Name: automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)
Uploaded: 2022-02-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC at JoVE.com

Este estudo foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2018YFA0901500), o Projeto Nacional de Instrumentos e Equipamentos Científicos da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (21627812) e o Programa de Pesquisa Científica da Iniciativa Universitária de Tsinghua (20161080108). Agradecemos também à Profª Julia A. Vorholt (Instituto de Microbiologia, Departamento de Biologia, ETH Zurique, Zurique 8093, Suíça) pelo fornecimento da cepa E. coli 2.2 (MeSV2.2).

1. Instalação de instrumentos e software
<ol><li>Escolha um ambiente limpo e estéril (como um banco limpo) como um espaço permanente dedicado para mmc. Instale o MMC de forma constante no espaço. NOTA: Mantenha o MMC longe da interferência de fortes campos elétricos, campos magnéticos e fortes fontes de radiação térmica. Evite que vibrações severas afetem os componentes de detecção óptica. Fornecer a fonte de alimentação de AC220 V, 50 HZ para o MMC. Para obter detalhes sobre o MMC...

<ol>
	<li>Lewis, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms.">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li><li>Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. 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S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+adaptation+in+microdroplet+chemostats.">Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).</li><li>Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+droplet-based+microfluidic+platform+for+multiplexed+analysis+of+biochemical+markers+in+small+volumes.">Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes.</a> Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).</li><li>Watterson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+high-throughput+cultivation+for+accurate+screening+of+antibiotic+resistant+gut+microbes.">Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes.</a> eLife. 9, 56998 (2020).</li><li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactants+in+droplet-based+microfluidics.">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li><li>Nitschke, M., Pastore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+properties+of+a+surfactant+obtained+from+Bacillus+subtilis+grown+on+cassava+wastewater.">Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater.</a> Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).</li><li>Jiang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+biofuels+and+biochemicals+production+from+sustainable+resources+using+co-cultivation+systems.">Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems.</a> Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).</li></ol>

Este protocolo apresenta como usar o sistema microbiano de cultura de microdroplet (MMC) para realizar o cultivo microbiano automatizado e a evolução adaptativa a longo prazo. MMC é um sistema de cultivo microbiano miniaturizado, automatizado e de alto rendimento. Em comparação com métodos e instrumentos convencionais de cultivo de alto rendimento microbiano, o MMC tem muitas vantagens, como baixo consumo de mão-de-obra e reagente, operação simples, detecção on-line (DCE e fluorescência), coleta de dados de a...

O cultivo microbiano é uma importante base para pesquisas científicas microbiológicas e aplicações industriais, amplamente utilizadas no isolamento, identificação, reconstrução, triagem e evolução dos microrganismos 1,2,3. Os métodos convencionais de cultivo de microbianos usam principalmente tubos de ensaio, frascos de shake e placas sólidas como recipientes de cultivo, combinados com incubadoras de agitação, espectrofotômetros, leitores de microplaca e outros equipamentos para cultivo, detecção e triagem de microbianas. No entanto, esses métodos têm muitos problemas, como operações complicadas, baixo rendimento, baixa eficiência e grande consumo de mão-de-obra e reagentes. Os métodos de cultivo de alto rendimento desenvolvidos nos últimos anos são baseados principalmente na microplaca. Mas a microplacão tem um baixo nível de oxigênio dissolvido, má mistura de propriedade, e evaporação severa e efeito térmico, que muitas vezes levam a um baixo status de crescimento e paraleloização de experimentos de microrganismos 4,5,6,7; por outro lado, ele precisa ser equipado com equipamentos caros, como estações de trabalho de manuseio líquido e leitores de microplaca, para alcançar o cultivo automatizado e detecção de processos 8,9.
Como um importante ramo da tecnologia microfluidica, os microfluidos de gotículas foram desenvolvidos nos últimos anos com base em sistemas microfluidos tradicionais de fluxo contínuo. É uma tecnologia microfluida de fluxo discreto que usa duas fases líquidas imiscíveis (geralmente óleo-água) para gerar micro-gotículas dispersas e operá-las10. Como as micro-gotículas têm as características de pequeno volume, grande área de superfície específica, alta taxa interna de transferência de massa e nenhuma contaminação cruzada causada pela compartimentação, e as vantagens da forte controlabilidade e alto rendimento de gotículas, houve muitos tipos de pesquisa aplicando tecnologia microfluidica gotícula no cultivo de alto rendimento, triagem e evolução dos microrganismos11 . No entanto, ainda há uma série de questões-chave para tornar a tecnologia microfluidica gotícula popularizada e amplamente aplicada. Em primeiro lugar, o funcionamento de microfluidos de gotículas é complicado e intrincado, resultando em altos requisitos técnicos para os operadores. Em segundo lugar, a tecnologia microfluidica de gotículas combina componentes ópticos, mecânicos e elétricos e precisa estar associada a cenários de aplicação de biotecnologia. É difícil para um único laboratório ou equipe construir sistemas eficientes de controle microfluídico gotícula se não houver colaboração multidisciplinar. Em terceiro lugar, por conta do pequeno volume de micro-gotículas (do picoliter (pL) ao microliter (μL),é preciso muita dificuldade para realizar o controle automatizado preciso e a detecção on-line em tempo real de gotículas para algumas operações microbianas básicas, como subculto, triagem e amostragem, e também é difícil construir um sistema de equipamento integrado12.
Para resolver os problemas acima, um sistema automático de Microdroplet Culture (MMC) foi desenvolvido com sucesso com base na tecnologia microfluídicagotícula 13. O MMC consiste em quatro módulos funcionais: um módulo de reconhecimento de gotículas, um módulo de detecção de espectro de gotículas, um módulo de chip microfluido e um módulo de amostragem. Através da integração e controle do sistema de todos os módulos, o sistema de operação automatizado inclui a geração, cultivo, medição (densidade óptica (OD) e fluorescência), divisão, fusão, classificação de gotículas é precisamente estabelecida, alcançando a integração de funções como inoculação, cultivo, monitoramento, subculonça, triagem e amostragem exigidas pelo processo de cultivo de gotículas microbianas. O MMC pode conter até 200 unidades de cultivo de gotículas de réplica de volume de 2-3 μL, o que equivale a 200 unidades de cultivo de frascos de shake. O sistema de cultivo de micro-gotículas pode satisfazer os requisitos de não contaminação, oxigênio dissolvido, mistura e troca de massa-energia durante o crescimento de microrganismos, e atender às várias necessidades de pesquisa microbiana através de múltiplas funções integradas, por exemplo, medição da curva de crescimento, evolução adaptativa, análise e análise metabólica de fator único (baseada na detecção e análise de fluorescência)13,14.
Aqui, o protocolo introduz como usar o MMC para realizar o cultivo automatizado e microbiano e a evolução adaptativa em detalhes (Figura 1). Tomamos escherichia coli (E. coli) MG1655 como exemplo para demonstrar a medição da curva de crescimento e uma cepa E. coli essencial de metanol MeSV2.215 para demonstrar a evolução adaptativa no MMC. Foi desenvolvido um software de operação para MMC, o que torna a operação muito simples e clara. Em todo o processo, o usuário precisa preparar a solução inicial de bactérias, definir as condições do MMC e, em seguida, injetar a solução de bactérias e reagentes relacionados no MMC. Posteriormente, o MMC executará automaticamente operações como geração de gotículas, reconhecimento e numeração, cultivo e evolução adaptativa. Ele também executará a detecção on-line (OD e fluorescência) das gotículas com resolução de alto tempo e exibirá os dados relacionados (que podem ser exportados) no software. O operador pode parar o processo de cultivo a qualquer momento de acordo com os resultados e extrair as gotículas-alvo para experimentos subsequentes. O MMC é fácil de operar, consome menos mão-de-obra e reagentes, e tem rendimento experimental relativamente alto e boa paraleloidade de dados, que tem vantagens significativas em comparação com os métodos convencionais de cultivo. Fornece uma plataforma experimental de baixo custo, amigável à operação e robusta para os pesquisadores realizarem pesquisas microbianas relacionadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m PVDF filter membrane</td>
			<td>Merck Millipore Ltd.</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Sterilize the MMC oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-289BSW</td>
			<td>For reagent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>For solid plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20011160</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.</td>
			<td>DL-CJ-INDII</td>
			<td>For aseptic operation and UV sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10007216</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>E450</td>
			<td>Software installation and MMC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Shanghai qixin scientific instrument co., LTD</td>
			<td>LRH 250</td>
			<td>For the microbial cultivation using solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>AR 3130</td>
			<td>For reagent weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>For droplet collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10011928</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>2.0 mL</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2054</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G66258A</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Pressure Steam Sterilization Pot</td>
			<td>SANYO Electric</td>
			<td>MLS3020</td>
			<td>For autoclaved sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>420322</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>P815661</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>M813895</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>BIOBYING</td>
			<td>1305715</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial Microdroplet Culture System (MMC)</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;MMC-I</td>
			<td>Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&#38;id=110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-ALE-OD</td>
			<td>For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC oil</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-M/S-OD</td>
			<td>The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20026118</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G81793J</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G10267B</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10001518</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>90 mm</td>
			<td>For the preparation of solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>2.5 &#956;L, 10 &#956;L, 100&#956;L, 1000&#956;L</td>
			<td>For liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick connector A</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent bottle</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-PCB</td>
			<td>Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flask</td>
			<td>Union-Biotech</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>For microbial cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.</td>
			<td>SKY-210 2B</td>
			<td>For the microbial cultivation in shake flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8290</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>Draw liquid and inject it into the reagent bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>OUBEL Hardware Store</td>
			<td>22G</td>
			<td>Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature refrigerator</td>
			<td>SANYO Ultra-low</td>
			<td>MDF-U4086S</td>
			<td>For strain preservation (-80 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV&#8211;Vis spectrophotometer</td>
			<td>General Electric Company</td>
			<td>Ultrospec 3100 pro</td>
			<td>For the measurement of OD values</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SV8080</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)

Os métodos convencionais de cultivo microbiano geralmente têm operações complicadas, baixo rendimento, baixa eficiência e grande consumo de mão-de-obra e reagentes. Além disso, os métodos de cultivo de alto rendimento baseados em microplaca desenvolvidos nos últimos anos têm baixo status de crescimento microbiano e paraleloização de experimentos devido ao seu baixo oxigênio dissolvido, mistura pobre e evaporação severa e efeito térmico. Devido a muitas vantagens das micro-gotículas, como pequeno volume, alto rendimento e forte controlabilidade, a tecnologia microfluidica baseada em gotículas pode superar esses problemas, que tem sido usado em muitos tipos de pesquisa de cultivo microbiano de alto rendimento, triagem e evolução. No entanto, a maioria dos estudos anteriores permanece na fase de construção e aplicação laboratorial. Algumas questões-chave, como altos requisitos operacionais, alta dificuldade de construção e falta de tecnologia de integração automatizada, restringem a ampla aplicação da tecnologia microfluidica gotícula em pesquisa microbiana. Aqui, um sistema automatizado de Microdroplet Culture (MMC) foi desenvolvido com sucesso com base na tecnologia microfluida de gotículas, alcançando a integração de funções como inoculação, cultivo, monitoramento on-line, subculo, classificação e amostragem exigidas pelo processo de cultivo de gotículas microbianas. Neste protocolo, escherichia coli (E. coli) MG1655 e uma cepa E. coli (MeSV2.2) de tipo selvagem foram tomadas como exemplos para introduzir como usar o MMC para realizar o cultivo microbiano automatizado e relativamente de alto rendimento e a evolução adaptativa em detalhes. Este método é fácil de operar, consome menos mão-de-obra e reagentes, e tem alto rendimento experimental e boa paraleloidade de dados, o que tem grandes vantagens em comparação com os métodos convencionais de cultivo. Fornece uma plataforma experimental de baixo custo, amigável à operação e confiável para pesquisadores científicos realizarem pesquisas microbianas relacionadas.

Este protocolo usa e. coli MG1655 e uma cepa MeSV2.2 como exemplos para demonstrar o cultivo microbiano e a evolução adaptativa essencial do metanol com uma estratégia automatizada e relativamente alta no MMC. A medição da curva de crescimento foi utilizada principalmente para caracterizar o cultivo microbiano. A evolução adaptativa foi conduzida pelo subculto contínuo automatizado e adicionando uma alta concentração de metanol como pressão seletiva durante cada subculto. Se a evolução adaptativa fo...

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Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC

Este protocolo descreve como usar o sistema microbiano de cultura de microdroplet (MMC) para realizar o cultivo microbiano automatizado e a evolução adaptativa. A MMC pode cultivar e subsu cultivar microrganismos automaticamente e continuamente e monitorar on-line seu crescimento com rendimento relativamente alto e boa paraleloização, reduzindo o consumo de mão-de-obra e reagente.

Cultivo Microbiano Automatizado e Evolução Adaptativa usando Sistema de Cultura microbiana de microdroplet (MMC)

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and ...

Este método pode ajudar a resolver os problemas com os métodos convencionais de cultivo microbiano. Fornece uma plataforma experimental de baixo custo, amigável à operação e confiável para cultivo microbiano automatizado e evolução adaptativa. Essa tecnologia automatiza as operações e reduz o consumo de mão-de-obra.E, ao mesmo tempo, tem bom desempenho cultural com resultados confiáveis e operações simples. A tecnologia é utilizada principalmente nos campos de pesquisa de microbiologia, como medição da curva de crescimento, evolução adaptável do laboratório e uma análise multinúvora de um único fator. Inicie os preparativos do experimento conectando a agulha da seringa com um diâmetro interno de 0,41 milímetros e um diâmetro externo de 0,71 milímetros a um conector rápido A e uma garrafa de reagente.Em seguida, autoclave todo o equipamento a 121 graus Celsius por 15 minutos. Para instalar o chip microfluido, abra a porta da câmara de operação e levante a sonda de fibra óptica. Depois de alinhar os orifícios do campo elétrico com as agulhas, coloque suavemente o chip no pedestal do chip, em seguida, insira as duas colunas de posicionamento nos orifícios de posicionamento e coloque a sonda de fibra óptica.Em seguida, conecte o conector rápido A no chip à porta correspondente do sistema de cultura microbiana de microdroplet ou MMC de acordo com o número de posição descrito no manuscrito. Quando terminar, feche a porta da câmara de operação. Diluir a suspensa Escherichia coli MG1655 cultivada com o médio para um OD600 de 0,05 a 0,1 para obter 10 mililitros de solução inicial de bactérias.Para inicializar o MMC, clique na guia Inicialização. Quando a interface de inicialização aparecer, defina a temperatura de cultivo como 37 graus Celsius e o valor do sinal fotoelétrico como 0,6. A inicialização levará cerca de 20 minutos.Mais tarde, coloque uma garrafa de reagente esterilizada no banco limpo e aperte a tampa. Use uma seringa estéril de 10 mililitros para injetar de três a cinco mililitros de óleo MMC da agulha de seringa ao tubo lateral na garrafa de reagente. Em seguida, incline e gire a garrafa de reagente lentamente para fazer o óleo se infiltrar totalmente na parede interna.Depois de injetar cinco mililitros de uma solução de bactérias iniciais no frasco, encha a garrafa de reagente injetando de cinco a sete mililitros do óleo MMC. Retire o conector rápido independente A da garrafa de reagente e insira o conector rápido A no conector rápido B da garrafa para completar a operação de injeção de amostra. Uma vez feito, abra a porta da câmara de operação para colocar a garrafa de reagente no banho de metal.Retire o conector C2 do chip e o conector rápido A da garrafa de reagente. Conecte o conector do tubo lateral da garrafa de reagente ao conector C2 e ao conector superior do tubo ao conector O2. Então feche a porta da câmara de operação.Para escolher a função de medição da curva de crescimento, clique na Curva de Crescimento na interface de configuração do parâmetro inserindo o número como 15. Em seguida, ligue o interruptor de detecção de OD e defina o comprimento de onda como 600 nanômetros. Clique na guia Iniciar para iniciar a geração de gotículas.O processo levará 15 minutos para ser concluído. Quando uma janela pop-up aparecer na interface principal, solicitando uma mensagem, abra a porta da câmara de operação para retirar a garrafa de reagente e conectar os conectores C2 e O2. Depois de fechar a porta, clique no botão OK na janela pop-up para cultivar automaticamente as gotículas e detectar os valores de OD.À medida que a curva de crescimento chega à fase estacionária, clique no botão Exportação de dados para exportar os dados OD. Selecione o caminho de salvamento de dados e exporte o valor de OD registrado durante o período de cultivo no formato CVS Para traçar a curva de crescimento, use softwares de mapeamento como Excel e Origin 9.0. Injete volumes necessários da solução inicial de bactérias, meio fresco e óleo MMC nas garrafas de reagente esterilizada separada para a solução inicial de bactérias no meio fresco, como explicado anteriormente.Para escolher a função de evolução adaptativa, clique em ALE no software. Na interface de configuração do parâmetro, ligue o interruptor de detecção de OD e, em seguida, defina todos os parâmetros descritos no manuscrito e clique na guia Iniciar para iniciar a geração de gotículas. O processo levará cerca de 25 minutos.Durante cada período de subculto, observe se os valores máximos de OD das gotículas aumentaram significativamente. Se o aumento ocorrer e atender aos requisitos do experimento, clique no botão de exportação de dados para exportar os dados OD. Para extrair as gotículas de destino do MMC, clique na guia de triagem para selecionar a função de extração de gotículas.Em seguida, escolha a opção Coletar e clique nos números de gotículas de destino. Quando terminar, clique em OK. Espere pela janela pop-up solicitando uma mensagem. Em seguida, coloque o conector rápido CF no tubo de microcentrifuuge para coleta e clique em OK. Depois de um a dois minutos, quando a interface de software aparecerá uma nova janela solicitando uma mensagem, insira o conector rápido CF de volta e clique em OK para fazer o MMC continuar a ser executado.Quando a gota de destino seguinte atingir o site de reconhecimento de gotículas, colete-a conforme especificado anteriormente. Use uma pipeta de 2,5 microliteres para retirar e coloque a gotícula em uma placa sólida de 90 milímetros, seguida por espalhar a gota uniformemente com uma haste revestida triangular de vidro com um comprimento lateral de três centímetros, em seguida, cultivar a queda em uma incubadora de temperatura constante de 37 graus Celsius por 72 horas. Mais tarde, escolha de três a cinco colônias independentes de bactérias para cultivar cada colônia separadamente em um frasco de 50 mililitros com 10 mililitros de meio fresco em uma incubadora de agitação a 200 rotações por minuto e 37 graus Celsius por 48 a 72 horas.Após a incubação, siga as normas padrão relacionadas para armazenar a solução de bactérias cultivadas no tubo de glicerol. A análise representativa mostra as curvas de crescimento de 50 gotículas em todo o processo de evolução adaptativa. Observou-se que a cepa Escherichia coli essencial de metanol ou MeSV2.2 apresentou crescimento lento inicial seguido de rápido crescimento.A curva de crescimento da gotícula seis em todo o processo de evolução adaptativa foi traçada separadamente. O valor máximo de OD600 na primeira geração foi de 0,37, que aumentou para 0,58 no último período de subculto, indicando que a cepa na gotícula seis percebeu uma evolução adaptativa óbvia. Além disso, foram comparadas as curvas de crescimento da cepa de seis gotas e a cepa inicial.A cepa de seis gotas apresentou uma taxa de crescimento máximo específica mais alta e concentração celular na fase estacionária do que a cepa inicial. O mais importante é garantir que a conexão do chip de instrumento e do frasco de reagente esteja correta, que são as gotículas para que as operações prossigam normalmente. Este método fornece aos pesquisadores uma nova ideia para o cultivo de microrganismos e também fornece plataforma eficiente e de baixo custo para a evolução adaptativa das cepas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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