Name: automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)
Uploaded: 2022-02-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC at JoVE.com

Это исследование было поддержано Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2018YFA0901500), Национальным проектом ключевых научных приборов и оборудования Национального фонда естественных наук Китая (21627812) и Программой научных исследований Инициативы Университета Цинхуа (20161080108). Мы также благодарим профессора Юлию А. Ворхольт (Институт микробиологии, департамент биологии, ETH Zurich, Zurich 8093, Швейцария) за предоставление метанол-эссенциального штамма E. coli версии 2.2 (MeSV2.2).

1. Установка приборов и программного обеспечения
<ol><li>Выберите чистую и стерильную среду (например, чистую скамейку) в качестве выделенного постоянного пространства для MMC. Установите MMC стабильно в пространстве. ПРИМЕЧАНИЕ: Держите MMC подальше от помех сильных электрических...

<ol>
	<li>Lewis, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms.">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li><li>Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+technology+in+industrial+biotechnology.">High-throughput screening technology in industrial biotechnology.</a> Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).</li><li>Kim, J., Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+analysis+for+the+optimization+of+Campylobacter+isolation+from+chicken+carcasses+using+selective+media.">Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).</li><li>Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microscale+processing+technologies+for+quantification+of+biocatalytic+Baeyer-Villiger+oxidation+kinetics.">The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).</li><li>Harms, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+a+24-station+high+throughput+microbioreactor.">Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).</li><li>Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-four+well+plate+miniature+bioreactor+system+as+a+scale-down+model+for+cell+culture+process+development.">Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo-Lector+-+a+novel+platform+for+automated+high-throughput+cultivations+in+microtiter+plates+with+high+information+content.">Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content.</a> Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+a+kinetics+analysis+of+the+high-pressure+inactivation+of+microorganisms+using+microplates.">High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).</li><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics.">Droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li><li>Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+microbiology:+techniques,+applications+and+challenges.">Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).</li><li>Liao, P. Y., Huang, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divide+and+conquer:+analytical+chemistry+of+nucleic+acids+in+droplets.">Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets.</a> Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).</li><li>Jian, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+microdroplet+culture+system+(MMC):+An+integrated+platform+for+automated,+high-throughput+microbial+cultivation+and+adaptive+evolution.">Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).</li><li>Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empowering+a+methanol-dependent+Escherichia+coli+via+adaptive+evolution+using+a+high-throughput+microbial+microdroplet+culture+system.">Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).</li><li>Meyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-essential+growth+of+Escherichia+coli.">Methanol-essential growth of Escherichia coli.</a> Nature Communications. 9, 1508 (2018).</li><li>Gru&#776;nberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+growth+rate+0.6:+Corynebacterium+glutamicum+cultivated+in+highly+diluted+environments.">Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).</li><li>Kaganovitch, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+single-cell+analysis+in+picoliter-sized+batch+cultivation+chambers.">Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers.</a> New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).</li><li>Baraban, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millifluidic+droplet+analyser+for+microbiology.">Millifluidic droplet analyser for microbiology.</a> Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).</li><li>Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+adaptation+in+microdroplet+chemostats.">Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).</li><li>Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+droplet-based+microfluidic+platform+for+multiplexed+analysis+of+biochemical+markers+in+small+volumes.">Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes.</a> Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).</li><li>Watterson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+high-throughput+cultivation+for+accurate+screening+of+antibiotic+resistant+gut+microbes.">Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes.</a> eLife. 9, 56998 (2020).</li><li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactants+in+droplet-based+microfluidics.">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li><li>Nitschke, M., Pastore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+properties+of+a+surfactant+obtained+from+Bacillus+subtilis+grown+on+cassava+wastewater.">Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater.</a> Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).</li><li>Jiang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+biofuels+and+biochemicals+production+from+sustainable+resources+using+co-cultivation+systems.">Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems.</a> Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).</li></ol>

В этом протоколе представлено, как использовать систему микробной микробной культуры (MMC) для выполнения автоматизированного культивирования микробов и долгосрочной адаптивной эволюции. MMC представляет собой миниатюрную, автоматизированную и высокопроизводительную систему культив?...

Культивирование микроорганизмов является важной основой для микробиологических научных исследований и промышленного применения, которое широко используется в выделении, идентификации, реконструкции, скрининге и эволюции микроорганизмов 1,2,3. Обычные методы культивирования микробов в основном используют пробирки, колбы для встряхивания и твердые пластины в качестве контейнеров для культивирования в сочетании с встряхивающими инкубаторами, спектрофотометрами, считывателями микропластин и другим оборудованием для культивирования, обнаружения и скрининга микробов. Однако эти методы имеют много проблем, таких как громоздкие операции, низкая пропускная способность, низкая эффективность и большое потребление труда и реагентов. Высокопроизводительные методы культивирования, разработанные в последние годы, в основном основаны на микропластине. Но микропластина имеет низкий уровень растворенного кислорода, плохие перемешивающие свойства, а также сильное испарение и тепловое воздействие, которые часто приводят к плохому состоянию роста и экспериментальному распараллеливанию микроорганизмов 4,5,6,7; с другой стороны, он должен быть оснащен дорогостоящим оборудованием, таким как рабочие станции для обработки жидкостей и считыватели микропластин, для достижения автоматизированного выращивания и обнаружения процессов 8,9.
Как важная отрасль микрофлюидной технологии, капельная микрофлюидика была разработана в последние годы на основе традиционных микрофлюидных систем непрерывного потока. Это дискретная проточная микрофлюидная технология, которая использует две несмешивающиеся жидкие фазы (обычно масло-вода) для генерации дисперсных микрокапелей и работы на них10. Поскольку микрокапли имеют характеристики малого объема, большой удельной площади поверхности, высокой внутренней скорости массопереноса и отсутствия перекрестного загрязнения, вызванного компартментализацией, а также преимущества сильной управляемости и высокой пропускной способности капель, было проведено много видов исследований с применением микрофлюидной технологии капель в высокопроизводительном культивировании, скрининге и эволюции микроорганизмов11 . Тем не менее, все еще существует ряд ключевых проблем, чтобы сделать микрофлюидную технологию капель популяризированной и широко применяемой. Во-первых, работа капельной микрофлюидики громоздка и сложна, что приводит к высоким техническим требованиям к операторам. Во-вторых, капельная микрофлюидная технология сочетает в себе оптические, механические и электрические компоненты и должна быть связана со сценариями применения биотехнологии. Одной лаборатории или команде трудно построить эффективные системы микрофлюидного контроля капель, если нет междисциплинарного сотрудничества. В-третьих, из-за небольшого объема микрокапли (от пиколитра (pL) до микролитра (μL)) требуется много трудностей для реализации точного автоматизированного управления и онлайн-обнаружения капель в режиме реального времени для некоторых основных микробных операций, таких как субкультуризация, сортировка и отбор проб, а также трудно построить интегрированную систему оборудования12.
Для решения вышеуказанных проблем была успешно разработана автоматическая система микробной микрокапельной культуры (MMC) на основе капельной микрофлюидной технологии13. MMC состоит из четырех функциональных модулей: модуля распознавания капель, модуля обнаружения спектра капель, модуля микрофлюидного чипа и модуля выборки. Благодаря системной интеграции и управлению всеми модулями точно устанавливается автоматизированная система управления, включая генерацию, культивирование, измерение (оптическая плотность (OD) и флуоресценция), расщепление, слияние, сортировку капель, достигая интеграции таких функций, как посев, культивирование, мониторинг, субкультурирование, сортировка и отбор проб, необходимые для процесса выращивания микробных капель. MMC может вмещать до 200 реплицированных единиц выращивания капель объемом 2-3 мкл, что эквивалентно 200 единицам культивирования колбы. Система культивирования микрокаплет может удовлетворять требованиям к незагрязнению, растворенному кислороду, смешиванию и массо-энергетическому обмену во время роста микроорганизмов и удовлетворять различные потребности микробных исследований с помощью многочисленных интегрированных функций, например, измерения кривой роста, адаптивной эволюции, однофакторного многоуровневого анализа и исследования и анализа метаболитов (на основе обнаружения флуоресценции)13,14.
Здесь протокол подробно описывает, как использовать MMC для проведения автоматизированного и микробного культивирования и адаптивной эволюции (рисунок 1). Мы взяли кишечную палочку дикого типа (E. coli) MG1655 в качестве примера, чтобы продемонстрировать измерение кривой роста и метанол-эссенциальный штамм E. coli MeSV2.215, чтобы продемонстрировать адаптивную эволюцию в MMC. Было разработано операционное программное обеспечение для MMC, которое делает операцию очень простой и понятной. Во всем процессе пользователю необходимо приготовить исходный раствор бактерий, установить условия MMC, а затем ввести раствор бактерий и связанные с ним реагенты в MMC. Впоследствии MMC будет автоматически выполнять такие операции, как генерация капель, распознавание и нумерация, культивирование и адаптивная эволюция. Он также будет выполнять онлайн-обнаружение (OD и флуоресценция) капель с высоким временным разрешением и отображать соответствующие данные (которые могут быть экспортированы) в программном обеспечении. Оператор может остановить процесс культивирования в любое время в соответствии с результатами и извлечь целевые капли для последующих экспериментов. MMC прост в эксплуатации, потребляет меньше труда и реагентов, а также имеет относительно высокую экспериментальную пропускную способность и хорошую параллель данных, что имеет значительные преимущества по сравнению с обычными методами культивирования. Он обеспечивает недорогую, удобную в эксплуатации и надежную экспериментальную платформу для исследователей для проведения соответствующих микробных исследований.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m PVDF filter membrane</td>
			<td>Merck Millipore Ltd.</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Sterilize the MMC oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-289BSW</td>
			<td>For reagent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>For solid plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20011160</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.</td>
			<td>DL-CJ-INDII</td>
			<td>For aseptic operation and UV sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10007216</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>E450</td>
			<td>Software installation and MMC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Shanghai qixin scientific instrument co., LTD</td>
			<td>LRH 250</td>
			<td>For the microbial cultivation using solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>AR 3130</td>
			<td>For reagent weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>For droplet collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10011928</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>2.0 mL</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2054</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G66258A</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Pressure Steam Sterilization Pot</td>
			<td>SANYO Electric</td>
			<td>MLS3020</td>
			<td>For autoclaved sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>420322</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>P815661</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>M813895</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>BIOBYING</td>
			<td>1305715</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial Microdroplet Culture System (MMC)</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;MMC-I</td>
			<td>Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&#38;id=110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-ALE-OD</td>
			<td>For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC oil</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-M/S-OD</td>
			<td>The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20026118</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G81793J</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G10267B</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10001518</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>90 mm</td>
			<td>For the preparation of solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>2.5 &#956;L, 10 &#956;L, 100&#956;L, 1000&#956;L</td>
			<td>For liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick connector A</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent bottle</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-PCB</td>
			<td>Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flask</td>
			<td>Union-Biotech</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>For microbial cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.</td>
			<td>SKY-210 2B</td>
			<td>For the microbial cultivation in shake flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8290</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>Draw liquid and inject it into the reagent bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>OUBEL Hardware Store</td>
			<td>22G</td>
			<td>Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature refrigerator</td>
			<td>SANYO Ultra-low</td>
			<td>MDF-U4086S</td>
			<td>For strain preservation (-80 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV&#8211;Vis spectrophotometer</td>
			<td>General Electric Company</td>
			<td>Ultrospec 3100 pro</td>
			<td>For the measurement of OD values</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SV8080</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)

Обычные методы культивирования микробов обычно имеют громоздкие операции, низкую пропускную способность, низкую эффективность и большое потребление труда и реагентов. Кроме того, высокопроизводительные методы культивирования на основе микропластин, разработанные в последние годы, имеют плохой статус роста микробов и распараллеливание эксперимента из-за их низкого содержания растворенного кислорода, плохой смеси и сильного испарения и теплового эффекта. Благодаря многим преимуществам микрокапелей, таким как небольшой объем, высокая пропускная способность и сильная управляемость, микрофлюидная технология на основе капель может преодолеть эти проблемы, которая использовалась во многих видах исследований высокопроизводительного микробного культивирования, скрининга и эволюции. Однако большинство предшествующих исследований остаются на стадии лабораторного строительства и применения. Некоторые ключевые проблемы, такие как высокие эксплуатационные требования, высокая сложность строительства и отсутствие технологии автоматизированной интеграции, ограничивают широкое применение капельной микрофлюидной технологии в микробных исследованиях. Здесь была успешно разработана автоматизированная система микробной микробной культуры (MMC) на основе капельной микрофлюидной технологии, обеспечивающая интеграцию таких функций, как посев, культивирование, онлайн-мониторинг, субкультурирование, сортировка и отбор проб, необходимые для процесса культивирования микробных капель. В этом протоколе в качестве примеров были взяты Escherichia coli дикого типа (E. coli) MG1655 и метанол-эссенциальный штамм E. coli (MeSV2.2), чтобы представить, как использовать MMC для проведения автоматизированного и относительно высокопроизводительного микробного культивирования и адаптивной эволюции в деталях. Этот метод прост в эксплуатации, потребляет меньше труда и реагентов, а также имеет высокую экспериментальную пропускную способность и хорошую параллельность данных, что имеет большие преимущества по сравнению с обычными методами культивирования. Он обеспечивает недорогую, удобную в эксплуатации и надежную экспериментальную платформу для научных исследователей для проведения соответствующих микробных исследований.

Этот протокол использует E. coli MG1655 и штамм MeSV2.2 в качестве примеров для демонстрации культивирования микробов и адаптивной эволюции, необходимой для метанола, с автоматизированной и относительно высокой пропускной способностью в MMC. Измерение кривой роста в основном использовалос...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC at JoVE.com

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC

Этот протокол описывает, как использовать систему микробной микробной культуры (MMC) для проведения автоматизированного культивирования микробов и адаптивной эволюции. MMC может культивировать и субкультурировать микроорганизмы автоматически и непрерывно и отслеживать их рост в режиме онлайн с относительно высокой пропускной способностью и хорошим распараллеливанием, снижая потребление труда и реагентов.

Автоматизированное культивирование микробов и адаптивная эволюция с использованием системы микробной микробной культуры (MMC)

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and ...

Этот метод может помочь решить проблемы с обычными методами выращивания микробов. Он обеспечивает недорогую, удобную в эксплуатации и надежную экспериментальную платформу для автоматизированного культивирования микробов и адаптивной эволюции. Эта технология автоматизирует операции и больше снижает трудозатраты.И в то же время он имеет хорошую культуру производительности с надежными результатами и простыми операциями. Технология в основном используется в областях микробиологических исследований, таких как измерение кривой роста, адаптивная лабораторная эволюция и однофакторный многоуровневый анализ. Начинают подготовку эксперимента с подключения шприцевой иглы с внутренним диаметром 0,41 миллиметра и наружным диаметром 0,71 миллиметра к быстрому разъему А и флакону с реагентом.Затем автоклавируйте все оборудование при 121 градусе Цельсия в течение 15 минут. Чтобы установить микрофлюидный чип, откройте дверцу операционной камеры и поднимите оптоволоконный зонд. После выравнивания отверстий электрического поля с помощью игл осторожно поместите чип на пьедестал чипа, затем вставьте две позиционирующие колонны в позиционирующие отверстия и опустите оптический волоконный зонд.Затем подключите быстрый разъем A на чипе к соответствующему порту микробной системы микрокаплетной культуры или MMC в соответствии с номером положения, как описано в рукописи. Когда все будет готово, закройте дверцу операционной камеры. Культивируемую кишечную палочку MG1655 разбавляют со средой до OD600 от 0,05 до 0,1 до получения 10 миллилитров исходного раствора бактерий.Чтобы инициализировать консоль MMC, перейдите на вкладку Инициализация. Когда появится интерфейс инициализации, установите температуру культивирования как 37 градусов Цельсия, а значение фотоэлектрического сигнала как 0,6. Инициализация займет около 20 минут.Позже поместите стерилизованную бутылку с реагентом на чистую скамейку и затяните крышку. Используйте 10-миллилитровый стерильный шприц, чтобы ввести от трех до пяти миллилитров масла MMC из иглы шприца в боковую трубку в бутылку с реагентом. Затем наклоните и медленно поверните бутылку с реагентом, чтобы масло полностью проникло во внутреннюю стенку.После введения пяти миллилитров исходного раствора бактерий в бутылку заполните флакон с реагентом, введя пять-семь миллилитров масла MMC. Вытащите независимый быстрый соединитель A бутылки с реагентом и вставьте быстрый соединитель A в быстрый разъем B бутылки для завершения операции впрыска образца. После этого откройте дверцу операционной камеры, чтобы поместить бутылку с реагентом в металлическую ванну.Вытащите разъем C2 чипа и быстрый разъем A бутылки с реагентом. Подключите разъем боковой трубки бутылки реагента к разъему C2, а соединитель верхней трубки к разъему O2. Затем закройте дверцу операционной камеры.Чтобы выбрать функцию измерения кривой роста, нажмите на Кривая роста в интерфейсе настройки параметров, введите число как 15. Затем включите переключатель обнаружения OD и установите длину волны 600 нанометров. Нажмите на вкладку Пуск, чтобы начать генерацию дроплетов.Процесс займет 15 минут. Когда на главном интерфейсе появится всплывающее окно с запросом сообщения, откройте дверцу операционной камеры, чтобы вынуть бутылку с реагентом и подключить разъемы C2 и O2. После закрытия двери нажмите кнопку OK во всплывающем окне, чтобы автоматически культивировать капли и обнаружить значения OD.Когда кривая роста достигнет стационарной фазы, нажмите кнопку «Экспорт данных», чтобы экспортировать данные OD. Выберите путь сохранения данных и экспортируйте значение OD, записанное за период культивирования, в формате CVS Чтобы построить кривую роста, используйте картографическое программное обеспечение, такое как Excel и Origin 9.0. Впрыскивайте необходимые объемы исходного раствора бактерий, свежей среды и масла MMC в отдельные стерилизованные флаконы с реагентами для исходного раствора бактерий в свежей среде, как объяснялось ранее.Чтобы выбрать функцию адаптивной эволюции, нажмите на ALE в программном обеспечении. В интерфейсе настройки параметров включите переключатель обнаружения OD, затем задайте все параметры, описанные в рукописи, и перейдите на вкладку Пуск, чтобы начать генерацию дроплетов. Процесс займет около 25 минут.В течение каждого периода субкультуры наблюдайте, значительно ли увеличились максимальные значения ОД капель. Если увеличение происходит и соответствует требованиям эксперимента, нажмите кнопку экспорта данных, чтобы экспортировать данные OD. Чтобы извлечь целевые капли из MMC, нажмите на вкладку скрининга, чтобы выбрать функцию извлечения капель.Затем выберите опцию Собрать и щелкните количество целевых капель. Когда все будет готово, нажмите OK. Дождитесь появления всплывающего окна с запросом сообщения. Затем поместите быстрый разъем CF в трубку микроцентрифуги для сбора и нажмите OK. Через одну-две минуты, когда в программном интерфейсе появится новое окно с запросом сообщения, вставьте быстрый соединитель CF обратно и нажмите OK, чтобы MMC продолжала работать.Когда следующая целевая капля достигнет сайта распознавания капель, соберите ее, как указано выше. Используйте 2,5-микролитровую пипетку, чтобы вынуть и поместить каплю на 90-миллиметровую твердую пластину, а затем равномерно распределить каплю стеклянным треугольным стержнем с боковым покрытием длиной три сантиметра, затем культивировать каплю в инкубаторе с постоянной температурой 37 градусов Цельсия в течение 72 часов. Позже выберите три-пять независимых колоний бактерий, чтобы культивировать каждую колонию отдельно в колбе с 50 миллилитрами свежей среды с 10 миллилитрами свежей среды в встряхивающем инкубаторе со скоростью 200 оборотов в минуту и 37 градусами Цельсия в течение 48-72 часов.После инкубации следуйте соответствующим стандартным правилам для хранения раствора культивируемых бактерий в глицериновой трубке. Репрезентативный анализ показывает кривые роста 50 капель во всем процессе адаптивной эволюции. Было отмечено, что штамм метанола Escherichia coli или MeSV2.2 демонстрировал первоначальный медленный рост, за которым следовал быстрый рост.Кривая роста шестой капли во всем процессе адаптивной эволюции была построена отдельно. Максимальное значение OD600 в первом поколении составляло 0,37, которое увеличилось до 0,58 в последний период субкультуры, что указывает на то, что штамм в капельной шестерке реализовал очевидную адаптивную эволюцию. Кроме того, сравнивались кривые роста штамма капли шесть и исходного штамма.Штамм капельной шестерки демонстрировал более высокую максимальную удельную скорость роста и концентрацию клеток в стационарной фазе, чем исходный штамм. Самое главное – убедиться, что соединение чипа инструмента и флакона с реагентом правильное, что является каплями для нормального протекания операций. Этот метод дает исследователям новую идею для культивирования микроорганизмов, а также обеспечивает эффективную и недорогую платформу для адаптивной эволюции штаммов.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC)

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Выращивание клетках млекопитающих с использованием одноразовых Пневматический биореактора системы

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Электротаксис Исследования клетки легких рака с использованием многоканального Dual-электрического поля микрофлюидных Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

Роман биореактор для высокой плотности Выращивание разнородных микробных сообществ

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Разработка и внедрение автоматизированной освещая, культивированием и система отбора проб для микробного оптогенетика приложений

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Сборка и отслеживание развития микробного сообщества в рамках платформы массивов микролистов

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Поиск микробных штаммов для биовосстановления и развития пробиотиков для исследования и сохранения метаорганизмов

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Оптимизация процесса с использованием высокой пропускной связи Автоматизированные микро-биореакторы в китайском Хомстер яичников культивирования клеток

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Создание контролируемых, динамических химических ландшафтов для изучения микробного поведения

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Высокопроходичная идентификация сопротивления Pseudomonas syringae pv. Помидор в томате с использованием рассеять рассаду наводнение

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...