Name: automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)
Uploaded: 2022-02-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC at JoVE.com

Denna studie stöddes av National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), National Key Scientific Instrument and Equipment Project från National Natural Science Foundation of China (21627812) och Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). Vi tackar också prof. Julia A. Vorholt (Institute of Microbiology, Institutionen för biologi, ETH Zürich, Zürich 8093, Schweiz) för tillhandahållandet av den metanol-essentiella E. coli-stammen version 2.2 (MeSV2.2).

1. Installation av instrument och programvara
<ol><li>Välj en ren och steril miljö (t.ex. en ren bänk) som ett dedikerat permanent utrymme för MMC. Installera MMC stadigt i utrymmet. OBS: Håll MMC borta från störningar från starka elektriska fält, magnetfält och starka värmestrålningskällor. Undvik att allvarliga vibrationer påverkar de optiska detekteringskomponenterna. Ge strömförsörjningen på AC220 V, 50 HZ till MMC. Mer information om MMC finns i materialförteckningen<...

<ol>
	<li>Lewis, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms.">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li><li>Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+technology+in+industrial+biotechnology.">High-throughput screening technology in industrial biotechnology.</a> Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).</li><li>Kim, J., Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+analysis+for+the+optimization+of+Campylobacter+isolation+from+chicken+carcasses+using+selective+media.">Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).</li><li>Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microscale+processing+technologies+for+quantification+of+biocatalytic+Baeyer-Villiger+oxidation+kinetics.">The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).</li><li>Harms, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+a+24-station+high+throughput+microbioreactor.">Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).</li><li>Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-four+well+plate+miniature+bioreactor+system+as+a+scale-down+model+for+cell+culture+process+development.">Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo-Lector+-+a+novel+platform+for+automated+high-throughput+cultivations+in+microtiter+plates+with+high+information+content.">Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content.</a> Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+a+kinetics+analysis+of+the+high-pressure+inactivation+of+microorganisms+using+microplates.">High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).</li><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics.">Droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li><li>Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+microbiology:+techniques,+applications+and+challenges.">Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).</li><li>Liao, P. Y., Huang, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divide+and+conquer:+analytical+chemistry+of+nucleic+acids+in+droplets.">Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets.</a> Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).</li><li>Jian, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+microdroplet+culture+system+(MMC):+An+integrated+platform+for+automated,+high-throughput+microbial+cultivation+and+adaptive+evolution.">Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).</li><li>Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empowering+a+methanol-dependent+Escherichia+coli+via+adaptive+evolution+using+a+high-throughput+microbial+microdroplet+culture+system.">Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).</li><li>Meyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-essential+growth+of+Escherichia+coli.">Methanol-essential growth of Escherichia coli.</a> Nature Communications. 9, 1508 (2018).</li><li>Gru&#776;nberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+growth+rate+0.6:+Corynebacterium+glutamicum+cultivated+in+highly+diluted+environments.">Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).</li><li>Kaganovitch, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+single-cell+analysis+in+picoliter-sized+batch+cultivation+chambers.">Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers.</a> New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).</li><li>Baraban, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millifluidic+droplet+analyser+for+microbiology.">Millifluidic droplet analyser for microbiology.</a> Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).</li><li>Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+adaptation+in+microdroplet+chemostats.">Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).</li><li>Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+droplet-based+microfluidic+platform+for+multiplexed+analysis+of+biochemical+markers+in+small+volumes.">Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes.</a> Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).</li><li>Watterson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+high-throughput+cultivation+for+accurate+screening+of+antibiotic+resistant+gut+microbes.">Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes.</a> eLife. 9, 56998 (2020).</li><li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactants+in+droplet-based+microfluidics.">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li><li>Nitschke, M., Pastore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+properties+of+a+surfactant+obtained+from+Bacillus+subtilis+grown+on+cassava+wastewater.">Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater.</a> Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).</li><li>Jiang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+biofuels+and+biochemicals+production+from+sustainable+resources+using+co-cultivation+systems.">Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems.</a> Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).</li></ol>

Detta protokoll presenterar hur man använder det mikrobiella mikrodropletkultursystemet (MMC) för att utföra automatiserad mikrobiell odling och långsiktig adaptiv evolution. MMC är ett miniatyriserat, automatiserat och mikrobiellt odlingssystem med hög genomströmning. Jämfört med konventionella mikrobiella odlingsmetoder och instrument med hög genomströmning har MMC många fördelar som låg arbets- och reagensförbrukning, enkel drift, onlinedetektering (OD och fluorescens), datainsamling med hög tidsupplö...

Mikrobiell odling är en viktig grund för mikrobiologisk vetenskaplig forskning och industriella tillämpningar, som används i stor utsträckning vid isolering, identifiering, rekonstruktion, screening och utveckling av mikroorganismer 1,2,3. Konventionella mikrobiella odlingsmetoder använder huvudsakligen provrör, skakkolvar och fasta plattor som odlingsbehållare, i kombination med skakinkubatorer, spektrofotometrar, mikroplattläsare och annan utrustning för mikrobiell odling, detektion och screening. Dessa metoder har emellertid många problem, såsom besvärliga operationer, låg genomströmning, låg effektivitet och stor konsumtion av arbetskraft och reagenser. De odlingsmetoder med hög kapacitet som utvecklats under de senaste åren är huvudsakligen baserade på mikroplattan. Men mikroplattan har en låg nivå av upplöst syre, dålig blandningsegenskap och svår avdunstning och termisk effekt, vilket ofta leder till dålig tillväxtstatus och experimentparallellisering av mikroorganismer 4,5,6,7; å andra sidan måste den vara utrustad med dyr utrustning, såsom vätskehanteringsarbetsstationer och mikroplattläsare, för att uppnå automatiserad odling och processdetektering 8,9.
Som en viktig gren av mikrofluidisk teknik har droppmikrofluidik utvecklats under de senaste åren baserat på traditionella mikrofluidiska system med kontinuerligt flöde. Det är en diskret flödesmikrofluidisk teknik som använder två oblandbara vätskefaser (vanligtvis oljevatten) för att generera dispergerade mikrodroppar och arbeta med dem10. Eftersom mikrodroppar har egenskaperna hos liten volym, stor specifik ytarea, hög intern massöverföringshastighet och ingen korskontaminering orsakad av fackbildning, och fördelarna med stark kontrollerbarhet och hög genomströmning av droppar, har det funnits många typer av forskning som tillämpar droppmikrofluidisk teknik vid odling, screening och utveckling av mikroorganismer med hög genomströmning11 . Det finns dock fortfarande en rad viktiga frågor för att göra droppmikrofluidisk teknik populariserad och allmänt tillämpad. För det första är driften av droppmikrofluidik besvärlig och invecklad, vilket resulterar i höga tekniska krav för operatörer. För det andra kombinerar droppmikrofluidisk teknik optiska, mekaniska och elektriska komponenter och måste associeras med biotekniska applikationsscenarier. Det är svårt för ett enda laboratorium eller team att bygga effektiva droppmikrofluidiska styrsystem om det inte finns något tvärvetenskapligt samarbete. För det tredje, på grund av den lilla volymen mikrodroppe (från picoliter (pL) till mikroliter (μL)), krävs det mycket svårigheter att förverkliga den exakta automatiserade kontrollen och realtidsdetekteringen av droppar för vissa grundläggande mikrobiella operationer som subodling, sortering och provtagning, och det är också svårt att konstruera ett integrerat utrustningssystem12.
För att ta itu med ovanstående problem utvecklades ett automatiskt mikrobiellt mikrodropletodlingssystem (MMC) framgångsrikt baserat på droppmikrofluidisk teknik13. MMC består av fyra funktionella moduler: en droppigenkänningsmodul, en droppspektrumdetekteringsmodul, en mikrofluidisk chipmodul och en provtagningsmodul. Genom systemintegration och kontroll av alla moduler fastställs automatiserat operativsystem inklusive generering, odling, mätning (optisk densitet (OD) och fluorescens), splittring, fusion, sortering av droppar exakt, vilket uppnår integrationen av funktioner som inokulering, odling, övervakning, subodling, sortering och provtagning som krävs av processen för mikrobiell droppodling. MMC kan rymma upp till 200 replikerade droppodlingsenheter med en volym på 2-3 μl, vilket motsvarar 200 odlingsenheter för skakkolvar. Odlingssystemet för mikrodroppar kan uppfylla kraven på icke-kontaminering, upplöst syre, blandning och massenergiutbyte under tillväxten av mikroorganismer och tillgodose de olika behoven hos mikrobiell forskning genom flera integrerade funktioner, till exempel tillväxtkurvmätning, adaptiv evolution, enfaktoranalys på flera nivåer och metabolitforskning och analys (baserat på fluorescensdetektering)13,14.
Här introducerar protokollet hur man använder MMC för att genomföra automatiserad och mikrobiell odling och adaptiv evolution i detalj (Figur 1). Vi tog vildtyp Escherichia coli (E. coli) MG1655 som ett exempel för att demonstrera mätningen av tillväxtkurvan och en metanol-essentiell E. coli-stam MeSV2.215 för att demonstrera den adaptiva utvecklingen i MMC. En operationsprogramvara för MMC utvecklades, vilket gör operationen mycket enkel och tydlig. I hela processen måste användaren förbereda den ursprungliga bakterielösningen, ställa in villkoren för MMC och sedan injicera bakterielösningen och relaterade reagenser i MMC. Därefter kommer MMC automatiskt att utföra operationer som droppgenerering, igenkänning och numrering, odling och adaptiv evolution. Det kommer också att utföra online-detektering (OD och fluorescens) av dropparna med hög tidsupplösning och visa relaterade data (som kan exporteras) i programvaran. Operatören kan stoppa odlingsprocessen när som helst enligt resultaten och extrahera måldropparna för efterföljande experiment. MMC är lätt att använda, förbrukar mindre arbete och reagenser och har relativt hög experimentell genomströmning och god dataparallellitet, vilket har betydande fördelar jämfört med konventionella odlingsmetoder. Det ger en billig, driftsvänlig och robust experimentell plattform för forskare att bedriva relaterad mikrobiell forskning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m PVDF filter membrane</td>
			<td>Merck Millipore Ltd.</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Sterilize the MMC oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-289BSW</td>
			<td>For reagent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>For solid plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20011160</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.</td>
			<td>DL-CJ-INDII</td>
			<td>For aseptic operation and UV sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10007216</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>E450</td>
			<td>Software installation and MMC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Shanghai qixin scientific instrument co., LTD</td>
			<td>LRH 250</td>
			<td>For the microbial cultivation using solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>AR 3130</td>
			<td>For reagent weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>For droplet collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10011928</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>2.0 mL</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2054</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G66258A</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Pressure Steam Sterilization Pot</td>
			<td>SANYO Electric</td>
			<td>MLS3020</td>
			<td>For autoclaved sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>420322</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>P815661</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>M813895</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>BIOBYING</td>
			<td>1305715</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial Microdroplet Culture System (MMC)</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;MMC-I</td>
			<td>Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&#38;id=110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-ALE-OD</td>
			<td>For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC oil</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-M/S-OD</td>
			<td>The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20026118</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G81793J</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G10267B</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10001518</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>90 mm</td>
			<td>For the preparation of solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>2.5 &#956;L, 10 &#956;L, 100&#956;L, 1000&#956;L</td>
			<td>For liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick connector A</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent bottle</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-PCB</td>
			<td>Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flask</td>
			<td>Union-Biotech</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>For microbial cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.</td>
			<td>SKY-210 2B</td>
			<td>For the microbial cultivation in shake flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8290</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>Draw liquid and inject it into the reagent bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>OUBEL Hardware Store</td>
			<td>22G</td>
			<td>Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature refrigerator</td>
			<td>SANYO Ultra-low</td>
			<td>MDF-U4086S</td>
			<td>For strain preservation (-80 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV&#8211;Vis spectrophotometer</td>
			<td>General Electric Company</td>
			<td>Ultrospec 3100 pro</td>
			<td>For the measurement of OD values</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SV8080</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)

Konventionella mikrobiella odlingsmetoder har vanligtvis besvärliga operationer, låg genomströmning, låg effektivitet och stor konsumtion av arbetskraft och reagens. Dessutom har mikroplattbaserade odlingsmetoder med hög genomströmning som utvecklats under de senaste åren dålig mikrobiell tillväxtstatus och experimentparallellisering på grund av deras låga upplösta syre, dåliga blandning och allvarliga avdunstning och termiska effekt. På grund av många fördelar med mikrodroppar, såsom liten volym, hög genomströmning och stark kontrollerbarhet, kan den droppbaserade mikrofluidiska tekniken övervinna dessa problem, som har använts i många typer av forskning om mikrobiell odling, screening och evolution med hög genomströmning. De flesta tidigare studier förblir dock på scenen för laboratoriekonstruktion och tillämpning. Några viktiga frågor, såsom höga operativa krav, höga konstruktionssvårigheter och brist på automatiserad integrationsteknik, begränsar den breda tillämpningen av droppmikrofluidisk teknik i mikrobiell forskning. Här utvecklades ett automatiserat mikrobiellt mikrodropletodlingssystem (MMC) framgångsrikt baserat på droppmikrofluidisk teknik, vilket uppnådde integration av funktioner som ympning, odling, onlineövervakning, subodling, sortering och provtagning som krävs av processen för mikrobiell droppodling. I detta protokoll togs vildtyp Escherichia coli (E. coli) MG1655 och en metanol-essentiell E. coli-stam (MeSV2.2) som exempel för att introducera hur man använder MMC för att genomföra automatiserad och relativt högkapacitets mikrobiell odling och adaptiv utveckling i detalj. Denna metod är lätt att använda, förbrukar mindre arbetskraft och reagens och har hög experimentell genomströmning och god dataparallellitet, vilket har stora fördelar jämfört med konventionella odlingsmetoder. Det ger en billig, driftsvänlig och resultatsäker experimentell plattform för vetenskapliga forskare att bedriva relaterad mikrobiell forskning.

Detta protokoll använder E. coli MG1655 och en MeSV2.2-stam som exempel för att demonstrera den mikrobiella odlingen och metanol-essentiell adaptiv utveckling med en automatiserad och relativt hög genomströmningsstrategi i MMC. Tillväxtkurvmätningen användes främst för att karakterisera mikrobiell odling. Den adaptiva evolutionen genomfördes genom automatiserad kontinuerlig subodling och tillsats av en hög koncentration av metanol som selektivt tryck under varje delodling. Huruvida adaptiv evolution h...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC at JoVE.com

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC

Detta protokoll beskriver hur man använder det mikrobiella mikrodropletkultursystemet (MMC) för att genomföra automatiserad mikrobiell odling och adaptiv evolution. MMC kan odla och subkultivera mikroorganismer automatiskt och kontinuerligt och övervaka online deras tillväxt med relativt hög genomströmning och god parallellisering, vilket minskar arbetskrafts- och reagensförbrukningen.

Automatiserad mikrobiell odling och adaptiv evolution med hjälp av mikrobiellt mikrodropletodlingssystem (MMC)

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and ...

Denna metod kan hjälpa till att lösa problemen med de konventionella mikrobiella odlingsmetoderna. Det ger en billig, driftsvänlig och resultatsäker experimentell plattform för automatiserad mikrobiell odling och adaptiv evolution. Denna teknik automatiserar verksamheten och större minskar arbetsförbrukningen.Och samtidigt har den bra kulturprestanda med tillförlitliga resultat och enkla operationer. Tekniken används främst inom de mikrobiologiska forskningsfälten, såsom tillväxtkurvmätning, adaptiv laboratorieutveckling och en enfaktoranalys på flera nivåer. Starta förberedelserna av experimentet genom att ansluta sprutnålen med en innerdiameter på 0,41 millimeter och en ytterdiameter på 0,71 millimeter till en snabbkoppling A och reagensflaska.Autoklavera sedan all utrustning vid 121 grader Celsius i 15 minuter. För att installera det mikrofluidiska chipet, öppna dörren till operationskammaren och lyft den optiska fibersonden. Efter att ha justerat de elektriska fälthålen med nålarna, placera försiktigt chipet på chippiedestalen, sätt sedan in de två positioneringskolonnerna i positioneringshålen och lägg ner den optiska fibersonden.Anslut sedan snabbkontakten A på chipet till motsvarande port i det mikrobiella mikrodropletodlingssystemet eller MMC enligt positionsnumret som beskrivs i manuskriptet. När du är klar stänger du dörren till operationskammaren. Späd den odlade Escherichia coli MG1655-suspensionen med mediet till en OD600 av 0,05 till 0,1 för att erhålla 10 ml initial bakterielösning.För att initiera MMC, klicka på fliken Initialisering. När initialiseringsgränssnittet visas ställer du in odlingstemperaturen som 37 grader Celsius och det fotoelektriska signalvärdet som 0,6. Initieringen tar cirka 20 minuter.Placera senare en steriliserad reagensflaska på den rena bänken och dra åt locket. Använd en 10 ml steril spruta för att injicera tre till fem milliliter MMC-olja från sprutnålen till sidoröret i reagensflaskan. Luta och rotera sedan reagensflaskan långsamt så att oljan helt infiltrerar innerväggen.Efter att ha injicerat fem milliliter av en initial bakterielösning i flaskan fyller du reagensflaskan genom att injicera fem till sju milliliter av MMC-oljan. Dra ut den oberoende snabbkontakten A på reagensflaskan och sätt in snabbkopplingen A i flaskans snabbkoppling B för att slutföra provinjektionen. När du är klar öppnar du dörren till operationskammaren för att sätta reagensflaskan i metallbadet.Dra ut C2-kontakten på chipet och snabbkontakten A på reagensflaskan. Anslut reagensflaskans sidorörskontakt till C2-kontakten och den övre rörkontakten till O2-kontakten. Stäng sedan dörren till operationskammaren.För att välja funktionen för tillväxtkurvmätning, klicka på Tillväxtkurva i parameterinställningsgränssnittet mata in numret som 15. Slå sedan på OD-detekteringsomkopplaren och ställ in våglängden som 600 nanometer. Klicka på fliken Start för att starta droppgenerering.Processen tar 15 minuter att slutföra. När ett popup-fönster visas på huvudgränssnittet som uppmanar ett meddelande, öppna dörren till operationskammaren för att ta ut reagensflaskan och anslut C2- och O2-kontakterna. När du har stängt dörren klickar du på OK -knappen i popup-fönstret för att automatiskt odla dropparna och upptäcka OD-värdena.När tillväxtkurvan når den stationära fasen klickar du på knappen Dataexport för att exportera OD-data. Välj datasparningsvägen och exportera OD-värdet som registrerats under odlingsperioden i CVS-format För att plotta tillväxtkurvan, använd kartprogramvara som Excel och Origin 9.0. Injicera erforderliga volymer av den ursprungliga bakterielösningen, färskt medium och MMC-olja i de separata steriliserade reagensflaskorna för den initiala bakterielösningen i det färska mediet som förklarats tidigare.För att välja funktionen för adaptiv evolution, klicka på ALE i programvaran. I parameterinställningsgränssnittet slår du på OD-detekteringsomkopplaren, ställer sedan in alla parametrar som beskrivs i manuskriptet och trycker på fliken Start för att starta droppgenerering. Processen tar cirka 25 minuter.Observera under varje delodlingsperiod om dropparnas maximala OD-värden har ökat avsevärt. Om ökningen inträffar och uppfyller experimentkraven klickar du på dataexportknappen för att exportera OD-data. För att extrahera måldropparna från MMC, klicka på screeningfliken för att välja funktionen för dropputvinning.Välj sedan Samla in och klicka på antalet måldroppar. När du är klar klickar du på OK. Vänta på popup-fönstret som uppmanar ett meddelande. Sätt sedan CF-snabbkontakten i mikrocentrifugröret för uppsamling och klicka på OK. Efter en till två minuter när programvarugränssnittet dyker upp ett nytt fönster som uppmanar ett meddelande, sätt tillbaka CF-snabbkontakten och klicka på OK för att få MMC att fortsätta att köras.När nästa måldroppe når droppigenkänningsplatsen samlar du in den enligt tidigare specifikation. Använd en 2,5 mikroliterpipett för att ta ut och placera droppen på en 90 millimeter fast platta, följt av att sprida droppen jämnt med en glas triangulär belagd stång med en sidolängd på tre centimeter och odla sedan droppen i en 37 grader Celsius konstant temperatur inkubator i 72 timmar. Välj senare tre till fem oberoende kolonier av bakterier för att odla varje koloni separat i en 50 ml skakkolv med 10 ml färskt medium i en skakinkubator vid 200 rotationer per minut och 37 grader Celsius i 48 till 72 timmar.Efter inkubationen, följ de relaterade standardbestämmelserna för att lagra den odlade bakterielösningen i glycerolröret. Den representativa analysen visar tillväxtkurvorna för 50 droppar i hela den adaptiva utvecklingsprocessen. Det observerades att metanol essentiell Escherichia coli-stam eller MeSV2.2 visade initial långsam tillväxt följt av snabb tillväxt.Tillväxtkurvan för dropp sex i hela den adaptiva utvecklingsprocessen plottades separat. Det maximala OD600-värdet i den första generationen var 0,37, vilket ökade till 0,58 under den senaste subodlingsperioden, vilket indikerar att stammen i droppsexan har realiserat en uppenbar adaptiv utveckling. Dessutom jämfördes tillväxtkurvorna för droppsexstammen och den initiala stammen.Droppsexstammen uppvisade en högre maximal specifik tillväxthastighet och cellkoncentration i den stationära fasen än den ursprungliga stammen. Det viktigaste är att se till att anslutningen av instrumentchipet och reagensflaskan är korrekt, vilket är dropparna för att verksamheten ska fortsätta normalt. Denna metod ger forskare en ny idé för odling av mikroorganismer och ger också en effektiv och billig plattform för adaptiv utveckling av stammar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC)

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

Microfluidic pikoliter Bioreaktor för Microbial Encelliga Analys: Fabrication, Systeminställningar, och Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Odling av däggdjursceller med en enda användning Pneumatic bioreaktorsystem

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier av lungcancerceller med användning av en Multichannel dubbla elektriskt fält mikroflödes Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A Novel Bioreaktor för High Density Odling av olika mikrobiella samhällen

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design och implementering av en automatisk Lysande, Odling och provtagningssystemet för Microbial optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Montering och spårning av mikrobiell gemenskapsutveckling inom en Microwell Array-plattform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Prospektering mikrobiella stammar för bioremediering och probiotika utveckling för Metaorganismforskning och bevarande

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Processoptimering med hög genomströmning Automatiserad Mikro-Bioreaktorer i kinesisk hamster äggstockscellodling

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Generera kontrollerade, dynamiska kemiska landskap för att studera mikrobiell beteende

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Hög genomströmning Identifiering av resistens mot Pseudomonas syringae pv. Tomat i tomat med plantning Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...