72 heures.Après l’incubation, suivez les réglementations standard connexes pour stocker la solution de bactéries cultivées dans le tube de glycérol. L’analyse représentative montre les courbes de croissance de 50 gouttelettes dans l’ensemble du processus d’évolution adaptative. Il a été observé que la souche essentielle d’Escherichia coli au méthanol ou MeSV2.2 présentait une croissance initiale lente suivie d’une croissance rapide.La courbe de croissance de la gouttelette six dans l’ensemble du processus d’évolution adaptative a été tracée séparément. La valeur maximale de l’OD600 dans la première génération était de 0,37, qui est passée à 0,58 au cours de la dernière période de sous-culture, ce qui indique que la souche dans la gouttelette six a réalisé une évolution adaptative évidente. De plus, les courbes de croissance de la souche de gouttelette six et de la souche initiale ont été comparées.La souche de gouttelette six présentait un taux de croissance spécifique maximal et une concentration cellulaire plus élevés dans la phase stationnaire que la souche initiale. Le plus important est de s’assurer que la connexion de la puce de l’instrument et de la bouteille de réactif est correcte, c’est-à-dire les gouttelettes pour que les opérations se déroulent normalement. Cette méthode fournit aux chercheurs une nouvelle idée pour la culture de micro-organismes et fournit également une plate-forme efficace et peu coûteuse pour l’évolution adaptative des souches.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC)

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

Microfluidique picolitres bioréacteur pour Analyse microbienne unicellulaire: Fabrication, configuration du système, et l&#39;opération

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Recherche

Bio-ingénierie

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

La culture de cellules de mammifères en utilisant un système pneumatique bioréacteur à usage unique

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Électrotaxie l&#39;étude des cellules du cancer du poumon à l&#39;aide d&#39;un double-Multichannel champ électrique microfluidique Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

Un bioréacteur pour Novel Haute Culture de la densité des communautés microbiennes diverses

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Conception et mise en œuvre d&#39;un Illuminating automatisé, la culture, et du système d&#39;échantillonnage pour Microbial optogénétiques Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Montage et suivi du développement de la communauté microbienne dans une plateforme de microwell Array

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Prospection de souches microbiennes pour le développement de bioremédiation et de probiotiques pour la recherche et la préservation des méta-organismes

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Optimisation des processus à l’aide de micro-bioréacteurs automatisés à haut débit dans la culture chinoise de cellules d’ovaires de Hamster

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Générer des paysages chimiques contrôlés et dynamiques pour étudier le comportement microbien

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Identification à haut débit de la résistance aux seringues Pseudomonas pv. Tomate dans la tomate à l’aide de semis Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...