Name: automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)
Uploaded: 2022-02-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2018YFA0901500), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Ulusal Anahtar Bilimsel Enstrüman ve Ekipman Projesi (21627812) ve Tsinghua Üniversitesi Girişimi Bilimsel Araştırma Programı (20161080108) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Prof. Julia A. Vorholt'a (Mikrobiyoloji Enstitüsü, Biyoloji Bölümü, ETH Zürih, Zürih 8093, İsviçre) metanol esansiyel E. coli suşu versiyon 2.2'nin (MeSV2.2) sağlanması için teşekkür ederiz.

1. Cihaz ve yazılım kurulumu
<ol><li>MMC için ayrılmış kalıcı alan olarak temiz ve steril bir ortam (temiz bir tezgah gibi) seçin. MMC'yi alana sabit bir şekilde yükleyin. NOT: MMC'yi güçlü elektrik alanlarının, manyetik alanların ve güçlü ısı radyasyon kaynaklarının parazitinden uzak tutun. Optik algılama bileşenlerini etkilemekten kaynaklanan şiddetli titreşimlerden kaçının. MMC'ye AC220 V, 50 HZ güç kaynağı sağlayın. MMC hakkında ayrıntılar için Ma...

<ol>
	<li>Lewis, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority.">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li><li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms.">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li><li>Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+technology+in+industrial+biotechnology.">High-throughput screening technology in industrial biotechnology.</a> Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).</li><li>Kim, J., Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+analysis+for+the+optimization+of+Campylobacter+isolation+from+chicken+carcasses+using+selective+media.">Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).</li><li>Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microscale+processing+technologies+for+quantification+of+biocatalytic+Baeyer-Villiger+oxidation+kinetics.">The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).</li><li>Harms, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+a+24-station+high+throughput+microbioreactor.">Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).</li><li>Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-four+well+plate+miniature+bioreactor+system+as+a+scale-down+model+for+cell+culture+process+development.">Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo-Lector+-+a+novel+platform+for+automated+high-throughput+cultivations+in+microtiter+plates+with+high+information+content.">Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content.</a> Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+a+kinetics+analysis+of+the+high-pressure+inactivation+of+microorganisms+using+microplates.">High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).</li><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics.">Droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li><li>Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+microbiology:+techniques,+applications+and+challenges.">Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).</li><li>Liao, P. Y., Huang, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divide+and+conquer:+analytical+chemistry+of+nucleic+acids+in+droplets.">Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets.</a> Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).</li><li>Jian, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+microdroplet+culture+system+(MMC):+An+integrated+platform+for+automated,+high-throughput+microbial+cultivation+and+adaptive+evolution.">Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).</li><li>Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empowering+a+methanol-dependent+Escherichia+coli+via+adaptive+evolution+using+a+high-throughput+microbial+microdroplet+culture+system.">Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).</li><li>Meyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-essential+growth+of+Escherichia+coli.">Methanol-essential growth of Escherichia coli.</a> Nature Communications. 9, 1508 (2018).</li><li>Gru&#776;nberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+growth+rate+0.6:+Corynebacterium+glutamicum+cultivated+in+highly+diluted+environments.">Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).</li><li>Kaganovitch, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+single-cell+analysis+in+picoliter-sized+batch+cultivation+chambers.">Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers.</a> New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).</li><li>Baraban, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millifluidic+droplet+analyser+for+microbiology.">Millifluidic droplet analyser for microbiology.</a> Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).</li><li>Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+adaptation+in+microdroplet+chemostats.">Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).</li><li>Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+droplet-based+microfluidic+platform+for+multiplexed+analysis+of+biochemical+markers+in+small+volumes.">Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes.</a> Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).</li><li>Watterson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+high-throughput+cultivation+for+accurate+screening+of+antibiotic+resistant+gut+microbes.">Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes.</a> eLife. 9, 56998 (2020).</li><li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactants+in+droplet-based+microfluidics.">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li><li>Nitschke, M., Pastore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+properties+of+a+surfactant+obtained+from+Bacillus+subtilis+grown+on+cassava+wastewater.">Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater.</a> Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).</li><li>Jiang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+biofuels+and+biochemicals+production+from+sustainable+resources+using+co-cultivation+systems.">Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems.</a> Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).</li></ol>

Bu protokol, otomatik mikrobiyal yetiştirme ve uzun vadeli adaptif evrim gerçekleştirmek için Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültürü sisteminin (MMC) nasıl kullanılacağını sunar. MMC minyatürleştirilmiş, otomatik ve yüksek verimli bir mikrobiyal yetiştirme sistemidir. Geleneksel mikrobiyal yüksek verimli yetiştirme yöntemleri ve cihazlarıyla karşılaştırıldığında, MMC düşük işçilik ve reaktif tüketimi, basit kullanım, çevrimiçi algılama (OD ve floresan), yüksek zaman çözünürlüklü v...

Mikrobiyal tarım, mikroorganizmaların izolasyonu, tanımlanması, yeniden yapılandırılması, taranması ve evriminde yaygın olarak kullanılan mikrobiyolojik bilimsel araştırmalar ve endüstriyel uygulamalar için önemli bir temeldir 1,2,3. Geleneksel mikrobiyal yetiştirme yöntemleri esas olarak test tüplerini, sallama şişelerini ve katı plakaları yetiştirme kapları olarak kullanır, ayrıca sallama inkübatörleri, spektrofotometreler, mikro plaka okuyucuları ve mikrobiyal yetiştirme, tespit ve tarama için diğer ekipmanlarla birleştirilir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin hantal işlemler, düşük verim, düşük verimlilik ve büyük işgücü ve reaktif tüketimi gibi birçok sorunu vardır. Son yıllarda geliştirilen yüksek verimli yetiştirme yöntemleri esas olarak mikroplakaya dayanmaktadır. Ancak mikroplaka düşük çözünmüş oksijen seviyesine, zayıf karıştırma özelliğine ve şiddetli buharlaşma ve termal etkiye sahiptir, bu da genellikle zayıf büyüme durumuna ve mikroorganizmaların deney paralelliğine yol açar 4,5,6,7; Öte yandan, otomatik yetiştirme ve proses tespiti elde etmek için sıvı taşıma iş istasyonları ve mikro plaka okuyucular gibi pahalı ekipmanlarla donatılması gerekir 8,9.
Mikroakışkan teknolojisinin önemli bir dalı olan damlacık mikroakışkanları, son yıllarda geleneksel sürekli akışlı mikroakışkan sistemlere dayanarak geliştirilmiştir. Dağınık mikro damlacıklar üretmek ve bunlar üzerinde çalışmak için iki karışmaz sıvı fazı (genellikle yağ-su) kullanan ayrık akışlı bir mikroakışkan teknolojisidir10. Mikro damlacıklar küçük hacimli, geniş spesifik yüzey alanı, yüksek iç kütle transfer hızı özelliklerine sahip olduğundan ve bölümlere ayırmanın neden olduğu çapraz kontaminasyon olmadığından ve damlacıkların güçlü kontrol edilebilirliği ve yüksek veriminin avantajlarına sahip olduğundan, yüksek verimli ekim, eleme ve mikroorganizmaların evriminde damlacık mikroakışkan teknolojisini uygulayan birçok araştırma türü olmuştur11 . Bununla birlikte, damlacık mikroakışkan teknolojisinin popülerleşmesini ve yaygın olarak uygulanmasını sağlamak için hala bir dizi önemli konu vardır. İlk olarak, damlacık mikroakışkanlarının çalışması hantal ve karmaşıktır, bu da operatörler için yüksek teknik gereksinimlere neden olur. İkincisi, damlacık mikroakışkan teknolojisi optik, mekanik ve elektrikli bileşenleri birleştirir ve biyoteknoloji uygulama senaryolarıyla ilişkilendirilmesi gerekir. Çok disiplinli bir işbirliği yoksa, tek bir laboratuvar veya ekibin verimli damlacık mikroakışkan kontrol sistemleri kurması zordur. Üçüncüsü, küçük hacimli mikro damlacık nedeniyle (pikoliter (pL) mikrolitreye (μL)), alt ekim, sıralama ve örnekleme gibi bazı temel mikrobiyal işlemler için damlacıkların hassas otomatik kontrolünü ve gerçek zamanlı çevrimiçi tespitini gerçekleştirmek çok zordur ve entegre bir ekipman sistemi oluşturmak da zordur12.
Yukarıdaki sorunları çözmek için, damlacık mikroakışkan teknolojisine dayanan otomatik bir Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür sistemi (MMC) başarıyla geliştirilmiştir13. MMC dört işlevsel modülden oluşur: damlacık tanıma modülü, damlacık spektrumu algılama modülü, mikroakışkan çip modülü ve örnekleme modülü. Tüm modüllerin sistem entegrasyonu ve kontrolü sayesinde, damlacıkların üretimi, yetiştirilmesi, ölçülmesi (optik yoğunluk (OD) ve floresan), bölünmesi, füzyonu, ayrıştırılması dahil olmak üzere otomatik işletim sistemi doğru bir şekilde kurulmakta, mikrobiyal damlacık yetiştiriciliği işleminin gerektirdiği aşılama, ekim, izleme, alt ekim, ayıklama ve numune alma gibi fonksiyonların entegrasyonu sağlanmaktadır. MMC, 200 sallama şişesi yetiştirme ünitesine eşdeğer olan 2-3 μL hacimli 200 kopya damlacık yetiştirme ünitesini tutabilir. Mikro-damlacık yetiştirme sistemi, mikroorganizmaların büyümesi sırasında kontaminasyonsuz, çözünmüş oksijen, karıştırma ve kütle-enerji değişimi gereksinimlerini karşılayabilir ve örneğin büyüme eğrisi ölçümü, uyarlanabilir evrim, tek faktörlü çok seviyeli analiz ve metabolit araştırması ve analizi (floresan tespitine dayalı) gibi çoklu entegre fonksiyonlar aracılığıyla mikrobiyal araştırmanın çeşitli ihtiyaçlarını karşılayabilir13,14.
Burada protokol, MMC'nin otomatik ve mikrobiyal yetiştirme ve uyarlanabilir evrimi ayrıntılı olarak yürütmek için nasıl kullanılacağını tanıtmaktadır (Şekil 1). Büyüme eğrisi ölçümünü göstermek için vahşi tip Escherichia coli (E. coli) MG1655'i ve MMC'deki adaptif evrimi göstermek için metanol esansiyel E. coli suşu MeSV2.215'i örnek olarak aldık. MMC için bir operasyon yazılımı geliştirildi, bu da işlemi çok basit ve net hale getiriyor. Tüm süreçte, kullanıcının ilk bakteri çözeltisini hazırlaması, MMC'nin koşullarını ayarlaması ve ardından bakteri çözeltisini ve ilgili reaktifleri MMC'ye enjekte etmesi gerekir. Daha sonra, MMC damlacık oluşturma, tanıma ve numaralandırma, yetiştirme ve uyarlanabilir evrim gibi işlemleri otomatik olarak gerçekleştirecektir. Ayrıca, damlacıkların yüksek zaman çözünürlüğüne sahip çevrimiçi tespitini (OD ve floresan) gerçekleştirecek ve ilgili verileri (dışa aktarılabilen) yazılımda görüntüleyecektir. Operatör, sonuçlara göre yetiştirme işlemini istediği zaman durdurabilir ve sonraki deneyler için hedef damlacıkları çıkarabilir. MMC'nin kullanımı kolaydır, daha az emek ve reaktif tüketir ve nispeten yüksek deneysel verime ve geleneksel yetiştirme yöntemlerine kıyasla önemli avantajlara sahip olan iyi veri paralelliğine sahiptir. Araştırmacıların ilgili mikrobiyal araştırmaları yürütmeleri için düşük maliyetli, operasyon dostu ve sağlam bir deneysel platform sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m PVDF filter membrane</td>
			<td>Merck Millipore Ltd.</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Sterilize the MMC oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>BCD-289BSW</td>
			<td>For reagent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>For solid plate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20011160</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.</td>
			<td>DL-CJ-INDII</td>
			<td>For aseptic operation and UV sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10007216</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>E450</td>
			<td>Software installation and MMC control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Shanghai qixin scientific instrument co., LTD</td>
			<td>LRH 250</td>
			<td>For the microbial cultivation using solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>AR 3130</td>
			<td>For reagent weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>For droplet collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10011928</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>2.0 mL</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2054</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G66258A</td>
			<td>For strain preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Pressure Steam Sterilization Pot</td>
			<td>SANYO Electric</td>
			<td>MLS3020</td>
			<td>For autoclaved sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Biotopped</td>
			<td>420322</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>P815661</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>M813895</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>BIOBYING</td>
			<td>1305715</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbial Microdroplet Culture System (MMC)</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;MMC-I</td>
			<td>Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&#38;id=110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-ALE-OD</td>
			<td>For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC oil</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-M/S-OD</td>
			<td>The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>20026118</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G81793J</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>GENERAL-REAGENT</td>
			<td>G10267B</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10001518</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>90 mm</td>
			<td>For the preparation of solid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>2.5 &#956;L, 10 &#956;L, 100&#956;L, 1000&#956;L</td>
			<td>For liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick connector A</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent bottle</td>
			<td>Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>MMC-PCB</td>
			<td>Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flask</td>
			<td>Union-Biotech</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>For microbial cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.</td>
			<td>SKY-210 2B</td>
			<td>For the microbial cultivation in shake flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8290</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>Draw liquid and inject it into the reagent bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>OUBEL Hardware Store</td>
			<td>22G</td>
			<td>Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature refrigerator</td>
			<td>SANYO Ultra-low</td>
			<td>MDF-U4086S</td>
			<td>For strain preservation (-80 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV&#8211;Vis spectrophotometer</td>
			<td>General Electric Company</td>
			<td>Ultrospec 3100 pro</td>
			<td>For the measurement of OD values</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SV8080</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid Ltd.</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Component of the LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Component of the special medium for MeSV2.2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated microbial cultivation and adaptive evolution using microbial microdroplet culture system (mmc)

Geleneksel mikrobiyal yetiştirme yöntemleri genellikle hantal operasyonlara, düşük verime, düşük verimliliğe ve büyük miktarda işgücü ve reaktif tüketimine sahiptir. Ayrıca, son yıllarda geliştirilen mikroplaka bazlı yüksek verimli yetiştirme yöntemleri, düşük çözünmüş oksijen, zayıf karışım ve şiddetli buharlaşma ve termal etkileri nedeniyle zayıf mikrobiyal büyüme durumuna ve deney paralelliğine sahiptir. Mikro damlacıkların küçük hacim, yüksek verim ve güçlü kontrol edilebilirlik gibi birçok avantajı nedeniyle, damlacık bazlı mikroakışkan teknolojisi, yüksek verimli mikrobiyal ekim, tarama ve evrim araştırmalarında kullanılan bu sorunların üstesinden gelebilir. Bununla birlikte, önceki çalışmaların çoğu laboratuvar yapımı ve uygulaması aşamasında kalmaktadır. Yüksek operasyonel gereksinimler, yüksek inşaat zorluğu ve otomatik entegrasyon teknolojisinin eksikliği gibi bazı önemli konular, mikrobiyal araştırmalarda damlacık mikroakışkan teknolojisinin geniş çapta uygulanmasını kısıtlamaktadır. Burada, damlacık mikroakışkan teknolojisine dayanan otomatik bir Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür sistemi (MMC) başarıyla geliştirildi ve mikrobiyal damlacık yetiştiriciliği sürecinin gerektirdiği aşılama, ekim, çevrimiçi izleme, alt ekim, sıralama ve örnekleme gibi fonksiyonların entegrasyonu sağlandı. Bu protokolde, vahşi tip Escherichia coli (E. coli) MG1655 ve metanol esansiyel bir E. coli suşu (MeSV2.2), MMC'nin otomatik ve nispeten yüksek verimli mikrobiyal ekim ve uyarlanabilir evrimi ayrıntılı olarak yürütmek için nasıl kullanılacağını tanıtmak için örnek olarak alınmıştır. Bu yöntemin kullanımı kolaydır, daha az emek ve reaktif tüketir ve geleneksel yetiştirme yöntemlerine kıyasla büyük avantajlara sahip olan yüksek deneysel verime ve iyi veri paralelliğine sahiptir. Bilimsel araştırmacıların ilgili mikrobiyal araştırmaları yürütmeleri için düşük maliyetli, operasyon dostu ve sonuç açısından güvenilir bir deneysel platform sağlar.

Bu protokol, MMC'de otomatik ve nispeten yüksek verim stratejisi ile mikrobiyal ekimi ve metanol esansiyel adaptif evrimi göstermek için örnek olarak E. coli MG1655 ve bir MeSV2.2 suşu kullanır. Büyüme eğrisi ölçümü esas olarak mikrobiyal ekimi karakterize etmek için kullanılmıştır. Adaptif evrim, otomatik sürekli alt ekimle gerçekleştirildi ve her bir alt yetiştirme sırasında seçici basınç olarak yüksek konsantrasyonda metanol eklendi. Uyarlanabilir evrimin gerçekleşip gerçekleşm...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC at JoVE.com

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC

Bu protokol, otomatik mikrobiyal yetiştirme ve uyarlanabilir evrim yürütmek için Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültürü sisteminin (MMC) nasıl kullanılacağını açıklamaktadır. MMC, mikroorganizmaları otomatik ve sürekli olarak yetiştirebilir ve alt yetiştirebilir ve nispeten yüksek verim ve iyi paralelleştirme ile büyümelerini çevrimiçi olarak izleyebilir, işçiliği ve reaktif tüketimini azaltabilir.

Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür Sistemi (MMC) kullanılarak Otomatik Mikrobiyal Yetiştirme ve Uyarlanabilir Evrim

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and ...

Bu yöntem, geleneksel mikrobiyal yetiştirme yöntemleriyle ilgili sorunların çözülmesine yardımcı olabilir. Otomatik mikrobiyal yetiştirme ve uyarlanabilir evrim için düşük maliyetli, operasyon dostu ve sonuç açısından güvenilir bir deneysel platform sağlar. Bu teknoloji operasyonları otomatikleştirir ve işgücü tüketimini daha da azaltır.Ve aynı zamanda, güvenilir sonuçlar ve basit işlemlerle iyi bir kültür performansına sahiptir. Teknoloji esas olarak büyüme eğrisi ölçümü, uyarlanabilir laboratuvar evrimi ve tek faktörlü çok seviyeli analiz gibi mikrobiyoloji araştırma alanlarında kullanılmaktadır. Şırınga iğnesini 0.41 milimetre iç çapa ve 0.71 milimetre dış çapa hızlı bir konektör A ve reaktif şişesine bağlayarak deneyin hazırlıklarına başlayın.Daha sonra tüm ekipmanı 15 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklav yapın. Mikroakışkan çipi takmak için, operasyon odasının kapısını açın ve optik fiber probu kaldırın. Elektrik alan deliklerini iğnelerle hizaladıktan sonra, çipi yavaşça talaş kaidesine yerleştirin, ardından iki konumlandırma sütununu konumlandırma deliklerine yerleştirin ve optik fiber probu yerleştirin.Daha sonra, çip üzerindeki hızlı A konektörünü, makalede açıklandığı gibi konum numarasına göre mikrobiyal mikrodamlacık kültür sisteminin veya MMC'nin ilgili portuna bağlayın. İşiniz bittiğinde, operasyon odasının kapısını kapatın. 10 mililitre başlangıç bakteri çözeltisi elde etmek için kültürlenmiş Escherichia coli MG1655 süspansiyonunu 0.05 ila 0.1 OD600 arasında bir OD600 ile seyreltin.MMC'yi başlatmak için, Başlatma sekmesini tıklatın. Başlatma arayüzü göründüğünde, yetiştirme sıcaklığını 37 santigrat derece ve fotoelektrik sinyal değerini 0,6 olarak ayarlayın. Başlatma yaklaşık 20 dakika sürecektir.Daha sonra, temiz tezgahın üzerine sterilize edilmiş bir reaktif şişesi yerleştirin ve kapağı sıkın. Şırınga iğnesinden yan tüpe kadar üç ila beş mililitre MMC yağını reaktif şişesine enjekte etmek için 10 mililitrelik steril bir şırınga kullanın. Ardından, yağın iç duvara tamamen sızmasını sağlamak için reaktif şişesini yavaşça eğin ve döndürün.Şişeye beş mililitre ilk bakteri çözeltisi enjekte ettikten sonra, beş ila yedi mililitre MMC yağı enjekte ederek reaktif şişesini doldurun. Reaktif şişesinin bağımsız hızlı konektörü A'yı çıkarın ve numune enjeksiyon işlemini tamamlamak için hızlı A konektörünü şişenin hızlı B konektörüne takın. İşiniz bittiğinde, reaktif şişesini metal banyoya koymak için operasyon odasının kapısını açın.Çipin C2 konektörünü ve reaktif şişesinin hızlı A konektörünü dışarı çekin. Reaktif şişesinin yan boru konektörünü C2 konektörüne ve üst boru konektörünü O2 konektörüne bağlayın. Ardından operasyon odasının kapısını kapatın.Büyüme eğrisi ölçümünün işlevini seçmek için, parametre ayarı arayüzünde Büyüme Eğrisi'ne tıklayın, sayıyı 15 olarak girin. Ardından OD algılama anahtarını açın ve dalga boyunu 600 nanometre olarak ayarlayın. Damlacık oluşturmaya başlamak için Başlat sekmesine tıklayın.İşlemin tamamlanması 15 dakika sürecektir. Ana arayüzde bir mesaj isteyen bir açılır pencere göründüğünde, reaktif şişesini çıkarmak ve C2 ve O2 konektörlerini bağlamak için işlem odasının kapısını açın. Kapıyı kapattıktan sonra, damlacıkları otomatik olarak yetiştirmek ve OD değerlerini tespit etmek için açılır penceredeki OK düğmesine tıklayın.Büyüme eğrisi durağan aşamaya ulaştığında, OD verilerini dışa aktarmak için Veri Dışa Aktarma düğmesini tıklatın. Veri kaydetme yolunu seçin ve yetiştirme döneminde kaydedilen OD değerini CVS biçiminde dışa aktarın Büyüme eğrisini çizmek için Excel ve Origin 9.0 gibi haritalama yazılımları kullanın. İlk bakteri çözeltisinin, taze ortamın ve MMC yağının gerekli hacimlerini, daha önce açıklandığı gibi taze ortamda ilk bakteri çözeltisi için ayrı sterilize edilmiş reaktif şişelerine enjekte edin.Uyarlanabilir evrimin işlevini seçmek için, yazılımdaki ALES'e tıklayın. Parametre ayarı arayüzünde, OD algılama anahtarını açın, ardından makalede açıklanan tüm parametreleri ayarlayın ve damlacık oluşturmaya başlamak için Başlat sekmesine basın. İşlem yaklaşık 25 dakika sürecektir.Her alt yetiştirme döneminde, damlacıkların maksimum OD değerlerinin önemli ölçüde artıp artmadığını gözlemleyin. Artış gerçekleşirse ve deneme gereksinimlerini karşılıyorsa, OD verilerini dışa aktarmak için veri dışa aktarma düğmesine tıklayın. Hedef damlacıkları MMC'den çıkarmak için, damlacık çıkarma işlevini seçmek üzere tarama sekmesine tıklayın.Ardından Topla seçeneğini seçin ve hedef damlacıkların sayısını tıklayın. İşiniz bittiğinde, Tamam'a tıklayın. Açılır pencerenin bir mesaj istemesini bekleyin. Ardından CF hızlı konektörünü toplama için mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve Tamam'a tıklayın. Yazılım arabirimi bir mesaj isteyen yeni bir pencere açtığında bir ila iki dakika sonra, CF hızlı bağlayıcısını geri takın ve MMC'nin çalışmaya devam etmesini sağlamak için Tamam'a tıklayın.Bir sonraki hedef damlacık damlacık tanıma alanına ulaştığında, daha önce belirtildiği gibi toplayın. Damlacığı çıkarmak ve 90 milimetrelik katı bir plakaya yerleştirmek için 2,5 mikrolitrelik bir pipet kullanın, ardından damlayı üç santimetre yan uzunluğa sahip cam üçgen kaplı bir çubukla eşit şekilde yayın, ardından damlayı 72 saat boyunca 37 santigrat derece sabit sıcaklık inkübatöründe yetiştirin. Daha sonra, dakikada 200 rotasyonda ve 48 ila 72 saat boyunca 37 santigrat derecede sallanan bir inkübatörde 10 mililitre taze ortam içeren 50 mililitrelik bir sallama şişesinde her bir koloniyi ayrı ayrı yetiştirmek için üç ila beş bağımsız bakteri kolonisi seçin.Kuluçkadan sonra, kültürlenmiş bakteri çözeltisini gliserol tüpünde depolamak için ilgili standart düzenlemeleri izleyin. Temsili analiz, tüm adaptif evrim sürecinde 50 damlacığın büyüme eğrilerini göstermektedir. Metanol esansiyel Escherichia coli suşu veya MeSV2.2'nin başlangıçta yavaş büyüme gösterdiği ve ardından hızlı büyüme gösterdiği gözlendi.Tüm adaptif evrim sürecindeki damlacık altısının büyüme eğrisi ayrı ayrı çizildi. İlk nesildeki maksimum OD600 değeri 0.37 idi, bu da son alt yetiştirme döneminde 0.58'e yükseldi, bu da damlacık altıdaki suşun bariz bir adaptif evrim gerçekleştirdiğini gösteriyor. Ayrıca, damlacık altı suşu ve başlangıç geriniminin büyüme eğrileri karşılaştırıldı.Damlacık altı suşu, sabit fazda ilk suştan daha yüksek bir maksimum spesifik büyüme hızı ve hücre konsantrasyonu sergiledi. En önemli şey, alet çipinin ve reaktif şişesinin bağlantısının doğru olduğundan emin olmaktır, bu da işlemlerin normal şekilde ilerlemesi için damlacıklardır. Bu yöntem, araştırmacılara mikroorganizmaların yetiştirilmesi için yeni bir fikir verir ve aynı zamanda suşların uyarlanabilir evrimi için verimli ve düşük maliyetli bir platform sağlar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC)

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Tek kullanımlık Pnömatik Biyoreaktör Sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Bir Çok Kanallı Çift elektrik alan mikroakışkan Chip kullanarak Akciğer Kanseri Hücreleri Electrotaxis Çalışmaları

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

Çeşitli mikrobiyal Toplulukları Yüksek Yoğunluklu Yetiştirme için Yeni Bir Biyoreaktör

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Mikrobiyal optogenetic Uygulamaları Tasarım ve Otomatik Aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme Sistemi Uygulaması

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Bir Mikro Kuyruklu Dizi Platformunda Mikrobik Topluluk Geliştirmenin Montajı ve Takibi

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Metaorganizma Araştırma ve Koruma için Biyoremediasyon ve Probiyotikler Gelişimi için Mikrobiyal Suşların Prospektileri

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Çin Hamster Yumurtalık Hücre Yetiştiriciliğinde Yüksek İş-İş BulaMetli Otomatik Mikro-Biyoreaktörler Kullanılarak Proses Optimizasyonu

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Kontrollü, Dinamik Kimyasal Manzaralar Üretmek

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Pseudomonas syringae pv Direnci yüksek-Throughput Tanımlama. Fide Sel Asası Kullanarak Domates

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...