Name: automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)
Uploaded: 2022-02-18T12:30:00
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이 연구는 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2018YFA0901500), 중국 국립 자연 과학 재단 (21627812)의 국가 핵심 과학 기기 및 장비 프로젝트 및 칭화 대학 이니셔티브 과학 연구 프로그램 (20161080108)의 지원을 받았다. 또한 메탄올 필수 대장균 균주 버전 2.2(MeSV2.2)의 제공을 위해 Julia A. Vorholt 교수(미생물학 연구소, 생물학과, 취리히 취리히, 취리히 8093, 스위스)에게 감사드립니다.

1. 계기 및 소프트웨어 설치
<ol><li>깨끗하고 멸균 된 환경 (예 : 깨끗한 벤치)을 MMC를위한 전용 영구 공간으로 선택하십시오. MMC를 공간에 꾸준히 설치하십시오. 참고: MMC를 강한 전기장, 자기장 및 강한 방열원의 간섭으로부터 멀리하십시오. 심한 진동이 광학 감지 부품에 영향을 미치지 않도록 하십시오. MMC에 AC220 V, 50 HZ의 전원 공급 장치를 제공하십시오. MMC에 대한 자세한 내용은...

<ol>
	<li>Lewis, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms.">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li><li>Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microscale+processing+technologies+for+quantification+of+biocatalytic+Baeyer-Villiger+oxidation+kinetics.">The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).</li><li>Harms, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+a+24-station+high+throughput+microbioreactor.">Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).</li><li>Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-four+well+plate+miniature+bioreactor+system+as+a+scale-down+model+for+cell+culture+process+development.">Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo-Lector+-+a+novel+platform+for+automated+high-throughput+cultivations+in+microtiter+plates+with+high+information+content.">Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content.</a> Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+a+kinetics+analysis+of+the+high-pressure+inactivation+of+microorganisms+using+microplates.">High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).</li><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics.">Droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li><li>Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+microbiology:+techniques,+applications+and+challenges.">Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).</li><li>Liao, P. Y., Huang, Y. 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H., Zhang, C., Fei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empowering+a+methanol-dependent+Escherichia+coli+via+adaptive+evolution+using+a+high-throughput+microbial+microdroplet+culture+system.">Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).</li><li>Meyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-essential+growth+of+Escherichia+coli.">Methanol-essential growth of Escherichia coli.</a> Nature Communications. 9, 1508 (2018).</li><li>Gru&#776;nberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+growth+rate+0.6:+Corynebacterium+glutamicum+cultivated+in+highly+diluted+environments.">Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).</li><li>Kaganovitch, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+single-cell+analysis+in+picoliter-sized+batch+cultivation+chambers.">Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers.</a> New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).</li><li>Baraban, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millifluidic+droplet+analyser+for+microbiology.">Millifluidic droplet analyser for microbiology.</a> Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).</li><li>Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+adaptation+in+microdroplet+chemostats.">Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).</li><li>Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+droplet-based+microfluidic+platform+for+multiplexed+analysis+of+biochemical+markers+in+small+volumes.">Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes.</a> Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).</li><li>Watterson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+high-throughput+cultivation+for+accurate+screening+of+antibiotic+resistant+gut+microbes.">Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes.</a> eLife. 9, 56998 (2020).</li><li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactants+in+droplet-based+microfluidics.">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li><li>Nitschke, M., Pastore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+properties+of+a+surfactant+obtained+from+Bacillus+subtilis+grown+on+cassava+wastewater.">Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater.</a> Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).</li><li>Jiang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+biofuels+and+biochemicals+production+from+sustainable+resources+using+co-cultivation+systems.">Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems.</a> Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).</li></ol>

이 프로토콜은 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 사용하여 자동화된 미생물 배양 및 장기 적응 진화를 수행하는 방법을 제시합니다. MMC는 소형화, 자동화 및 고처리량 미생물 배양 시스템입니다. 기존의 미생물 고처리량 배양 방법 및 장비와 비교하여 MMC는 낮은 노동력 및 시약 소비, 간단한 조작, 온라인 검출 (OD 및 형광), 고분해능 데이터 수집 및 우수한 병렬화와 같은 많은 장점을 가지고...

미생물 재배는 미생물 과학 연구 및 산업 응용을위한 중요한 토대 이며, 미생물 1,2,3의 격리, 식별, 재구성, 스크리닝 및 진화에 널리 사용됩니다. 기존의 미생물 재배 방법은 주로 시험관, 진탕 플라스크 및 고체 플레이트를 재배 용기로 사용하며 진탕 배양기, 분광 광도계, 마이크로 플레이트 판독기 및 미생물 재배, 검출 및 스크리닝을위한 기타 장비와 결합됩니다. 그러나 이러한 방법에는 번거로운 작업, 낮은 처리량, 낮은 효율 및 많은 노동 및 시약 소비와 같은 많은 문제가 있습니다. 최근 몇 년 동안 개발 된 고처리량 재배 방법은 주로 마이크로 플레이트를 기반으로합니다. 그러나 마이크로플레이트는 낮은 수준의 용존 산소, 열악한 혼합 특성, 심한 증발 및 열 효과를 가지며, 이는 종종 불량 한 성장 상태 및 미생물 4,5,6,7의 실험 병렬화로 이어진다; 반면에 자동 재배 및 공정 검출 8,9를 달성하기 위해서는 액체 처리 워크 스테이션 및 마이크로 플레이트 판독기와 같은 값 비싼 장비를 장착해야합니다.
미세 유체 기술의 중요한 분야로서, 액적 미세 유체 학은 전통적인 연속 유동 미세 유체 시스템을 기반으로 최근 몇 년 동안 개발되었습니다. 두 개의 비혼화성 액체상(보통 오일-물)을 사용하여 분산된 마이크로액적을 생성하고 이들(10)에서 작동하는 이산 유동 미세유체 기술이다. 마이크로 액적은 작은 부피, 큰 비표면적, 높은 내부 질량 전달 속도, 구획화로 인한 교차 오염이 없으며 강력한 제어 가능성과 액적의 높은 처리량의 장점을 가지고 있기 때문에 미생물의 고처리량 재배, 선별 및 진화에 액적 미세 유체 기술을 적용하는 많은 종류의 연구가있었습니다11 . 그러나 액적 미세 유체 기술을 대중화하고 널리 적용하기위한 일련의 주요 문제가 여전히 있습니다. 첫째, 액적 미세 유체 공학의 작동은 번거롭고 복잡하여 작업자에게 높은 기술 요구 사항을 초래합니다. 둘째, 액적 미세 유체 기술은 광학, 기계 및 전기 구성 요소를 결합하고 생명 공학 응용 시나리오와 관련되어야합니다. 여러 분야의 협력이 없다면 단일 실험실 또는 팀이 효율적인 액적 미세 유체 제어 시스템을 구축하는 것은 어렵습니다. 셋째, 소량의 마이크로액적(피콜리터(pL)에서 마이크로리터(μL)까지)으로 인해, 서브재배, 분류 및 샘플링과 같은 일부 기본적인 미생물 작업을 위한 액적의 정확한 자동 제어 및 실시간 온라인 검출을 실현하는 데 많은 어려움이 소요되며, 통합 장비 시스템(12)을 구축하는 것도 어렵다.
상기 문제점을 해결하기 위하여, 액적 미세유체 기술(13)에 기초한 자동 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)이 성공적으로 개발되었다. MMC는 액적 인식 모듈, 액적 스펙트럼 감지 모듈, 미세유체 칩 모듈 및 샘플링 모듈의 네 가지 기능 모듈로 구성됩니다. 모든 모듈의 시스템 통합 및 제어를 통해 생성, 재배, 측정 (광학 밀도 (OD) 및 형광), 분리, 융합, 물방울 분류를 포함한 자동화 된 운영 시스템이 정확하게 확립되어 미생물 액적 재배 과정에서 필요한 접종, 재배, 모니터링, 하위 재배, 분류 및 샘플링과 같은 기능의 통합을 달성합니다. MMC는 2-3 μL 부피의 최대 200개의 복제 액적 배양 단위를 보유할 수 있으며, 이는 200개의 진탕 플라스크 배양 단위에 해당한다. 마이크로 액적 재배 시스템은 미생물의 성장 동안 비 오염, 용존 산소, 혼합 및 질량 에너지 교환의 요구 사항을 충족시킬 수 있으며 성장 곡선 측정, 적응 진화, 단일 요인 다단계 분석 및 대사 산물 연구 및 분석 (형광 검출 기준)13,14과 같은 여러 통합 기능을 통해 미생물 연구의 다양한 요구를 충족시킬 수 있습니다.
여기서, 프로토콜은 MMC를 사용하여 자동화 및 미생물 배양 및 적응 진화를 수행하는 방법을 자세히 소개한다(도 1). MMC에서의 적응 진화를 입증하기 위해 야생형 대장 균(E. coli) MG1655를 일례로 하여 성장 곡선 측정 및 메탄올-필수 대장균 균주 MeSV2.215를 수득하였다. MMC 용 운영 소프트웨어가 개발되어 작업을 매우 간단하고 명확하게 만듭니다. 전체 과정에서 사용자는 초기 박테리아 용액을 준비하고 MMC의 조건을 설정 한 다음 박테리아 용액 및 관련 시약을 MMC에 주입해야합니다. 그 후, MMC는 액적 생성, 인식 및 번호 매기기, 재배 및 적응 진화와 같은 작업을 자동으로 수행합니다. 또한 높은 시간 분해능을 가진 물방울의 온라인 검출 (OD 및 형광)을 수행하고 소프트웨어에 관련 데이터 (내보낼 수 있음)를 표시합니다. 작업자는 결과에 따라 언제든지 재배 과정을 중단하고 후속 실험을 위해 표적 액적을 추출 할 수 있습니다. MMC는 작동하기 쉽고 노동력과 시약을 덜 소비하며 상대적으로 높은 실험 처리량과 우수한 데이터 병렬 성을 가지며 이는 기존 재배 방법에 비해 상당한 이점을 가지고 있습니다. 연구자들이 관련 미생물 연구를 수행 할 수있는 저렴한 비용, 작동 친화적이고 강력한 실험 플랫폼을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m PVDF filter membrane</td>
			<td>Merck Millipore Ltd.</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Sterilize the MMC oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-289BSW</td>
			<td>For reagent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>For solid plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20011160</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.</td>
			<td>DL-CJ-INDII</td>
			<td>For aseptic operation and UV sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10007216</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>E450</td>
			<td>Software installation and MMC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Shanghai qixin scientific instrument co., LTD</td>
			<td>LRH 250</td>
			<td>For the microbial cultivation using solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>AR 3130</td>
			<td>For reagent weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>For droplet collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10011928</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>2.0 mL</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2054</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G66258A</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Pressure Steam Sterilization Pot</td>
			<td>SANYO Electric</td>
			<td>MLS3020</td>
			<td>For autoclaved sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>420322</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>P815661</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>M813895</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>BIOBYING</td>
			<td>1305715</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial Microdroplet Culture System (MMC)</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;MMC-I</td>
			<td>Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&#38;id=110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-ALE-OD</td>
			<td>For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC oil</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-M/S-OD</td>
			<td>The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20026118</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G81793J</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G10267B</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10001518</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>90 mm</td>
			<td>For the preparation of solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>2.5 &#956;L, 10 &#956;L, 100&#956;L, 1000&#956;L</td>
			<td>For liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick connector A</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent bottle</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-PCB</td>
			<td>Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flask</td>
			<td>Union-Biotech</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>For microbial cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.</td>
			<td>SKY-210 2B</td>
			<td>For the microbial cultivation in shake flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8290</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>Draw liquid and inject it into the reagent bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>OUBEL Hardware Store</td>
			<td>22G</td>
			<td>Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature refrigerator</td>
			<td>SANYO Ultra-low</td>
			<td>MDF-U4086S</td>
			<td>For strain preservation (-80 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV&#8211;Vis spectrophotometer</td>
			<td>General Electric Company</td>
			<td>Ultrospec 3100 pro</td>
			<td>For the measurement of OD values</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SV8080</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)

기존의 미생물 재배 방법은 일반적으로 번거로운 작업, 낮은 처리량, 낮은 효율 및 노동 및 시약의 큰 소비를 가지고 있습니다. 더욱이, 최근 개발된 마이크로플레이트 기반의 고처리량 재배 방법은 낮은 용존산소, 불량한 혼합물, 심한 증발 및 열 효과로 인해 미생물 성장 상태 및 실험 병렬화가 불량하다. 작은 부피, 높은 처리량 및 강력한 제어 가능성과 같은 마이크로 액적의 많은 장점으로 인해 액적 기반 미세 유체 기술은 이러한 문제를 극복 할 수 있으며, 이는 고처리량 미생물 재배, 스크리닝 및 진화에 대한 많은 종류의 연구에 사용되었습니다. 그러나 대부분의 선행 연구는 실험실 건설 및 적용 단계에 남아 있습니다. 높은 운영 요구 사항, 높은 건설 어려움 및 자동화 된 통합 기술의 부족과 같은 몇 가지 주요 문제는 미생물 연구에서 액적 미세 유체 기술의 광범위한 적용을 제한합니다. 여기에서는 액적 미세유체 기술을 기반으로 자동화된 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)이 성공적으로 개발되어 미생물 액적 재배 과정에서 필요한 접종, 재배, 온라인 모니터링, 하위 재배, 분류 및 샘플링과 같은 기능의 통합을 달성했습니다. 본 프로토콜에서는 야생형 대장 균(E. coli) MG1655 및 메탄올-필수 대장균 균주(MeSV2.2)를 예로 들어 MMC를 사용하여 자동화되고 상대적으로 높은 처리량의 미생물 배양 및 적응 진화를 수행하는 방법을 상세히 소개하였다. 이 방법은 작동하기 쉽고 노동력과 시약을 덜 소비하며 실험 처리량이 높고 데이터 병렬성이 우수하여 기존 재배 방법에 비해 큰 장점이 있습니다. 과학 연구자가 관련 미생물 연구를 수행 할 수있는 저렴한 비용, 작동 친화적이며 결과 신뢰할 수있는 실험 플랫폼을 제공합니다.

이 프로토콜은 대장균 MG1655 및 MeSV2.2 균주를 예로 사용하여 MMC에서 자동화되고 상대적으로 높은 처리량 전략을 갖는 미생물 배양 및 메탄올 필수 적응 진화를 입증합니다. 성장 곡선 측정은 주로 미생물 재배를 특성화하기 위해 사용되었다. 적응 진화는 자동화된 연속 서브 재배에 의해 수행되었고, 각각의 서브 재배 동안 선택적 압력으로서 고농도의 메탄올을 첨가하였다. 적응 진화가 실?...

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Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC

이 프로토콜은 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 사용하여 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화를 수행하는 방법을 설명합니다. MMC는 미생물을 자동으로 지속적으로 재배 및 하위 재배 할 수 있으며 상대적으로 높은 처리량과 우수한 병렬화로 온라인으로 성장을 모니터링하여 노동 및 시약 소비를 줄일 수 있습니다.

미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 이용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and ...

이 방법은 종래의 미생물 재배 방법의 문제점을 해결하는데 도움을 줄 수 있다. 이 제품은 자동화된 미생물 재배 및 적응 진화를 위한 저비용, 작동 친화적이며 결과 신뢰할 수 있는 실험 플랫폼을 제공합니다. 이 기술은 운영을 자동화하고 노동 소비를 줄입니다.그리고 동시에, 그것은 신뢰할 수있는 결과와 간단한 조작으로 좋은 문화 성능을 가지고 있습니다. 이 기술은 성장 곡선 측정, 적응 실험실 진화 및 단일 요인 다단계 분석과 같은 미생물학 연구 분야에서 주로 사용됩니다. 주사기 바늘을 0.41 밀리미터의 내경과 0.71 밀리미터의 외부 직경을 가진 주사기 바늘을 퀵 커넥터 A 및 시약 병에 연결하여 실험 준비를 시작하십시오.그런 다음 모든 장비를 섭씨 121도에서 15 분 동안 오토클레이브하십시오. 미세 유체 칩을 설치하려면 작동 챔버의 문을 열고 광섬유 프로브를 들어올립니다. 전기장 구멍을 바늘과 맞춘 후 칩을 칩 받침대에 부드럽게 놓은 다음 두 개의 위치 결정 열을 위치 결정 구멍에 삽입하고 광섬유 프로브를 내려 놓습니다.다음으로, 칩 상의 퀵 커넥터 A를 원고에 기재된 바와 같이 위치 번호에 따라 미생물 마이크로액적 배양 시스템 또는 MMC의 대응하는 포트에 연결한다. 완료되면 작동 챔버의 문을 닫으십시오. 배양된 에스케리치아 콜리 MG1655 현탁액을 0.05 내지 0.1의 OD600에 배지로 희석하여 10 밀리리터의 초기 박테리아 용액을 얻었다.MMC를 초기화하려면 초기화 탭을 클릭합니다. 초기화 인터페이스가 나타나면 재배 온도를 섭씨 37도로, 광전 신호 값을 0.6으로 설정합니다. 초기화에는 약 20분이 소요됩니다.나중에 멸균 된 시약 병을 깨끗한 벤치에 놓고 뚜껑을 조이십시오. 10 밀리리터의 멸균 주사기를 사용하여 주사기 바늘에서 옆 튜브로 세 ~ 다섯 밀리리터의 MMC 오일을 시약 병에 주입하십시오. 그런 다음 시약 병을 천천히 기울이고 회전시켜 오일이 내벽에 완전히 침투하도록하십시오.병에 초기 박테리아 용액 다섯 밀리리터를 주입 한 후, MMC 오일의 다섯 밀리리터 내지 일곱 밀리리터를 주입하여 시약 병을 채운다. 시약 병의 독립적 인 퀵 커넥터 A를 꺼내 병의 퀵 커넥터 B에 퀵 커넥터 A를 삽입하여 샘플 주입 작업을 완료하십시오. 완료되면 작업 챔버의 문을 열어 시약 병을 금속 욕조에 넣으십시오.칩의 C2 커넥터와 시약 병의 빠른 커넥터 A를 당깁니다. 시약 병의 측면 튜브 커넥터를 C2 커넥터에 연결하고 상단 튜브 커넥터를 O2 커넥터에 연결합니다. 그런 다음 수술실의 문을 닫으십시오.성장 곡선 측정 기능을 선택하려면 매개 변수 설정 인터페이스에서 성장 곡선을 클릭하여 숫자를 15로 입력합니다. 그런 다음 OD 감지 스위치를 켜고 파장을 600 나노 미터로 설정하십시오. 시작 탭을 클릭하여 드롭릿 생성을 시작합니다.이 프로세스를 완료하는 데 15분이 걸립니다. 메인 인터페이스에 메시지를 표시하는 팝업 창이 나타나면 수술실 문을 열어 시약 병을 꺼내고 C2 및 O2 커넥터를 연결하십시오. 문을 닫은 후 팝업 창에서 확인 버튼을 클릭하여 자동으로 물방울을 재배하고 OD 값을 감지합니다.성장 곡선이 고정 단계에 도달하면 데이터 내보내기 단추를 클릭하여 OD 데이터를 내보냅니다. 데이터 저장 경로를 선택하고 재배 기간 동안 기록된 OD 값을 CVS 형식으로 내보내 성장 곡선을 플로팅하려면 Excel 및 Origin 9.0과 같은 매핑 소프트웨어를 사용합니다. 앞서 설명한 바와 같이 필요한 양의 초기 박테리아 용액, 신선한 배지 및 MMC 오일을 새로운 배지의 초기 박테리아 용액에 대해 별도의 멸균 시약 병에 주입하십시오.적응 진화의 기능을 선택하려면 소프트웨어에서 ALE를 클릭하십시오. 매개 변수 설정 인터페이스에서 OD 감지 스위치를 켠 다음 원고에 설명 된 모든 매개 변수를 설정하고 시작 탭을 눌러 액적 생성을 시작하십시오. 이 과정은 약 25 분이 소요됩니다.각 하위 재배 기간 동안 액적의 최대 OD 값이 크게 증가했는지 여부를 관찰하십시오. 증가가 발생하고 실험 요구 사항을 충족하는 경우 데이터 내보내기 단추를 클릭하여 OD 데이터를 내보냅니다. MMC에서 표적 액적을 추출하려면 스크리닝 탭을 클릭하여 액적 추출 기능을 선택하십시오.그런 다음 수집 옵션을 선택하고 대상 물방울의 수를 클릭하십시오. 완료되면 확인을 클릭하십시오. 팝업 창이 메시지를 표시하는 것을 기다립니다. 그런 다음 CF 퀵 커넥터를 수집을 위해 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 확인을 클릭하십시오. 소프트웨어 인터페이스가 메시지를 표시하는 새 창을 팝업하면 한 두 분 후에 CF 퀵 커넥터를 다시 삽입하고 확인을 클릭하여 MMC가 계속 실행되도록 합니다.다음 대상 액적이 액적 인식 사이트에 도달하면 이전에 지정된 대로 수집합니다. 2.5 마이크로 리터 피펫을 사용하여 물방울을 꺼내 90 밀리미터 고체 플레이트에 놓은 다음 측면 길이가 3 센티미터 인 유리 삼각형 코팅 막대로 방울을 고르게 퍼뜨린 다음 섭씨 37도 항온 배양기에서 72 시간 동안 방울을 경작하십시오. 나중에 3 ~ 5 개의 독립적 인 박테리아 식민지를 선택하여 분당 200 회전, 섭씨 37도에서 48 ~ 72 시간 동안 10 밀리리터의 신선한 배지가있는 50 밀리리터 쉐이크 플라스크에서 각 식민지를 별도로 배양하십시오.배양 후, 관련 표준 규정을 따라 배양된 박테리아 용액을 글리세롤 튜브에 저장한다. 대표적인 분석은 전체 적응 진화 과정에서 50 방울의 성장 곡선을 보여줍니다. 메탄올 필수 에스케리치아 콜라이 균주 또는 MeSV2.2가 빠른 성장에 이어 초기 느린 성장을 나타냄을 관찰하였다.전체 적응 진화 과정에서 액적 여섯 개에 대한 성장 곡선을 별도로 플롯팅하였다. 첫 번째 세대의 최대 OD600 값은 0.37이었으며, 이는 마지막 하위 배양 기간 동안 0.58로 증가했으며, 이는 액적 6의 균주가 명백한 적응 진화를 실현했음을 나타냅니다. 또한, 액적 여섯 균주와 초기 균주의 성장 곡선을 비교하였다.액적 여섯 균주는 초기 균주보다 정지기에서 더 높은 최대 비생장률 및 세포 농도를 나타내었다. 가장 중요한 것은 계기판과 시약 병의 연결이 올바른지 확인하는 것인데, 이는 작업이 정상적으로 진행될 수있는 물방울입니다. 이 방법은 연구원에게 미생물 배양을위한 새로운 아이디어를 제공하고 균주의 적응 진화를위한 효율적이고 저렴한 플랫폼을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC)

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

연구

생체공학

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

단일 사용 공압 생물 반응기 시스템을 사용하여 포유 동물 세포의 배양

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

멀티 채널 듀얼 전기장 미세 유체 칩을 이용하여 폐암 세포의 Electrotaxis 연구

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

다양한 미생물 커뮤니티의 고밀도 배양위한 새로운 생물 반응기

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

마이크로 웰 어레이 플랫폼 내 미생물 공동체 개발의 구성 및 추적

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

메타유기 연구 및 보존을 위한 생물 정화 및 프로바이오틱스 개발을 위한 미생물 균주 발굴

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

중국 햄스터 난소 세포 재배에서 고처리량 자동화 마이크로 바이오리액터를 사용한 공정 최적화

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

미생물 행동을 연구하기 위한 제어된 동적 화학 적 경관 생성

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

슈도모나스 주사기 pv에 대한 저항의 높은 처리량 식별. 모종 홍수 분석을 사용하여 토마토토마토

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...