Name: automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)
Uploaded: 2022-02-18T12:30:00
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Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2018YFA0901500), el Proyecto Nacional de Instrumentos y Equipos Científicos Clave de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (21627812) y el Programa de Investigación Científica de la Iniciativa de la Universidad de Tsinghua (20161080108). Julia A. Vorholt (Instituto de Microbiología, Departamento de Biología, ETH Zurich, Zurich 8093, Suiza) por el suministro de la cepa de E. coli esencial para metanol versión 2.2 (MeSV2.2).

1. Instalación de instrumentos y software
<ol><li>Elija un ambiente limpio y estéril (como un banco limpio) como un espacio permanente dedicado para MMC. Instale el MMC de forma constante en el espacio. NOTA: Mantenga el MMC alejado de la interferencia de campos eléctricos fuertes, campos magnéticos y fuentes de radiación de calor fuertes. Evite que las vibraciones severas afecten a los componentes de detección óptica. Proporcione la fuente de alimentación de AC220 V, 50 HZ al MMC. Para obte...

<ol>
	<li>Lewis, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms.">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li><li>Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. 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H., Zhang, C., Fei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empowering+a+methanol-dependent+Escherichia+coli+via+adaptive+evolution+using+a+high-throughput+microbial+microdroplet+culture+system.">Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).</li><li>Meyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-essential+growth+of+Escherichia+coli.">Methanol-essential growth of Escherichia coli.</a> Nature Communications. 9, 1508 (2018).</li><li>Gru&#776;nberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+growth+rate+0.6:+Corynebacterium+glutamicum+cultivated+in+highly+diluted+environments.">Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).</li><li>Kaganovitch, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+single-cell+analysis+in+picoliter-sized+batch+cultivation+chambers.">Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers.</a> New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).</li><li>Baraban, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millifluidic+droplet+analyser+for+microbiology.">Millifluidic droplet analyser for microbiology.</a> Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).</li><li>Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+adaptation+in+microdroplet+chemostats.">Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).</li><li>Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+droplet-based+microfluidic+platform+for+multiplexed+analysis+of+biochemical+markers+in+small+volumes.">Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes.</a> Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).</li><li>Watterson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+high-throughput+cultivation+for+accurate+screening+of+antibiotic+resistant+gut+microbes.">Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes.</a> eLife. 9, 56998 (2020).</li><li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactants+in+droplet-based+microfluidics.">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li><li>Nitschke, M., Pastore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+properties+of+a+surfactant+obtained+from+Bacillus+subtilis+grown+on+cassava+wastewater.">Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater.</a> Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).</li><li>Jiang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+biofuels+and+biochemicals+production+from+sustainable+resources+using+co-cultivation+systems.">Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems.</a> Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).</li></ol>

Este protocolo presenta cómo utilizar el sistema de cultivo microbiano de microgotas (MMC) para realizar el cultivo microbiano automatizado y la evolución adaptativa a largo plazo. MMC es un sistema de cultivo microbiano miniaturizado, automatizado y de alto rendimiento. En comparación con los métodos e instrumentos de cultivo microbianos convencionales de alto rendimiento, MMC tiene muchas ventajas, como un bajo consumo de mano de obra y reactivos, operación simple, detección en línea (OD y fluorescencia), recopi...

El cultivo microbiano es una base importante para la investigación científica microbiológica y las aplicaciones industriales, que se utiliza ampliamente en el aislamiento, identificación, reconstrucción, cribado y evolución de microorganismos 1,2,3. Los métodos convencionales de cultivo microbiano utilizan principalmente tubos de ensayo, matraces de agitación y placas sólidas como contenedores de cultivo, combinados con incubadoras de agitación, espectrofotómetros, lectores de microplacas y otros equipos para el cultivo, detección y detección microbiana. Sin embargo, estos métodos tienen muchos problemas, como operaciones engorrosas, bajo rendimiento, baja eficiencia y gran consumo de mano de obra y reactivos. Los métodos de cultivo de alto rendimiento desarrollados en los últimos años se basan principalmente en la microplaca. Pero la microplaca tiene un bajo nivel de oxígeno disuelto, una propiedad de mezcla deficiente y una evaporación severa y un efecto térmico, que a menudo conducen a un mal estado de crecimiento y paralelización experimental de microorganismos 4,5,6,7; por otro lado, necesita estar equipado con equipos costosos, como estaciones de trabajo de manipulación de líquidos y lectores de microplacas, para lograr el cultivo automatizado y la detección de procesos 8,9.
Como una rama importante de la tecnología microfluídica, la microfluídica de gotas se ha desarrollado en los últimos años basada en sistemas microfluídicos tradicionales de flujo continuo. Es una tecnología microfluídica de flujo discreto que utiliza dos fases líquidas inmiscibles (generalmente aceite-agua) para generar microgotas dispersas y operar sobre ellas10. Debido a que las microgotas tienen las características de pequeño volumen, gran área de superficie específica, alta tasa de transferencia de masa interna y sin contaminación cruzada causada por la compartimentación, y las ventajas de una fuerte capacidad de control y alto rendimiento de las gotas, ha habido muchos tipos de investigación que aplican tecnología microfluídica de gotas en el cultivo de alto rendimiento, el cribado y la evolución de microorganismos11 . Sin embargo, todavía hay una serie de cuestiones clave para hacer que la tecnología microfluídica de gotas se popularice y se aplique ampliamente. En primer lugar, el funcionamiento de la microfluídica de gotas es engorroso e intrincado, lo que resulta en altos requisitos técnicos para los operadores. En segundo lugar, la tecnología microfluídica de gotas combina componentes ópticos, mecánicos y eléctricos y debe asociarse con escenarios de aplicación de biotecnología. Es difícil para un solo laboratorio o equipo construir sistemas eficientes de control microfluídico de gotas si no hay una colaboración multidisciplinaria. En tercer lugar, debido al pequeño volumen de microgotas (desde el picolitro (pL) hasta el microlitro (μL)), se necesita mucha dificultad para realizar el control automatizado preciso y la detección en línea en tiempo real de gotas para algunas operaciones microbianas básicas, como el subcultivo, la clasificación y el muestreo, y también es difícil construir un sistema de equipo integrado12.
Para abordar los problemas anteriores, se desarrolló con éxito un sistema automático de cultivo de microgotas microbianas (MMC) basado en la tecnología microfluídica degotas 13. El MMC consta de cuatro módulos funcionales: un módulo de reconocimiento de gotas, un módulo de detección de espectro de gotas, un módulo de chip microfluídico y un módulo de muestreo. A través de la integración y control del sistema de todos los módulos, se establece con precisión el sistema de operación automatizado que incluye la generación, cultivo, medición (densidad óptica (OD) y fluorescencia), división, fusión, clasificación de gotas, logrando la integración de funciones como inoculación, cultivo, monitoreo, subcultivo, clasificación y muestreo requeridos por el proceso de cultivo de gotas microbianas. MMC puede contener hasta 200 unidades de cultivo de gotas replicadas de 2-3 μL de volumen, lo que equivale a 200 unidades de cultivo de matraz de agitación. El sistema de cultivo de microgotas puede satisfacer los requisitos de no contaminación, oxígeno disuelto, mezcla e intercambio masa-energía durante el crecimiento de microorganismos, y satisfacer las diversas necesidades de la investigación microbiana a través de múltiples funciones integradas, por ejemplo, medición de la curva de crecimiento, evolución adaptativa, análisis multinivel de un solo factor e investigación y análisis de metabolitos (basados en la detección de fluorescencia)13,14.
Aquí, el protocolo presenta cómo usar el MMC para llevar a cabo el cultivo automatizado y microbiano y la evolución adaptativa en detalle (Figura 1). Tomamos como ejemplo escherichia coli (E. coli) MG1655 de tipo silvestre para demostrar la medición de la curva de crecimiento y una cepa de E. coli esencial de metanol MeSV2.215 para demostrar la evolución adaptativa en MMC. Se desarrolló un software de operación para MMC, lo que hace que la operación sea muy simple y clara. En todo el proceso, el usuario debe preparar la solución inicial de bacterias, establecer las condiciones del MMC y luego inyectar la solución de bacterias y los reactivos relacionados en el MMC. Posteriormente, el MMC realizará automáticamente operaciones como la generación de gotas, el reconocimiento y la numeración, el cultivo y la evolución adaptativa. También realizará la detección en línea (OD y fluorescencia) de las gotas con alta resolución de tiempo y mostrará los datos relacionados (que se pueden exportar) en el software. El operador puede detener el proceso de cultivo en cualquier momento de acuerdo con los resultados y extraer las gotas objetivo para experimentos posteriores. El MMC es fácil de operar, consume menos mano de obra y reactivos, y tiene un rendimiento experimental relativamente alto y una buena paralelismo de datos, lo que tiene ventajas significativas en comparación con los métodos de cultivo convencionales. Proporciona una plataforma experimental robusta, de bajo costo, fácil de operar para que los investigadores realicen investigaciones microbianas relacionadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m PVDF filter membrane</td>
			<td>Merck Millipore Ltd.</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Sterilize the MMC oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-289BSW</td>
			<td>For reagent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>For solid plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20011160</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.</td>
			<td>DL-CJ-INDII</td>
			<td>For aseptic operation and UV sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10007216</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>E450</td>
			<td>Software installation and MMC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Shanghai qixin scientific instrument co., LTD</td>
			<td>LRH 250</td>
			<td>For the microbial cultivation using solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>AR 3130</td>
			<td>For reagent weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>For droplet collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10011928</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>2.0 mL</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2054</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G66258A</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Pressure Steam Sterilization Pot</td>
			<td>SANYO Electric</td>
			<td>MLS3020</td>
			<td>For autoclaved sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>420322</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>P815661</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>M813895</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>BIOBYING</td>
			<td>1305715</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial Microdroplet Culture System (MMC)</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;MMC-I</td>
			<td>Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&#38;id=110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-ALE-OD</td>
			<td>For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC oil</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-M/S-OD</td>
			<td>The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20026118</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G81793J</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G10267B</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10001518</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>90 mm</td>
			<td>For the preparation of solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>2.5 &#956;L, 10 &#956;L, 100&#956;L, 1000&#956;L</td>
			<td>For liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick connector A</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent bottle</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-PCB</td>
			<td>Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flask</td>
			<td>Union-Biotech</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>For microbial cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.</td>
			<td>SKY-210 2B</td>
			<td>For the microbial cultivation in shake flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8290</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>Draw liquid and inject it into the reagent bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>OUBEL Hardware Store</td>
			<td>22G</td>
			<td>Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature refrigerator</td>
			<td>SANYO Ultra-low</td>
			<td>MDF-U4086S</td>
			<td>For strain preservation (-80 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV&#8211;Vis spectrophotometer</td>
			<td>General Electric Company</td>
			<td>Ultrospec 3100 pro</td>
			<td>For the measurement of OD values</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SV8080</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)

Los métodos convencionales de cultivo microbiano generalmente tienen operaciones engorrosas, bajo rendimiento, baja eficiencia y gran consumo de mano de obra y reactivos. Además, los métodos de cultivo de alto rendimiento basados en microplacas desarrollados en los últimos años tienen un estado de crecimiento microbiano deficiente y experimentan paralelización debido a su bajo oxígeno disuelto, mezcla deficiente y evaporación severa y efecto térmico. Debido a muchas ventajas de las microgotas, como el pequeño volumen, el alto rendimiento y la fuerte capacidad de control, la tecnología microfluídica basada en gotas puede superar estos problemas, que se ha utilizado en muchos tipos de investigación de cultivo microbiano de alto rendimiento, cribado y evolución. Sin embargo, la mayoría de los estudios previos permanecen en la etapa de construcción y aplicación del laboratorio. Algunos problemas clave, como los altos requisitos operativos, la alta dificultad de construcción y la falta de tecnología de integración automatizada, restringen la amplia aplicación de la tecnología microfluídica de gotas en la investigación microbiana. Aquí, se desarrolló con éxito un sistema automatizado de cultivo de microgotas microbianas (MMC) basado en tecnología microfluídica de gotas, logrando la integración de funciones como la inoculación, el cultivo, el monitoreo en línea, el subcultivo, la clasificación y el muestreo requeridos por el proceso de cultivo de gotas microbianas. En este protocolo, se tomaron como ejemplos escherichia coli (E. coli) MG1655 de tipo silvestre y una cepa de E. coli esencial de metanol (MeSV2.2) para introducir cómo usar el MMC para llevar a cabo el cultivo microbiano automatizado y de rendimiento relativamente alto y la evolución adaptativa en detalle. Este método es fácil de operar, consume menos mano de obra y reactivos, y tiene un alto rendimiento experimental y una buena paralelización de datos, lo que tiene grandes ventajas en comparación con los métodos de cultivo convencionales. Proporciona una plataforma experimental de bajo costo, fácil de operar y confiable para que los investigadores científicos realicen investigaciones microbianas relacionadas.

Este protocolo utiliza E. coli MG1655 y una cepa MeSV2.2 como ejemplos para demostrar el cultivo microbiano y la evolución adaptativa esencial del metanol con una estrategia automatizada y de rendimiento relativamente alto en MMC. La medición de la curva de crecimiento se utilizó principalmente para caracterizar el cultivo microbiano. La evolución adaptativa se llevó a cabo mediante el subcultivo continuo automatizado y la adición de una alta concentración de metanol como presión selectiva durante cada s...

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Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC

Este protocolo describe cómo utilizar el sistema de cultivo microbiano de microgotas (MMC) para llevar a cabo el cultivo microbiano automatizado y la evolución adaptativa. MMC puede cultivar y subcultivar microorganismos de forma automática y continua y monitorear en línea su crecimiento con un rendimiento relativamente alto y una buena paralelización, reduciendo el consumo de mano de obra y reactivos.

Cultivo microbiano automatizado y evolución adaptativa utilizando el sistema de cultivo de microgotas microbianas (MMC)

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and ...

Este método puede ayudar a resolver los problemas con los métodos convencionales de cultivo microbiano. Proporciona una plataforma experimental de bajo costo, fácil de operar y confiable en los resultados para el cultivo microbiano automatizado y la evolución adaptativa. Esta tecnología automatiza las operaciones y reduce en mayor medida el consumo de mano de obra.Y al mismo tiempo, tiene un buen rendimiento de cultivo con resultados confiables y operaciones simples. La tecnología se utiliza principalmente en los campos de investigación de microbiología, como la medición de la curva de crecimiento, la evolución adaptativa del laboratorio y un análisis multinivel de un solo factor. Comience los preparativos del experimento conectando la aguja de la jeringa con un diámetro interno de 0,41 milímetros y un diámetro exterior de 0,71 milímetros a un conector rápido A y una botella de reactivo.Luego autoclave todo el equipo a 121 grados centígrados durante 15 minutos. Para instalar el chip microfluídico, abra la puerta de la cámara de operación y levante la sonda de fibra óptica. Después de alinear los orificios del campo eléctrico con las agujas, coloque suavemente el chip en el pedestal del chip, luego inserte las dos columnas de posicionamiento en los orificios de posicionamiento y coloque la sonda de fibra óptica.A continuación, conecte el conector rápido A en el chip al puerto correspondiente del sistema de cultivo de microgotas microbianas o MMC de acuerdo con el número de posición como se describe en el manuscrito. Cuando haya terminado, cierre la puerta de la cámara de operación. Diluir la suspensión cultivada de Escherichia coli MG1655 con el medio a un OD600 de 0,05 a 0,1 para obtener 10 mililitros de solución bacteriana inicial.Para inicializar el MMC, haga clic en la pestaña Inicialización. Cuando aparezca la interfaz de inicialización, establezca la temperatura de cultivo en 37 grados Centígrados y el valor de la señal fotoeléctrica en 0,6. La inicialización tardará unos 20 minutos.Más tarde, coloque una botella de reactivo esterilizada en el banco limpio y apriete la tapa. Use una jeringa estéril de 10 mililitros para inyectar de tres a cinco mililitros de aceite MMC desde la aguja de la jeringa hasta el tubo lateral en el frasco de reactivo. Luego incline y gire la botella de reactivo lentamente para que el aceite se infiltre completamente en la pared interior.Después de inyectar cinco mililitros de una solución inicial de bacterias en la botella, llene la botella de reactivo inyectando de cinco a siete mililitros de aceite MMC. Extraiga el conector rápido independiente A del frasco de reactivo e inserte el conector rápido A en el conector rápido B del frasco para completar la operación de inyección de muestra. Una vez hecho esto, abra la puerta de la cámara de operación para colocar la botella de reactivo en el baño de metal.Extraiga el conector C2 del chip y el conector rápido A de la botella de reactivo. Conecte el conector de tubo lateral de la botella de reactivo al conector C2 y el conector de tubo superior al conector de O2. Luego cierre la puerta de la cámara de operación.Para elegir la función de medición de la curva de crecimiento, haga clic en Curva de crecimiento en la interfaz de configuración de parámetros para ingresar el número como 15. Luego encienda el interruptor de detección OD y establezca la longitud de onda como 600 nanómetros. Haga clic en la pestaña Inicio para iniciar la generación de gotas.El proceso tardará 15 minutos en completarse. Cuando aparezca una ventana emergente en la interfaz principal que solicite un mensaje, abra la puerta de la cámara de operación para sacar la botella de reactivo y conectar los conectores C2 y O2. Después de cerrar la puerta, haga clic en el botón Aceptar en la ventana emergente para cultivar automáticamente las gotas y detectar los valores de OD.A medida que la curva de crecimiento alcanza la fase estacionaria, haga clic en el botón Exportar datos para exportar los datos OD. Seleccione la ruta de guardado de datos y exporte el valor de OD registrado durante el período de cultivo en el formato CVS Para trazar la curva de crecimiento, utilice software de mapeo como Excel y Origin 9.0. Inyecte los volúmenes requeridos de la solución inicial de bacterias, el medio fresco y el aceite MMC en las botellas de reactivo esterilizadas separadas para la solución inicial de bacterias en el medio fresco como se explicó anteriormente.Para elegir la función de evolución adaptativa, haga clic en ALE en el software. En la interfaz de configuración de parámetros, active el interruptor de detección de OD, luego configure todos los parámetros descritos en el manuscrito y presione la pestaña Inicio para iniciar la generación de gotas. El proceso durará unos 25 minutos.Durante cada período de subcultivo, observe si los valores máximos de OD de las gotas han aumentado significativamente. Si el aumento se produce y cumple con los requisitos del experimento, haga clic en el botón de exportación de datos para exportar los datos OD. Para extraer las gotas objetivo del MMC, haga clic en la pestaña de selección para seleccionar la función de extracción de gotas.Luego elija la opción Recopilar y haga clic en los números de las gotas de destino. Cuando haya terminado, haga clic en Aceptar. Espere a que la ventana emergente le pida un mensaje. Luego coloque el conector rápido CF en el tubo de la microcentrífuga para su recolección y haga clic en Aceptar. Después de uno o dos minutos, cuando la interfaz del software aparezca una nueva ventana que solicita un mensaje, vuelva a insertar el conector rápido CF y haga clic en Aceptar para que MMC continúe ejecutándose.Cuando la siguiente gota de destino llegue al sitio de reconocimiento de gotas, recójala como se especificó anteriormente. Use una pipeta de 2.5 microlitros para sacar y colocar la gota en una placa sólida de 90 milímetros, seguido de extender la gota uniformemente con una varilla recubierta triangular de vidrio con una longitud lateral de tres centímetros, luego cultive la gota en una incubadora de temperatura constante de 37 grados Celsius durante 72 horas. Más tarde, elija de tres a cinco colonias independientes de bacterias para cultivar cada colonia por separado en un matraz de agitación de 50 mililitros con 10 mililitros de medio fresco en una incubadora de agitación a 200 rotaciones por minuto y 37 grados Celsius durante 48 a 72 horas.Después de la incubación, siga las regulaciones estándar relacionadas para almacenar la solución de bacterias cultivadas en el tubo de glicerol. El análisis representativo muestra las curvas de crecimiento de 50 gotas en todo el proceso de evolución adaptativa. Se observó que la cepa esencial de metanol Escherichia coli o MeSV2.2 mostró un crecimiento lento inicial seguido de un crecimiento rápido.La curva de crecimiento de la gota seis en todo el proceso de evolución adaptativa se trazó por separado. El valor máximo de OD600 en la primera generación fue de 0,37, que aumentó a 0,58 en el último período de subcultivo, lo que indica que la cepa en la gota seis ha realizado una evidente evolución adaptativa. Además, se compararon las curvas de crecimiento de la cepa de gota seis y la deformación inicial.La cepa de gota seis exhibió una tasa máxima de crecimiento específico y una concentración celular más altas en la fase estacionaria que la cepa inicial. Lo más importante es asegurarse de que la conexión del chip del instrumento y la botella de reactivo sea correcta, que son las gotas para que las operaciones procedan normalmente. Este método proporciona a los investigadores una nueva idea para el cultivo de microorganismos y también proporciona una plataforma eficiente y de bajo costo para la evolución adaptativa de las cepas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC)

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Investigación

Bioingeniería

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

El cultivo de células de mamífero utilizando un solo uso Sistema Neumático biorreactor

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Estudios electrotaxis de pulmón células de cáncer utilizando un Multicanal Dual-campo eléctrico chip de microfluidos

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

Un biorreactor Novela de alta densidad de cultivo de diversas comunidades microbianas

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Diseño e implementación de un sistema automatizado de Iluminador, cultivo y sistema de muestreo para Aplicaciones microbiana Optogenética

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Montaje y Seguimiento de Desarrollo Comunitario Microbiano dentro de una Plataforma de Matriz de Micropedulos

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Prospección de cepas microbianas para la biorremediación y el desarrollo de probióticos para la investigación y conservación de metaorganismos

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

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Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Generación de paisajes químicos controlados y dinámicos para estudiar el comportamiento microbiano

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Identificación de alto rendimiento de la resistencia a Pseudomonas syringae pv. Tomate en tomate usando el ensayo de inundación de plántulas

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...