Name: automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)
Uploaded: 2022-02-18T12:30:00
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Diese Studie wurde vom National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), dem National Key Scientific Instrument and Equipment Project der National Natural Science Foundation of China (21627812) und dem Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108) unterstützt. Wir danken auch Prof. Julia A. Vorholt (Institut für Mikrobiologie, Departement Biologie, ETH Zürich, Zürich 8093, Schweiz) für die Bereitstellung des methanolessentiellen E. coli-Stammes Version 2.2 (MeSV2.2).

1. Geräte- und Softwareinstallation
<ol><li>Wählen Sie eine saubere und sterile Umgebung (z. B. eine saubere Bank) als dedizierten permanenten Raum für MMC. Installieren Sie die MMC stetig im Raum. HINWEIS: Halten Sie die MMC von der Interferenz starker elektrischer Felder, Magnetfelder und starker Wärmestrahlungsquellen fern. Vermeiden Sie starke Vibrationen, die die optischen Detektionskomponenten beeinträchtigen. Stellen Sie die Stromversorgung von AC220 V, 50 HZ für die MMC bereit. Weitere...

<ol>
	<li>Lewis, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms.">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li><li>Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+high-throughput+cultivation+for+accurate+screening+of+antibiotic+resistant+gut+microbes.">Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes.</a> eLife. 9, 56998 (2020).</li><li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactants+in+droplet-based+microfluidics.">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li><li>Nitschke, M., Pastore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+properties+of+a+surfactant+obtained+from+Bacillus+subtilis+grown+on+cassava+wastewater.">Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater.</a> Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).</li><li>Jiang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+biofuels+and+biochemicals+production+from+sustainable+resources+using+co-cultivation+systems.">Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems.</a> Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).</li></ol>

Dieses Protokoll zeigt, wie das mikrobielle Tröpfchenkultursystem (MMC) verwendet werden kann, um eine automatisierte mikrobielle Kultivierung und langfristige adaptive Evolution durchzuführen. MMC ist ein miniaturisiertes, automatisiertes und mikrobielles Hochdurchsatz-Kultivierungssystem. Im Vergleich zu herkömmlichen mikrobiellen Hochdurchsatz-Kultivierungsmethoden und -instrumenten bietet MMC viele Vorteile wie geringen Arbeits- und Reagenzverbrauch, einfache Bedienung, Online-Detektion (OD und Fluoreszenz), hochz...

Die mikrobielle Kultivierung ist eine wichtige Grundlage für die mikrobiologische wissenschaftliche Forschung und industrielle Anwendungen, die bei der Isolierung, Identifizierung, Rekonstruktion, dem Screening und der Evolution von Mikroorganismen weit verbreitet ist 1,2,3. Herkömmliche mikrobielle Kultivierungsmethoden verwenden hauptsächlich Reagenzgläser, Schüttelkolben und feste Platten als Kultivierungsbehälter, kombiniert mit Schüttelinkubatoren, Spektralphotometern, Mikroplattenlesern und anderen Geräten für die mikrobielle Kultivierung, Detektion und das Screening. Diese Methoden haben jedoch viele Probleme, wie umständliche Operationen, geringen Durchsatz, geringe Effizienz und großen Verbrauch von Arbeit und Reagenzien. Die in den letzten Jahren entwickelten Hochdurchsatz-Anbaumethoden basieren hauptsächlich auf der Mikrotiterplatte. Aber die Mikrotiterplatte hat einen geringen Gehalt an gelöstem Sauerstoff, eine schlechte Mischeigenschaft und eine starke Verdampfung und thermische Wirkung, die oft zu einem schlechten Wachstumsstatus und einer Experimentparallelisierung von Mikroorganismen führen 4,5,6,7; Auf der anderen Seite muss es mit teuren Geräten wie Liquid-Handling-Arbeitsplätzen und Mikroplattenlesern ausgestattet werden, um eine automatisierte Kultivierung und Prozesserkennung zu erreichen 8,9.
Als wichtiger Zweig der mikrofluidischen Technologie wurde die Tröpfchenmikrofluidik in den letzten Jahren auf der Grundlage traditioneller mikrofluidischer Systeme mit kontinuierlicher Strömung entwickelt. Es ist eine diskrete mikrofluidische Technologie, die zwei nicht mischbare flüssige Phasen (normalerweise Öl-Wasser) verwendet, um dispergierte Mikrotröpfchen zu erzeugen und an ihnenzu arbeiten 10. Da Mikrotröpfchen die Eigenschaften eines kleinen Volumens, einer großen spezifischen Oberfläche, einer hohen internen Stoffaustauschrate und keiner Kreuzkontamination durch Kompartimentierung sowie die Vorteile einer starken Kontrollierbarkeit und eines hohen Durchsatzes von Tröpfchen aufweisen, gab es viele Arten von Forschungen, die die Tröpfchenmikrofluidik-Technologie in der Hochdurchsatzkultivierung, dem Screening und der Evolution von Mikroorganismen anwenden11 . Es gibt jedoch immer noch eine Reihe von Schlüsselfragen, um die mikrofluidische Tröpfchentechnologie populär und weit verbreitet zu machen. Erstens ist die Bedienung der Tröpfchenmikrofluidik umständlich und kompliziert, was zu hohen technischen Anforderungen an die Bediener führt. Zweitens kombiniert die Tröpfchenmikrofluidik-Technologie optische, mechanische und elektrische Komponenten und muss mit biotechnologischen Anwendungsszenarien in Verbindung gebracht werden. Es ist schwierig für ein einzelnes Labor oder Team, effiziente mikrofluidische Tröpfchenkontrollsysteme zu bauen, wenn es keine multidisziplinäre Zusammenarbeit gibt. Drittens ist es aufgrund des geringen Volumens an Mikrotröpfchen (von Picolitor (pL) bis Mikroliter (μL)) sehr schwierig, die präzise automatisierte Steuerung und Echtzeit-Online-Erkennung von Tröpfchen für einige grundlegende mikrobielle Operationen wie Subkultivierung, Sortierung und Probenahme zu realisieren, und es ist auch schwierig, ein integriertes Ausrüstungssystemzu konstruieren 12.
Um die oben genannten Probleme anzugehen, wurde erfolgreich ein automatisches mikrobielles Tröpfchenkultursystem (MMC) entwickelt, das auf der Tröpfchenmikrofluidik-Technologie13 basiert. Das MMC besteht aus vier Funktionsmodulen: einem Tröpfchenerkennungsmodul, einem Tröpfchenspektrum-Detektionsmodul, einem mikrofluidischen Chipmodul und einem Probenahmemodul. Durch die Systemintegration und Steuerung aller Module wird ein automatisiertes Betriebssystem einschließlich der Erzeugung, Kultivierung, Messung (optische Dichte (OD) und Fluoreszenz), Spaltung, Fusion und Sortierung von Tröpfchen genau etabliert, wodurch die Integration von Funktionen wie Impfung, Kultivierung, Überwachung, Subkultivierung, Sortierung und Probenahme erreicht wird, die für den Prozess der mikrobiellen Tröpfchenkultivierung erforderlich sind. MMC kann bis zu 200 Replikat-Tröpfchen-Kultivierungseinheiten mit einem Volumen von 2-3 μL aufnehmen, was 200 Schüttelkolben-Anbaueinheiten entspricht. Das Mikrotröpfchen-Kultivierungssystem kann die Anforderungen an Nichtkontamination, gelösten Sauerstoff, Vermischung und Massen-Energie-Austausch während des Wachstums von Mikroorganismen erfüllen und die verschiedenen Anforderungen der mikrobiellen Forschung durch mehrere integrierte Funktionen erfüllen, z. B. Wachstumskurvenmessung, adaptive Evolution, Einzelfaktor-Mehrebenenanalyse und Metabolitenforschung und -analyse (basierend auf Fluoreszenzdetektion)13,14.
Hier stellt das Protokoll vor, wie die MMC verwendet werden kann, um automatisierte und mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution im Detail durchzuführen (Abbildung 1). Wir nahmen den Wildtyp-Escherichia coli (E. coli) MG1655 als Beispiel, um die Messung der Wachstumskurve zu demonstrieren, und einen methanolessentiellen E. coli-Stamm MeSV2.215, um die adaptive Entwicklung in MMC zu demonstrieren. Für MMC wurde eine Bediensoftware entwickelt, die die Bedienung sehr einfach und übersichtlich macht. Während des gesamten Prozesses muss der Benutzer die anfängliche Bakterienlösung vorbereiten, die Bedingungen der MMC festlegen und dann die Bakterienlösung und die zugehörigen Reagenzien in die MMC injizieren. Anschließend führt die MMC automatisch Operationen wie Tröpfchengenerierung, Erkennung und Nummerierung, Kultivierung und adaptive Evolution durch. Es wird auch eine Online-Detektion (OD und Fluoreszenz) der Tröpfchen mit hoher Zeitauflösung durchführen und die zugehörigen Daten (die exportiert werden können) in der Software anzeigen. Der Bediener kann den Kultivierungsprozess je nach den Ergebnissen jederzeit stoppen und die Zieltröpfchen für nachfolgende Experimente extrahieren. Die MMC ist einfach zu bedienen, verbraucht weniger Arbeit und Reagenzien und verfügt über einen relativ hohen experimentellen Durchsatz und eine gute Datenparallelität, was im Vergleich zu herkömmlichen Anbaumethoden erhebliche Vorteile hat. Es bietet eine kostengünstige, betriebsfreundliche und robuste experimentelle Plattform für Forscher, um verwandte mikrobielle Forschung durchzuführen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m PVDF filter membrane</td>
			<td>Merck Millipore Ltd.</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Sterilize the MMC oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-289BSW</td>
			<td>For reagent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>For solid plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20011160</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.</td>
			<td>DL-CJ-INDII</td>
			<td>For aseptic operation and UV sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10007216</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>E450</td>
			<td>Software installation and MMC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Shanghai qixin scientific instrument co., LTD</td>
			<td>LRH 250</td>
			<td>For the microbial cultivation using solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>AR 3130</td>
			<td>For reagent weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>For droplet collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10011928</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>2.0 mL</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2054</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G66258A</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Pressure Steam Sterilization Pot</td>
			<td>SANYO Electric</td>
			<td>MLS3020</td>
			<td>For autoclaved sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>420322</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>P815661</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>M813895</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>BIOBYING</td>
			<td>1305715</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial Microdroplet Culture System (MMC)</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;MMC-I</td>
			<td>Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&#38;id=110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-ALE-OD</td>
			<td>For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC oil</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-M/S-OD</td>
			<td>The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20026118</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G81793J</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G10267B</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10001518</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>90 mm</td>
			<td>For the preparation of solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>2.5 &#956;L, 10 &#956;L, 100&#956;L, 1000&#956;L</td>
			<td>For liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick connector A</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent bottle</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-PCB</td>
			<td>Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flask</td>
			<td>Union-Biotech</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>For microbial cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.</td>
			<td>SKY-210 2B</td>
			<td>For the microbial cultivation in shake flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8290</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>Draw liquid and inject it into the reagent bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>OUBEL Hardware Store</td>
			<td>22G</td>
			<td>Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature refrigerator</td>
			<td>SANYO Ultra-low</td>
			<td>MDF-U4086S</td>
			<td>For strain preservation (-80 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV&#8211;Vis spectrophotometer</td>
			<td>General Electric Company</td>
			<td>Ultrospec 3100 pro</td>
			<td>For the measurement of OD values</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SV8080</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)

Herkömmliche mikrobielle Kultivierungsmethoden haben in der Regel umständliche Operationen, einen geringen Durchsatz, eine geringe Effizienz und einen hohen Verbrauch an Arbeitskräften und Reagenzien. Darüber hinaus haben mikrotiterplattenbasierte Hochdurchsatz-Kultivierungsmethoden, die in den letzten Jahren entwickelt wurden, aufgrund ihres geringen gelösten Sauerstoffs, ihrer schlechten Mischung und ihrer starken Verdunstungs- und Wärmewirkung einen schlechten mikrobiellen Wachstumsstatus und eine schlechte Experimentparallelisierung. Aufgrund vieler Vorteile von Mikrotröpfchen, wie z. B. geringes Volumen, hoher Durchsatz und starke Kontrollierbarkeit, kann die tröpfchenbasierte mikrofluidische Technologie diese Probleme überwinden, die in vielen Arten der Erforschung der mikrobiellen Kultivierung, des Screenings und der Evolution mit hohem Durchsatz eingesetzt wurde. Die meisten früheren Studien befinden sich jedoch noch im Stadium des Laboraufbaus und der Anwendung. Einige Schlüsselthemen, wie hohe betriebliche Anforderungen, hohe Bauschwierigkeiten und das Fehlen automatisierter Integrationstechnologie, schränken die breite Anwendung der Tröpfchenmikrofluidik-Technologie in der mikrobiellen Forschung ein. Hier wurde erfolgreich ein automatisiertes mikrobielles Mikrotropfenkultursystem (MMC) entwickelt, das auf der Tröpfchenmikrofluidik-Technologie basiert und die Integration von Funktionen wie Impfung, Kultivierung, Online-Überwachung, Subkultivierung, Sortierung und Probenahme erreicht, die für den Prozess der mikrobiellen Tröpfchenkultivierung erforderlich sind. In diesem Protokoll wurden Wildtyp-Escherichia coli (E. coli) MG1655 und ein Methanol-essentieller E. coli-Stamm (MeSV2.2) als Beispiele genommen, um vorzustellen, wie die MMC verwendet werden kann, um automatisierte und relativ durchsatzfähige mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution im Detail durchzuführen. Diese Methode ist einfach zu bedienen, verbraucht weniger Arbeit und Reagenzien und hat einen hohen experimentellen Durchsatz und eine gute Datenparallelität, was im Vergleich zu herkömmlichen Anbaumethoden große Vorteile hat. Es bietet eine kostengünstige, betriebsfreundliche und ergebnissichere experimentelle Plattform für wissenschaftliche Forscher, um verwandte mikrobielle Forschung durchzuführen.

Dieses Protokoll verwendet E. coli MG1655 und einen MeSV2.2-Stamm als Beispiele, um die mikrobielle Kultivierung und die methanolessentielle adaptive Evolution mit einer automatisierten und relativ hohen Durchsatzstrategie in MMC zu demonstrieren. Die Messung der Wachstumskurve wurde hauptsächlich zur Charakterisierung der mikrobiellen Kultivierung verwendet. Die adaptive Evolution wurde durch automatisierte kontinuierliche Subkultivierung und Zugabe einer hohen Konzentration von Methanol als Selektionsdruck w?...

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Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC

Dieses Protokoll beschreibt, wie das mikrobielle Mikrotröpfchenkultursystem (MMC) verwendet wird, um eine automatisierte mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution durchzuführen. MMC kann Mikroorganismen automatisch und kontinuierlich kultivieren und subkultivieren und ihr Wachstum online mit relativ hohem Durchsatz und guter Parallelisierung überwachen, wodurch der Arbeits- und Reagenzienverbrauch reduziert wird.

Automatisierte mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution mit mikrobiellem Mikrotröpfchenkultursystem (MMC)

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and ...

Diese Methode kann helfen, die Probleme mit den herkömmlichen mikrobiellen Kultivierungsmethoden zu lösen. Es bietet eine kostengünstige, betriebsfreundliche und ergebnissichere experimentelle Plattform für die automatisierte mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution. Diese Technologie automatisiert den Betrieb und reduziert den Arbeitsaufwand.Und gleichzeitig hat es eine gute Kulturleistung mit zuverlässigen Ergebnissen und einfachen Operationen. Die Technologie wird hauptsächlich in den mikrobiologischen Forschungsbereichen eingesetzt, wie z.B. der Messung von Wachstumskurven, der adaptiven Laborevolution und einer mehrstufigen Einzelfaktoranalyse. Beginnen Sie die Vorbereitungen des Experiments, indem Sie die Spritzennadel mit einem Innendurchmesser von 0,41 Millimetern und einem Außendurchmesser von 0,71 Millimetern mit einem Schnellverbinder A und einer Reagenzflasche verbinden.Dann autoklavieren Sie alle Geräte bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Um den Mikrofluidik-Chip zu installieren, öffnen Sie die Tür der Operationskammer und heben Sie die Glasfasersonde an. Nachdem Sie die elektrischen Feldlöcher mit den Nadeln ausgerichtet haben, legen Sie den Chip vorsichtig auf den Chipsockel, stecken Sie dann die beiden Positionierungssäulen in die Positionierungslöcher und legen Sie die Glasfasersonde ab.Als nächstes verbinden Sie den Schnellverbinder A auf dem Chip mit dem entsprechenden Port des mikrobiellen Mikrotropfenkultursystems oder MMC gemäß der im Manuskript beschriebenen Positionsnummer. Wenn Sie fertig sind, schließen Sie die Tür der Operationskammer. Verdünnen Sie die kultivierte Escherichia coli MG1655 Suspension mit dem Medium zu einem OD600 von 0,05 bis 0,1, um 10 Milliliter anfängliche Bakterienlösung zu erhalten.Um die MMC zu initialisieren, klicken Sie auf die Registerkarte Initialisierung. Wenn die Initialisierungsschnittstelle angezeigt wird, stellen Sie die Kultivierungstemperatur auf 37 Grad Celsius und den photoelektrischen Signalwert auf 0,6 ein. Die Initialisierung dauert etwa 20 Minuten.Legen Sie später eine sterilisierte Reagenzflasche auf die saubere Bank und ziehen Sie die Kappe fest. Verwenden Sie eine sterile 10-Milliliter-Spritze, um drei bis fünf Milliliter MMC-Öl von der Spritzennadel in den Seitenschlauch in die Reagenzflasche zu injizieren. Kippen und drehen Sie dann die Reagenzflasche langsam, damit das Öl die Innenwand vollständig infiltriert.Nachdem Sie fünf Milliliter einer anfänglichen Bakterienlösung in die Flasche injiziert haben, füllen Sie die Reagenzflasche, indem Sie fünf bis sieben Milliliter des MMC-Öls injizieren. Ziehen Sie den unabhängigen Schnellverbinder A der Reagenzflasche heraus und setzen Sie den Schnellverbinder A in den Schnellverbinder B der Flasche ein, um den Probeninjektionsvorgang abzuschließen. Sobald Sie fertig sind, öffnen Sie die Tür der Operationskammer, um die Reagenzflasche in das Metallbad zu legen.Ziehen Sie den C2-Stecker des Chips und den Schnellverbinder A der Reagenzflasche heraus. Schließen Sie den Seitenrohranschluss der Reagenzflasche an den C2-Stecker und den oberen Rohranschluss an den O2-Anschluss an. Schließen Sie dann die Tür der Operationskammer.Um die Funktion der Wachstumskurvenmessung auszuwählen, klicken Sie in der Parametereinstellungsschnittstelle auf Wachstumskurve und geben Sie die Zahl als 15 ein. Schalten Sie dann den OD-Detektionsschalter ein und stellen Sie die Wellenlänge auf 600 Nanometer ein. Klicken Sie auf die Registerkarte Start, um die Dropletgenerierung zu starten.Der Vorgang dauert 15 Minuten. Wenn auf der Hauptschnittstelle ein Popup-Fenster angezeigt wird, das zu einer Meldung auffordert, öffnen Sie die Tür der Operationskammer, um die Reagenzflasche herauszunehmen und die C2- und O2-Anschlüsse anzuschließen. Nachdem Sie die Tür geschlossen haben, klicken Sie im Popup-Fenster auf die Schaltfläche OK, um die Tröpfchen automatisch zu kultivieren und die OD-Werte zu erkennen.Wenn die Wachstumskurve die stationäre Phase erreicht, klicken Sie auf die Schaltfläche Datenexport, um die OD-Daten zu exportieren. Wählen Sie den Datenspeicherpfad aus und exportieren Sie den während des Anbauzeitraums aufgezeichneten OD-Wert im CVS-Format Um die Wachstumskurve darzustellen, verwenden Sie Mapping-Software wie Excel und Origin 9.0. Injizieren Sie die erforderlichen Mengen der anfänglichen Bakterienlösung, des frischen Mediums und des MMC-Öls in die separaten sterilisierten Reagenzflaschen für die anfängliche Bakterienlösung im Frischmedium, wie zuvor erläutert.Um die Funktion der adaptiven Evolution auszuwählen, klicken Sie in der Software auf ALE. Schalten Sie in der Parametereinstellungsschnittstelle den OD-Erkennungsschalter ein, stellen Sie dann alle im Manuskript beschriebenen Parameter ein und klicken Sie auf die Registerkarte Start, um die Dropletgenerierung zu starten. Der Vorgang dauert etwa 25 Minuten.Beobachten Sie während jeder Teilkultivierungsperiode, ob die maximalen OD-Werte der Tröpfchen signifikant gestiegen sind. Wenn die Erhöhung auftritt und die Experimentanforderungen erfüllt, klicken Sie auf die Schaltfläche Datenexport, um die OD-Daten zu exportieren. Um die Zieltröpfchen aus der MMC zu extrahieren, klicken Sie auf die Registerkarte Screening, um die Funktion der Tröpfchenextraktion auszuwählen.Wählen Sie dann die Option Sammeln und klicken Sie auf die Anzahl der Zieltröpfchen. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf OK. Warten Sie, bis das Popup-Fenster Sie zu einer Meldung auffordert. Stecken Sie dann den CF-Schnellverbinder zur Abholung in das Mikrozentrifugenröhrchen und klicken Sie auf OK. Nach ein bis zwei Minuten, wenn die Softwareschnittstelle ein neues Fenster mit der Meldung öffnet, setzen Sie den CF-Schnellverbinder wieder ein und klicken Sie auf OK, damit MMC weiter ausgeführt wird.Wenn das nächste Zieltröpfchen die Tröpfchenerkennungsstelle erreicht, sammeln Sie es wie zuvor angegeben. Verwenden Sie eine 2,5-Mikroliter-Pipette, um das Tröpfchen herauszunehmen und auf eine 90 Millimeter große feste Platte zu legen, gefolgt von der gleichmäßigen Verteilung des Tropfens mit einem dreieckigen Glasstab mit einer Seitenlänge von drei Zentimetern, dann kultivieren Sie den Tropfen in einem 37 Grad Celsius Konstanttemperatur-Inkubator für 72 Stunden. Später pflücken Sie drei bis fünf unabhängige Bakterienkolonien, um jede Kolonie separat in einem 50-Milliliter-Schüttelkolben mit 10 Millilitern frischem Medium in einem Schüttelinkubator bei 200 Umdrehungen pro Minute und 37 Grad Celsius für 48 bis 72 Stunden zu kultivieren.Befolgen Sie nach der Inkubation die entsprechenden Standardvorschriften, um die kultivierte Bakterienlösung im Glycerinröhrchen zu lagern. Die repräsentative Analyse zeigt die Wachstumskurven von 50 Tröpfchen im gesamten adaptiven Evolutionsprozess. Es wurde beobachtet, dass der methanolessentielle Escherichia coli-Stamm oder MeSV2.2 ein anfänglich langsames Wachstum aufwies, gefolgt von einem schnellen Wachstum.Die Wachstumskurve von Tröpfchen sechs im gesamten adaptiven Evolutionsprozess wurde separat dargestellt. Der maximale OD600-Wert in der ersten Generation betrug 0,37, was in der letzten Subkultivierungsperiode auf 0,58 anstieg, was darauf hindeutet, dass die Sorte im Tropfen sechs eine offensichtliche adaptive Entwicklung erreicht hat. Weiterhin wurden die Wachstumskurven der Tröpfchensechsersorte und der Ausgangssorte verglichen.Der Tropfensechserstamm zeigte in der stationären Phase eine höhere maximale spezifische Wachstumsrate und Zellkonzentration als der Anfangsstamm. Das Wichtigste ist, sicherzustellen, dass die Verbindung des Instrumentenchips und der Reagenzflasche korrekt ist, dh die Tröpfchen für den normalen Ablauf der Operationen. Diese Methode bietet Forschern eine neue Idee für die Kultivierung von Mikroorganismen und bietet auch eine effiziente und kostengünstige Plattform für die adaptive Evolution von Stämmen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC)

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Forschung

Biotechnik

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Anbau von Säugetierzellen mit einem Einweg-Bioreaktorsystem Pneumatische

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electro Studium der Lungenkrebszellen unter Verwendung eines Mehrkanal-Zwei elektrischen Feldes Mikrofluidik-Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A Novel Bioreaktor für High Density Anbau von Diverse mikrobiellen Gemeinschaften

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design und Implementierung eines automatisierten Illuminating, Anzucht und Probenahmesystem für Mikrobielle optogenetische Anwendungen

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Zusammenbau und Verfolgung der mikrobiellen Gemeinschaftsentwicklung innerhalb einer Microwell Array Plattform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Prospektion mikrobielle Stämme für Bioremediation und Probiotika Entwicklung für Metaorganismus Forschung und Konservierung

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Prozessoptimierung mit automatisierten Mikro-Bioreaktoren mit hohem Durchsatz in der chinesischen Hamster-Ovarialzell-Kultivierung

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Generieren kontrollierter, dynamischer chemischer Landschaften zur Untersuchung des mikrobiellen Verhaltens

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identifikation der Resistenz gegen Pseudomonas syringae pv. Tomate in Tomaten mit Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...