Name: automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)
Uploaded: 2022-02-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC at JoVE.com

Denne studien ble støttet av National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), National Key Scientific Instrument and Equipment Project of the National Natural Science Foundation of China (21627812) og Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). Vi takker også prof. Julia A. Vorholt (Institutt for mikrobiologi, Institutt for biologi, ETH Zürich, Zürich 8093, Sveits) for levering av metanol-essensielle E. coli-stammen versjon 2.2 (MeSV2.2).

1. Instrument- og programvareinstallasjon
<ol><li>Velg et rent og sterilt miljø (for eksempel en ren benk) som et dedikert permanent område for MMC. Installer MMC jevnt i rommet. MERK: Hold MMC unna forstyrrelser fra sterke elektriske felt, magnetfelt og sterke varmestrålingskilder. Unngå alvorlig vibrasjon fra å påvirke komponentene for optisk deteksjon. Gi strømforsyningen til AC220 V, 50 HZ til MMC. Hvis du vil ha mer informasjon om MMC, kan du se Innholdsfortegnelsen og w...

<ol>
	<li>Lewis, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms.">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li><li>Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+technology+in+industrial+biotechnology.">High-throughput screening technology in industrial biotechnology.</a> Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).</li><li>Kim, J., Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+analysis+for+the+optimization+of+Campylobacter+isolation+from+chicken+carcasses+using+selective+media.">Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).</li><li>Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microscale+processing+technologies+for+quantification+of+biocatalytic+Baeyer-Villiger+oxidation+kinetics.">The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).</li><li>Harms, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+a+24-station+high+throughput+microbioreactor.">Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).</li><li>Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-four+well+plate+miniature+bioreactor+system+as+a+scale-down+model+for+cell+culture+process+development.">Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo-Lector+-+a+novel+platform+for+automated+high-throughput+cultivations+in+microtiter+plates+with+high+information+content.">Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content.</a> Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+a+kinetics+analysis+of+the+high-pressure+inactivation+of+microorganisms+using+microplates.">High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).</li><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics.">Droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li><li>Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+microbiology:+techniques,+applications+and+challenges.">Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).</li><li>Liao, P. Y., Huang, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divide+and+conquer:+analytical+chemistry+of+nucleic+acids+in+droplets.">Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets.</a> Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).</li><li>Jian, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+microdroplet+culture+system+(MMC):+An+integrated+platform+for+automated,+high-throughput+microbial+cultivation+and+adaptive+evolution.">Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).</li><li>Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empowering+a+methanol-dependent+Escherichia+coli+via+adaptive+evolution+using+a+high-throughput+microbial+microdroplet+culture+system.">Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).</li><li>Meyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-essential+growth+of+Escherichia+coli.">Methanol-essential growth of Escherichia coli.</a> Nature Communications. 9, 1508 (2018).</li><li>Gru&#776;nberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+growth+rate+0.6:+Corynebacterium+glutamicum+cultivated+in+highly+diluted+environments.">Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).</li><li>Kaganovitch, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+single-cell+analysis+in+picoliter-sized+batch+cultivation+chambers.">Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers.</a> New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).</li><li>Baraban, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millifluidic+droplet+analyser+for+microbiology.">Millifluidic droplet analyser for microbiology.</a> Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).</li><li>Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+adaptation+in+microdroplet+chemostats.">Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).</li><li>Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+droplet-based+microfluidic+platform+for+multiplexed+analysis+of+biochemical+markers+in+small+volumes.">Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes.</a> Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).</li><li>Watterson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+high-throughput+cultivation+for+accurate+screening+of+antibiotic+resistant+gut+microbes.">Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes.</a> eLife. 9, 56998 (2020).</li><li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactants+in+droplet-based+microfluidics.">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li><li>Nitschke, M., Pastore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+properties+of+a+surfactant+obtained+from+Bacillus+subtilis+grown+on+cassava+wastewater.">Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater.</a> Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).</li><li>Jiang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+biofuels+and+biochemicals+production+from+sustainable+resources+using+co-cultivation+systems.">Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems.</a> Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).</li></ol>

Denne protokollen presenterer hvordan du bruker det mikrobielle mikrodropletkultursystemet (MMC) til å utføre automatisert mikrobiell dyrking og langsiktig adaptiv evolusjon. MMC er et miniatyrisert, automatisert og mikrobielt dyrkingssystem med høy gjennomstrømning. Sammenlignet med konvensjonelle mikrobielle dyrkingsmetoder og instrumenter med høy gjennomstrømning, har MMC mange fordeler som lavt arbeids- og reagensforbruk, enkel drift, online deteksjon (OD og fluorescens), datainnsamling med høy tidsoppløsning...

Mikrobiell dyrking er et viktig grunnlag for mikrobiologisk vitenskapelig forskning og industrielle anvendelser, som er mye brukt i isolasjon, identifisering, rekonstruksjon, screening og utvikling av mikroorganismer 1,2,3. Konvensjonelle mikrobielle dyrkingsmetoder bruker hovedsakelig reagensrør, risteflasker og faste plater som dyrkingsbeholdere, kombinert med ristende inkubatorer, spektrofotometere, mikroplatelesere og annet utstyr for mikrobiell dyrking, deteksjon og screening. Imidlertid har disse metodene mange problemer, for eksempel tungvinte operasjoner, lav gjennomstrømning, lav effektivitet og stort forbruk av arbeidskraft og reagenser. Dyrkingsmetodene for høy gjennomstrømning utviklet de siste årene er hovedsakelig basert på mikroplaten. Men mikroplaten har et lavt nivå av oppløst oksygen, dårlig blandingsegenskap og alvorlig fordampning og termisk effekt, noe som ofte fører til dårlig vekststatus og eksperimenter parallellisering av mikroorganismer 4,5,6,7; På den annen side må den være utstyrt med dyrt utstyr, for eksempel væskehåndteringsarbeidsstasjoner og mikroplatelesere, for å oppnå automatisert dyrking og prosessdeteksjon 8,9.
Som en viktig gren av mikrofluidisk teknologi har dråpemikrofluidikk blitt utviklet de siste årene basert på tradisjonelle mikrofluidiske systemer med kontinuerlig strømning. Det er en diskret strømningsmikrofluid teknologi som bruker to umiskjennelige væskefaser (vanligvis oljevann) for å generere dispergerte mikrodråper og operere på dem10. Fordi mikrodråper har egenskapene til lite volum, stort spesifikt overflateareal, høy intern masseoverføringshastighet og ingen krysskontaminering forårsaket av oppdeling, og fordelene ved sterk kontrollerbarhet og høy gjennomstrømning av dråper, har det vært mange typer forskning som bruker dråpemikrofluidisk teknologi i høygjennomstrømningsdyrking, screening og utvikling av mikroorganismer11 . Imidlertid er det fortsatt en rekke viktige problemer for å gjøre dråpemikrofluidisk teknologi popularisert og mye anvendt. For det første er driften av dråpemikrofluidikk tungvint og intrikat, noe som resulterer i høye tekniske krav til operatører. For det andre kombinerer mikrofluidisk dråpeteknologi optiske, mekaniske og elektriske komponenter og må assosieres med bioteknologiske applikasjonsscenarier. Det er vanskelig for et enkelt laboratorium eller team å bygge effektive mikrofluidiske dråpekontrollsystemer hvis det ikke er noe tverrfaglig samarbeid. For det tredje, på grunn av det lille volumet av mikrodråpe (fra picoliter (pL) til mikroliter (μL)), tar det mye vanskelig å realisere presis automatisert kontroll og sanntids online deteksjon av dråper for noen grunnleggende mikrobielle operasjoner som sub-dyrking, sortering og prøvetaking, og det er også vanskelig å konstruere et integrert utstyrssystem12.
For å løse problemene ovenfor ble et automatisk mikrobielt mikrodropletkultursystem (MMC) vellykket utviklet basert på dråpemikrofluidisk teknologi13. MMC består av fire funksjonelle moduler: en dråpegjenkjenningsmodul, en dråpespektrumdeteksjonsmodul, en mikrofluidisk brikkemodul og en prøvetakingsmodul. Gjennom systemintegrasjon og kontroll av alle modulene er automatisert operativsystem inkludert generering, dyrking, måling (optisk tetthet (OD) og fluorescens), splitting, fusjon, sortering av dråper nøyaktig etablert, og oppnår integrasjon av funksjoner som inokulasjon, dyrking, overvåking, sub-dyrking, sortering og prøvetaking som kreves av prosessen med mikrobiell dråpekultivering. MMC kan romme opptil 200 replikere dråpekultiveringsenheter med 2-3 μL volum, noe som tilsvarer 200 risteflaske dyrking enheter. Mikrodråpekultiveringssystemet kan tilfredsstille kravene til ikke-forurensning, oppløst oksygen, blanding og masseenergiutveksling under veksten av mikroorganismer, og møte de ulike behovene til mikrobiell forskning gjennom flere integrerte funksjoner, for eksempel vekstkurvemåling, adaptiv evolusjon, enkeltfaktoranalyse på flere nivåer og metabolittforskning og analyse (basert på fluorescensdeteksjon)13,14.
Her introduserer protokollen hvordan du bruker MMC til å utføre automatisert og mikrobiell dyrking og adaptiv evolusjon i detalj (figur 1). Vi tok wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 som et eksempel for å demonstrere vekstkurvemålingen og en metanol-essensiell E. coli-stamme MeSV2.215 for å demonstrere den adaptive utviklingen i MMC. En operasjonsprogramvare for MMC ble utviklet, noe som gjør operasjonen veldig enkel og tydelig. I hele prosessen må brukeren forberede den første bakterieløsningen, angi forholdene i MMC, og deretter injisere bakterieløsningen og relaterte reagenser i MMC. Deretter utfører MMC automatisk operasjoner som dråpegenerering, anerkjennelse og nummerering, dyrking og adaptiv evolusjon. Den vil også utføre online deteksjon (OD og fluorescens) av dråpene med høy tidsoppløsning og vise relaterte data (som kan eksporteres) i programvaren. Operatøren kan stoppe dyrkingsprosessen når som helst i henhold til resultatene og trekke ut måldråpene for etterfølgende eksperimenter. MMC er enkel å betjene, bruker mindre arbeidskraft og reagenser, og har relativt høy eksperimentell gjennomstrømning og god data parallellitet, som har betydelige fordeler sammenlignet med konvensjonelle dyrkingsmetoder. Det gir en rimelig, driftsvennlig og robust eksperimentell plattform for forskere å utføre relatert mikrobiell forskning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m PVDF filter membrane</td>
			<td>Merck Millipore Ltd.</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Sterilize the MMC oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-289BSW</td>
			<td>For reagent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>For solid plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20011160</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.</td>
			<td>DL-CJ-INDII</td>
			<td>For aseptic operation and UV sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10007216</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>E450</td>
			<td>Software installation and MMC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Shanghai qixin scientific instrument co., LTD</td>
			<td>LRH 250</td>
			<td>For the microbial cultivation using solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>AR 3130</td>
			<td>For reagent weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>For droplet collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10011928</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>2.0 mL</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2054</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G66258A</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Pressure Steam Sterilization Pot</td>
			<td>SANYO Electric</td>
			<td>MLS3020</td>
			<td>For autoclaved sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>420322</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>P815661</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>M813895</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>BIOBYING</td>
			<td>1305715</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial Microdroplet Culture System (MMC)</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;MMC-I</td>
			<td>Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&#38;id=110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-ALE-OD</td>
			<td>For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC oil</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-M/S-OD</td>
			<td>The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20026118</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G81793J</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G10267B</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10001518</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>90 mm</td>
			<td>For the preparation of solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>2.5 &#956;L, 10 &#956;L, 100&#956;L, 1000&#956;L</td>
			<td>For liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick connector A</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent bottle</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-PCB</td>
			<td>Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flask</td>
			<td>Union-Biotech</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>For microbial cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.</td>
			<td>SKY-210 2B</td>
			<td>For the microbial cultivation in shake flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8290</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>Draw liquid and inject it into the reagent bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>OUBEL Hardware Store</td>
			<td>22G</td>
			<td>Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature refrigerator</td>
			<td>SANYO Ultra-low</td>
			<td>MDF-U4086S</td>
			<td>For strain preservation (-80 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV&#8211;Vis spectrophotometer</td>
			<td>General Electric Company</td>
			<td>Ultrospec 3100 pro</td>
			<td>For the measurement of OD values</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SV8080</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)

Konvensjonelle mikrobielle dyrkingsmetoder har vanligvis tungvinte operasjoner, lav gjennomstrømning, lav effektivitet og stort forbruk av arbeidskraft og reagenser. Videre har mikroplatebaserte dyrkingsmetoder med høy gjennomstrømning utviklet de siste årene dårlig mikrobiell vekststatus og eksperimenter parallellisering på grunn av lavt oppløst oksygen, dårlig blanding og alvorlig fordampning og termisk effekt. På grunn av mange fordeler med mikrodråper, for eksempel lite volum, høy gjennomstrømning og sterk kontrollerbarhet, kan den dråpebaserte mikrofluidiske teknologien overvinne disse problemene, som har blitt brukt i mange typer forskning på mikrobiell dyrking, screening og evolusjon med høy gjennomstrømning. Imidlertid forblir de fleste tidligere studier på scenen for laboratoriekonstruksjon og anvendelse. Noen sentrale problemstillinger, for eksempel høye operasjonelle krav, høy byggevansker og mangel på automatisert integrasjonsteknologi, begrenser den brede anvendelsen av mikrofluidisk dråpeteknologi i mikrobiell forskning. Her ble et automatisert Mikrobielt mikrodropletkultursystem (MMC) vellykket utviklet basert på mikrofluidisk dråpeteknologi, og oppnådde integrasjon av funksjoner som inokulasjon, dyrking, online overvåking, sub-dyrking, sortering og prøvetaking som kreves av prosessen med mikrobiell dråpekultivering. I denne protokollen ble wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 og en metanol-essensiell E. coli-stamme (MeSV2.2) tatt som eksempler for å introdusere hvordan du bruker MMC til å gjennomføre automatisert og relativt høy gjennomstrømning mikrobiell dyrking og adaptiv evolusjon i detalj. Denne metoden er enkel å betjene, bruker mindre arbeidskraft og reagenser, og har høy eksperimentell gjennomstrømning og god data parallellitet, som har store fordeler sammenlignet med konvensjonelle dyrkingsmetoder. Det gir en rimelig, driftsvennlig og resultatsikker eksperimentell plattform for vitenskapelige forskere å utføre relatert mikrobiell forskning.

Denne protokollen bruker E. coli MG1655 og en MeSV2.2-stamme som eksempler for å demonstrere mikrobiell dyrking og metanol-essensiell adaptiv evolusjon med en automatisert og relativt høy gjennomstrømningsstrategi i MMC. Vekstkurvemålingen ble hovedsakelig brukt til å karakterisere mikrobiell dyrking. Den adaptive utviklingen ble utført av automatisert kontinuerlig sub-dyrking og legge til en høy konsentrasjon av metanol som selektivt trykk under hver sub-dyrking. Hvorvidt adaptiv evolusjon hadde blitt re...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC at JoVE.com

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC

Denne protokollen beskriver hvordan du bruker det mikrobielle mikrodropletkultursystemet (MMC) til å utføre automatisert mikrobiell dyrking og adaptiv evolusjon. MMC kan dyrke og underdyrke mikroorganismer automatisk og kontinuerlig og overvåke veksten på nettet med relativt høy gjennomstrømning og god parallellisering, noe som reduserer arbeids- og reagensforbruket.

Automatisert mikrobiell dyrking og adaptiv evolusjon ved hjelp av mikrobielt mikrodropletkultursystem (MMC)

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and ...

Denne metoden kan bidra til å løse problemene med de konvensjonelle mikrobielle dyrkingsmetodene. Det gir en rimelig, driftsvennlig og resultatsikker eksperimentell plattform for automatisert mikrobiell dyrking og adaptiv evolusjon. Denne teknologien automatiserer driften og reduserer arbeidsforbruket betraktelig.Og samtidig har den god kulturytelse med pålitelige resultater og enkle operasjoner. Teknologien brukes hovedsakelig innen mikrobiologisk forskning, som vekstkurvemåling, adaptiv laboratorieutvikling og en enkeltfaktoranalyse på flere nivåer. Start forberedelsene til eksperimentet ved å koble sprøytenålen med en indre diameter på 0,41 millimeter og en ytre diameter på 0,71 millimeter til en rask kontakt A og reagensflaske.Deretter autoklaverer alt utstyret på 121 grader Celsius i 15 minutter. For å installere den mikrofluidiske brikken, åpne døren til operasjonskammeret og løft den optiske fibersonden. Etter å ha justert de elektriske felthullene med nålene, plasser brikken forsiktig på chip pidestallen, sett deretter de to posisjoneringskolonnene inn i posisjoneringshullene og legg ned den optiske fibersonden.Deretter kobler du hurtigkoblingen A på brikken til den tilsvarende porten til det mikrobielle mikrodropletkultursystemet eller MMC i henhold til posisjonsnummeret som beskrevet i manuskriptet. Når du er ferdig, lukk døren til operasjonskammeret. Fortynn den kultiverte Escherichia coli MG1655-suspensjonen med mediet til en OD600 på 0,05 til 0,1 for å oppnå 10 milliliter innledende bakterieoppløsning.Hvis du vil initialisere MMC, klikker du kategorien Initialisering . Når initialiseringsgrensesnittet vises, angir du dyrkingstemperaturen som 37 grader Celsius og den fotoelektriske signalverdien som 0,6. Initialisering vil ta omtrent 20 minutter.Legg senere en sterilisert reagensflaske på den rene benken og stram hetten. Bruk en steril sprøyte på 10 milliliter til å injisere tre til fem milliliter MMC-olje fra sprøytenålen til siderøret i reagensflasken. Vipp deretter og roter reagensflasken sakte for å få oljen til å infiltrere den indre veggen fullt ut.Etter å ha injisert fem milliliter av en innledende bakterieløsning i flasken, fyll reagensflasken ved å injisere fem til syv milliliter AV MMC-oljen. Trekk ut den uavhengige hurtigkoblingen A på reagensflasken og sett hurtigkoblingen A inn i flaskens hurtigkobling B for å fullføre prøveinjeksjonsoperasjonen. Når du er ferdig, åpner du døren til operasjonskammeret for å sette reagensflasken inn i metallbadet.Trekk ut C2-kontakten på brikken og hurtigkoblingen A på reagensflasken. Koble siderørkontakten på reagensflasken til C2-kontakten og den øverste rørkontakten til O2-kontakten. Lukk deretter døren til operasjonskammeret.For å velge funksjonen til vekstkurvemåling, klikk på Vekstkurve i parameterinnstillingsgrensesnittet skriv inn tallet som 15. Slå deretter på OD-deteksjonsbryteren og still inn bølgelengden som 600 nanometer. Klikk på Start-fanen for å starte generering av slippverktøy.Prosessen vil ta 15 minutter å fullføre. Når et popup-vindu vises på hovedgrensesnittet som ber om en melding, åpner du døren til operasjonskammeret for å ta ut reagensflasken og koble til C2- og O2-kontaktene. Når du har lukket døren, klikker du på OK-knappen i popup-vinduet for å dyrke dråpene automatisk og oppdage OD-verdiene.Når vekstkurven når den stasjonære fasen, klikker du dataeksportknappen for å eksportere OD-dataene. Velg datalagringsbanen og eksporter OD-verdien som er registrert under dyrkingsperioden i CVS-formatet Hvis du vil tegne inn vekstkurven, bruker du kartprogramvare som Excel og Origin 9.0. Injiser nødvendige volumer av den første bakterieløsningen, fersk medium og MMC-olje i de separate steriliserte reagensflaskene for den første bakterieløsningen i det friske mediet som forklart tidligere.For å velge funksjonen til adaptiv evolusjon, klikk på ALE i programvaren. I parameterinnstillingsgrensesnittet slår du på OD-deteksjonsbryteren, angir deretter alle parametrene som er beskrevet i manuskriptet, og trykker på Start-fanen for å starte dråpegenerering. Prosessen vil ta omtrent 25 minutter.Under hver underdyrkingsperiode må du observere om de maksimale OD-verdiene til dråpene har økt betydelig. Hvis økningen skjer og oppfyller eksperimentkravene, klikker du på dataeksportknappen for å eksportere OD-dataene. Hvis du vil trekke ut måldråpene fra MMC, klikker du kategorien Screening for å velge funksjonen for uttrekking av slippverktøy.Velg deretter Samle inn-alternativet og klikk på antall måldråper. Når du er ferdig, klikker du på OK. Vent til popup-vinduet ber om en melding. Sett deretter CF-hurtigkoblingen inn i mikrosenterrøret for innsamling og klikk på OK. Etter ett til to minutter når programvaregrensesnittet vil dukke opp et nytt vindu som ber om en melding, setter du inn CF-hurtigkoblingen tilbake og klikker på OK for å få MMC til å fortsette å kjøre.Når det neste måldråpen når slippverktøygjenkjenningsområdet, samler du det inn som angitt tidligere. Bruk en 2,5 mikroliterpipette til å ta ut og plassere dråpen på en 90 millimeter solid plate, etterfulgt av å spre dråpen jevnt med en glass trekantet belagt stang med en sidelengde på tre centimeter, og dyrk deretter dråpen i en 37 grader Celsius konstant temperaturinkubator i 72 timer. Senere velger du tre til fem uavhengige kolonier av bakterier for å dyrke hver koloni separat i en 50 milliliter shake kolbe med 10 milliliter friskt medium i en ristende inkubator ved 200 rotasjoner per minutt og 37 grader Celsius i 48 til 72 timer.Etter inkubasjonen, følg de relaterte standardforskriftene for å lagre den dyrkede bakterieløsningen i glyserolrøret. Den representative analysen viser vekstkurvene til 50 dråper i hele den adaptive utviklingsprosessen. Det ble observert at metanol essensielle Escherichia coli belastning eller MeSV2.2 viste innledende langsom vekst etterfulgt av rask vekst.Vekstkurven for dråpe seks i hele den adaptive utviklingsprosessen ble plottet separat. Den maksimale OD600-verdien i første generasjon var 0,37, som økte til 0,58 i den siste subkultiveringsperioden, noe som indikerer at belastningen i dråpe seks har realisert en åpenbar adaptiv evolusjon. Videre ble vekstkurvene til dråpen seks belastning og den første stammen sammenlignet.Dråpen seks stamme viste en høyere maksimal spesifikk vekstrate og cellekonsentrasjon i den stasjonære fasen enn den første stammen. Det viktigste er å sikre at tilkoblingen av instrumentbrikken og reagensflasken er riktig, som er dråpene for operasjoner for å fortsette normalt. Denne metoden gir forskere en ny ide for dyrking av mikroorganismer og gir også effektiv og rimelig plattform for adaptiv utvikling av stammer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC)

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

Microfluidic pikoliter bioreaktor for Microbial Encellede Analyse: Fabrikasjon, System Setup, og drift

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Dyrking av pattedyrceller med en enkelt-bruk Pneumatisk Bioreaktor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier av lungekreft celler ved hjelp av en Multichannel Dual-elektrisk-felt microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A Novel bioreaktor for High Density Dyrking av Diverse mikrobielle samfunn

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design og implementering av en automatisert Illuminating, dyrking, og Sampling System for Microbial optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Montering og sporing av mikrobiel samfunnsutvikling innenfor en Microwell Array-plattform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Prospektering mikrobiell stammer for Bioremediering og probiotika utvikling for Metaorganism forskning og bevaring

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Prosessoptimalisering ved hjelp av høy gjennomstrømning automatiserte mikrobioreaktorer i kinesisk hamster eggstokk celle dyrking

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Generere kontrollerte, dynamiske kjemiske landskap for å studere mikrobiell atferd

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Høy-gjennomstrømning identifikasjon av motstand mot Pseudomonas syringae pv. Tomat i tomat ved hjelp av frøplanteflomanalyse

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...