Name: imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography at JoVE.com

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مراسلون بلا حدود (المنحة #17-15-01290) و RFBR (المنحة #19-015-00273). يشكر المؤلفون برنامج تطوير جامعة لومونوسوف الحكومية في موسكو (PNR 5.13) ومركز نيكون للتميز في التصوير المرتبط في معهد بيلوزيرسكي للبيولوجيا الفيزيائية والكيميائية للوصول إلى أجهزة التصوير.

تم تحسين البروتوكول للخلايا الملتصقة وتم اختباره على خطوط خلايا HeLaو HT1080 و CHO.
1. وضع العلامات على الخلايا وتثبيتها
<ol><li>ضعي خلايا الطبق على أغطية مطحوضة التنظيف في طبق بتري بطول 3 سم. تنمو الخلايا في الوسائط الموصى بها لخط الخلية المستخدم في التقاء بنسبة 70٪.</li>
	<li>أضف...

<ol>
	<li>Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicating+large+genomes:+divide+and+conquer.">Replicating large genomes: divide and conquer.</a> Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).</li><li>M&#233;chali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+DNA+replication+origins:+Many+choices+for+appropriate+answers.">Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers.</a> Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).</li><li>Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+DNA+replication.">Organization of DNA replication.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).</li><li>Su, Q. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+reveals+spatiotemporal+propagation+of+human+replication+foci+mediated+by+CTCF-organized+chromatin+structures.">Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).</li><li>Leonhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+factories+in+living+cells.">Dynamics of DNA replication factories in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).</li><li>Philimonenko, A. A., Hodn&#253;, Z., Jackson, D. A., Hoz&#225;k, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microarchitecture+of+DNA+replication+domains.">The microarchitecture of DNA replication domains.</a> Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).</li><li>Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organizations+of+replicon+domains+during+DNA+synthetic+phase+in+the+mammalian+nucleus.">Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus.</a> Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+DNA+replication+sites+in+mammalian+cells.">Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).</li><li>Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+early+and+late+replicating+DNA+in+human+chromosome+territories.">Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories.</a> Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).</li><li>Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+three-dimensional+replication+patterns+during+the+S-phase,+analysed+by+double+labelling+of+DNA+and+confocal+microscopy.">Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy.</a> Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).</li><li>Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-like+chromatin:+Toward+understanding+the+real+chromatin+organization+present+in+the+cell.">Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell.</a> Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).</li><li>Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+early+chromosome+condensation:+A+hierarchical+folding,+axial+glue+model+of+chromosome+structure.">Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure.</a> Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).</li><li>Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+interphase+large-scale+chromatin+structure+from+analysis+of+engineered+chromosome+regions.">Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions.</a> Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 236 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation.">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li><li>Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChromEMT:+Visualizing+3D+chromatin+structure+and+compaction+in+interphase+and+mitotic+cells.">ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells.</a> Science. 357 (6349), (2017).</li><li>Hoz&#225;k, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+factories+and+nuclear+bodies:+the+ultrastructural+characterization+of+replication+sites+during+the+cell+cycle.">Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle.</a> Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).</li><li>Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+of+DNA+replication+reveals+dynamic+plasticity+of+large-scale+chromatin+fibers.">Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers.</a> Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+electron+microscopic+immunocytochemistry+with+silver-enhanced+1.4-nm+gold+particles+to+localize+GAD+in+the+cerebellar+nuclei.">The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).</li><li>Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+immunogold+labeling+confirms+large-scale+chromatin+folding+motifs.">In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs.</a> Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).</li><li>Sawada, H., Esaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nanogold+followed+by+silver+enhancement+and+gold+toning+for+preembedding+immunolocalization+in+osmium-fixed,+Epon-embedded+tissues.">Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freeze+substitution+fixation-based+gold+enlarging+technique+for+EM+studies+of+endocytosed+Nanogold-labeled+molecules.">A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).</li><li>Weipoltshammer, K., Sch&#233;fer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography.">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).</li></ol>

تتميز الطريقة الموضحة هنا بالعديد من المزايا مقارنة بالبروتوكولات المنشورة مسبقا. أولا ، إن استخدام Click-chemistry لوضع العلامات على الحمض النووي المكرر يلغي الحاجة إلى شرط تمسخ الحمض النووي للكشف عن BrdU بالأجسام المضادة ، وبالتالي الحفاظ على البنية الفائقة للكروماتين بشكل أفضل. 
<p class="jove_conten...

تكرار الحمض النووي هو عملية بيولوجية أساسية مطلوبة للنسخ الأمين ونقل المعلومات الوراثية أثناء انقسام الخلايا. في حقيقيات النوى الأعلى ، يخضع تكرار الحمض النووي لتنظيم مكاني وزماني ضيق ، والذي يتجلى في التنشيط المتسلسل لأصول النسخ المتماثل1. تشكل أصول النسخ المتماثل المجاورة التي تطلق بشكل متزامن مجموعات من النسخ المتماثلة2. على مستوى المجهر الضوئي ، يتم الكشف عن مواقع تكرار الحمض النووي المستمر كبؤر تكرار مختلفة العدد والأحجام. تعرض بؤر النسخ المتماثل أنماطا محددة من التوزيع المكاني داخل نواة الخلية اعتمادا على توقيت تكرار الحمض النووي المسمى 3,4 ، والذي بدوره يرتبط ارتباطا وثيقا بنشاط جيناته. بفضل التسلسل المحدد جيدا لتكرار الحمض النووي ، الذي يتم ترتيبه بدقة في المكان والزمان ، يعد وضع العلامات التكرارية طريقة قوية لوضع العلامات الدقيقة على الحمض النووي ليس فقط لدراسة عملية النسخ المتماثل في حد ذاتها ، ولكن أيضا للتمييز بين جزء فرعي معين من الحمض النووي مع نشاط نسخ محدد ومستوى ضغط. عادة ما يتم تنفيذ تصور تكرار الكروماتين من خلال الكشف عن مكونات البروتين الرئيسية لآلات تكرار الحمض النووي (إما عن طريق التلطيخ المناعي أو عن طريق التعبير عن علامات البروتين الفلورسنت5,6) أو عن طريق دمج سلائف تخليق الحمض النووي المعدلة 7,8,9,10 . من بين هذه الطرق ، فقط الطرق القائمة على دمج النيوكليوتيدات المعدلة في الحمض النووي المكرر حديثا تسمح بالتقاط التغيرات التوافقية في الكروماتين أثناء النسخ المتماثل ، وتتبع سلوك المجالات التكرارية بعد اكتمال تكرارها.
في حقيقيات النوى الأعلى ، يضيف تغليف الحمض النووي في الكروماتين مستوى آخر من التعقيد إلى تنظيم الوظائف الوراثية الأساسية (النسخ ، النسخ المتماثل ، الجبر ، إلخ). يؤثر طي الكروماتين على إمكانية وصول الحمض النووي إلى العوامل التنظيمية العابرة والتغيرات التوافقية للحمض النووي (فك الحلزون المزدوج) المطلوبة لتوليف القالب. لذلك ، من المقبول عموما أن العمليات الاصطناعية المعتمدة على الحمض النووي في نواة الخلية تتطلب انتقالا هيكليا للكروماتين من حالته القمعية المكثفة إلى تشكيل أكثر سهولة وانفتاحا. من الناحية الخلوية ، يتم تعريف هاتين الحالتين الكروماتين على أنهما heterochromatin و euchromatin. ومع ذلك ، لا يوجد حتى الآن توافق في الآراء بشأن طريقة طي الحمض النووي في النواة. تتراوح الفرضيات من نموذج "ذوبان البوليمر"11 ، حيث تتصرف الألياف النووية كبوليمر عشوائي يتم التحكم في كثافة التعبئة له بواسطة آليات فصل الطور ، إلى نماذج قابلة للطي هرمية تفترض التكوين المتسلسل للهياكل الشبيهة بألياف الكروماتين ذات السماكة المتزايدة12,13. اكتسبت نماذج الطي الهرمي مؤخرا دعما من النهج الجزيئية القائمة على تحليل اتصالات الحمض النووي والحمض النووي في الموقع (التقاط تشكيل الكروموسومات ، 3C) ، مما يدل على وجود التسلسل الهرمي للمجالات الهيكلية للكروماتين14. من المهم ملاحظة أن وحدات النسخ المتماثل ترتبط ارتباطا جيدا بمجالات الكروماتين هذه15. ويستند النقد الرئيسي لهذه النماذج إلى تجميع الكروماتين الاصطناعي المحتمل الناجم عن إجراءات إعداد العينات، مثل تخلل أغشية الخلايا وإزالة المكونات غير الكروماتينية، من أجل تحسين تباين الكروماتين للدراسات فوق الهيكلية مع تحسين إمكانية الوصول إلى الكروماتين لمختلف المجسات (مثل الأجسام المضادة). وقد سمحت التطورات التقنية الحديثة في تلطيخ الحمض النووي الانتقائي للفحص المجهري الإلكتروني عن طريق الأكسدة الضوئية بوساطة الفلوروفور المرتبطة بالحمض النووي للديامينوبينزيدين (ChromEMT6) بإزالة هذه العقبة. ومع ذلك ، فإن نفس الاعتبارات تنطبق على تصور المجهر الإلكتروني لتكرار الحمض النووي17,18. هنا نصف تقنية تسمح برسم خرائط فوق هيكلية عالية الدقة في وقت واحد للحمض النووي المركب حديثا والكروماتين الكلي في الخلايا المتقاطعة مع الألدهيد السليمة. تجمع هذه التقنية بين الكشف عن الحمض النووي المسمى EdU بواسطة Click-chemistry مع مجسات البيوتينيل والستربتافيدين نانوغولد و ChromEMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555-azide</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>A20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>C3730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Boval</td>
			<td>LY-0080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>26544-38-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90-72-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin monomer</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90529-77-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25%, EM Grade)</td>
			<td>TED PELLA, INC</td>
			<td>18426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>258850010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141396.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>213462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>25134-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver lactate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>359750-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>S11223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Nanogold conjugate</td>
			<td>Nanoprobes</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrachloroauric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>HT1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L</td>
			<td>298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka Chemica</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper single slot grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Cy5 HQ</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife Ultra Wet 45o</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DU</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-tilt sample holder</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Multi Bio RS-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer</td>
			<td>Jeol</td>
			<td>JEM-2100</td>
			<td>Alternatives: FEI, Hitachi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UltraCut-E</td>
			<td>Alternatives: RMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography

لا تزال مبادئ طي الحمض النووي في نواة الخلية وتحولاتها الديناميكية التي تحدث أثناء تحقيق الوظائف الجينية الأساسية (النسخ ، النسخ ، التكرار ، الفصل ، إلخ) غير مفهومة بشكل جيد ، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود مناهج تجريبية للتصور عالي الدقة لمواقع كروماتين محددة في النوى المحفوظة هيكليا. نقدم هنا بروتوكولا لتصور المجالات التكرارية في زراعة الخلايا أحادية الطبقة في الموقع ، من خلال الجمع بين وضع العلامات EdU للحمض النووي المركب حديثا مع الكشف اللاحق عن الملصقات مع تضخيم Ag لجزيئات Nanogold وتلطيخ ChromEM للكروماتين. يسمح هذا البروتوكول بوضع العلامات قبل التضمين عالية التباين والكفاءة العالية ، والمتوافقة مع تثبيت الجلوتارالدهيد التقليدي الذي يوفر أفضل حفظ هيكلي للكروماتين لمعالجة العينات في درجة حرارة الغرفة. ميزة أخرى لوضع العلامات قبل التضمين هي إمكانية التحديد المسبق للخلايا ذات الأهمية للتقسيم. هذا مهم بشكل خاص لتحليل مجموعات الخلايا غير المتجانسة ، وكذلك التوافق مع نهج التصوير المقطعي الإلكتروني لتحليل 3D عالي الدقة لتنظيم الكروماتين في مواقع النسخ المتماثل ، وتحليل إعادة ترتيب الكروماتين بعد النسخ المتماثل وفصل الكروماتيد الشقيق في الطور البيني.

تعرض بؤر النسخ المتماثل في نوى خلايا الثدييات أنماطا متميزة من التوزيع داخل النواة اعتمادا على تقدم الطور S. ترتبط هذه الأنماط بنشاط النسخ للمواقع التي يتم تكرارها. نظرا لأن الطريقة المعروضة هنا تستخدم إجراء تثبيت قوي إلى حد ما ، فمن السهل إلى حد ما استخدام وسم النبض التكراري للكشف المحدد ?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography at JoVE.com

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

يقدم هذا البروتوكول تقنية لرسم خرائط عالية الدقة لمواقع النسخ المتماثل في الكروماتين المحفوظ هيكليا في الموقع والذي يستخدم مزيجا من التضمين المسبق لوضع العلامات على EdU-streptavidin-Nanogold و ChromEMT.

تصوير المجالات التكرارية في الكروماتين المحفوظ بالبنية الفائقة بواسطة التصوير المقطعي الإلكتروني

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

نقدم بروتوكولا للتصور المجهري الإلكتروني للمجالات التكرارية في الخلية عن طريق وضع علامة EdU على الحمض النووي المركب حديثا والكشف عن الملصقات مع تعزيز الفضة لجزيئات Nanogold وتلطيخ ChromEM للكروماتين. يوفر هذا البروتوكول وضع العلامات عالية التباين قبل التضمين مع تثبيت الجلوتارالدهيد التقليدي الذي يوفر أفضل حفظ هيكلي للكروماتين لمعالجة عينات درجة حرارة الغرفة. تم تحسين هذا البروتوكول لخلية الالتصاق التي تنمو على الأغطية في طبق Petri.أضف EdU إلى 10 مولات صغيرة التركيز النهائي ووضع الخلايا في الحاضنة لوقت وضع العلامات المطلوب. إصلاح الخلايا المصنفة مع 2.5 ٪ gluaradehydrate في محلول كاكوديلات الصوديوم 100 ملليمول لمدة ساعة واحدة. قد يؤثر وقت التثبيت الأطول سلبا على وضع العلامات على EdU.إزالة الجلوتارالدهيد عن طريق شطف العينات مع PBS تكميل مع خمسة ملليمول من كلوريد المغنيسيوم، ويعتبر كذلك نجم PBS. يغسل ثلاث مرات لمدة 10 دقائق. تخلل أغشية البلازما بمحلول 1٪ من Trione X-100 في نجم PBS ، وقم بإجراء تغييرين لمدة خمس دقائق لكل منهما.يشار إلى هذا الحل أيضا باسم PBS star T.Wide اغسل العينة بنجم PBS. خمسة تغييرات لمدة خمس دقائق لكل منهما. قم بإخماد مجموعات الألدهيد المتبقية مع 20 ملليمول من الجلايسين في نجم PBS ، مرتين لمدة 10 دقائق.ضع العينة في نجمة PBS مع 1٪ BSA لمدة نصف ساعة. أثناء الحظر في BSA ، قم بإعداد كوكتيل التفاعل للكشف عن EdU. ترتيب إضافة المكونات مهم.يتم إجراء اقتران EdU البيوتين-أزيد في الغرفة الرطبة لتقليل التبخر وتحولات التركيز في كوكتيل التفاعل. تحضير الغرفة الرطبة. ضع الغطاء على الطبقة شبه الغشاء مع خلية متجهة لأعلى وطبقة من 50 إلى 100 ميكرولتر من كوكتيل التفاعل على الغطاء.يستغرق التفاعل 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أوقف التفاعل عن طريق غسل العينة في نجم PBS T ، خمس مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. حظر مرة أخرى مع 1٪ BSA في نجم PBS T لمدة نصف ساعة أخرى.تحضير محلول ستربتافيدين-نانوغولد في PBS نجم T مع 1٪ BSA. احتضان العينة مع الستربتافيدين بين عشية وضحاها في زائد أربع درجات في غرفة رطبة أعدت حديثا. الإجراء هو نفسه كما هو الحال مع اقتران EdU البيوتين-أزيد.وقف التفاعل وغسل العينة، خمس مرات لمدة 10 دقائق لكل منها مع نجم PBS T.Stabilize البيوتين ستربتافيدين مجمع عن طريق تثبيت إضافي سوف 1٪ غلوتارالدهيد PBS نجم لمدة نصف ساعة. إزالة الجلوتارالدهيد عن طريق الغسيل المكثف بالماء منزوع الأيونات. إخماد مجموعات الألدهيد المتبقية مع ملليغرام واحد لكل ملليلتر بوروهيدريد الصوديوم.يغسل مرة أخرى جيدا. الخطوة التالية هي زيادة حجم جزيئات Nanogold عن طريق ترسب الفضة على المسار الذهبي. تحضير الخلطات المسبقة لتقليل نشاط الغرفة المظلمة.قم بموازنة العينات باستخدام مخزن الغسيل المؤقت وانتقل إلى غرفة مظلمة. في الغرفة المظلمة ، امزج المكونات لإعداد محلول الغسيل وتطبيقه على العينات. محلول مسحوق السنط هو اللمحات العالية.لذلك أثناء خلط المكونات ، قم بهز الأنبوب ببطء لتجنب تكوين الفقاعة والرغوة. يستغرق التفاعل من دقيقتين إلى خمس دقائق. نوصي بإجراء تشغيل تجريبي لتحديد وقت رد الفعل الأمثل.قد يؤدي وقت الحضانة الأطول إلى ترسب فضة غير محدد. لوقف التفاعل ، اشطف العينة بسرعة مع ثلاثة إلى خمسة تغييرات في الماء منزوع الأيونات. تليها ثلاثة تغييرات أخرى لمدة خمس دقائق لكل منهما.لحماية جسيمات الفضة النانوية من الذوبان بواسطة رابع أكسيد الأوزميوم ، احتضن العينات في 0.05٪ من حمض رباعي الكلورويوريك لمدة دقيقتين في الظلام. يغسل جيدا بالماء منزوع الأيونات. في هذه المرحلة ، يتم إضافة تباين إضافي إلى المواد التي تحتوي على الحمض النووي.تشبع العينة بصبغة الحمض النووي DRAQ5. أضف محلول دياميونوبينزيدين إلى العينة واحتضنه لمدة دقيقة واحدة. حرك الغطاء في طبق بتري الزجاجي السفلي ، وضعه على مسرح المجهر المقلوب.تشعيع العديد من مجالات الرؤية بضوء أحمر 640 نانومتر. تعرض اللوحة اليسرى تبييض الصور بالكامل ل DRAQ5. على اللوحة اليمنى ، يتم تصوير نفس مجال الرؤية في الضوء المرسل الذي يظهر راسب DAB.اغسل العينات بالماء منزوع الأيونات. يجب تنفيذ المرحلة التالية تحت غطاء الدخان. أعدت جزئيا انخفاض محلول رابع أكسيد الأوزميوم.انتبه. هذه المادة شديدة التقلب والسمية. ضع المحلول المحضر على العينة.في هذه المرحلة ، تتفاعل مركبات الأوزميوم المخفضة مع ترسبات دياميونوبينزيدين وتزيد من تباين الحمض النووي. تخلص من محلول يحتوي على الأوزميوم وفقا للوائحك المحلية واغسل العينات ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. يتم تجفيف العينة بشكل أكبر في سلسلة من تركيزات الإيثانول المتزايدة تليها تسلل الخلايا مع مزيج راتنج الإيثانول.استبدل مزيج راتنج الكحول بالراتنج النقي الطازج. املأ قالب التضمين ذو الحجم المناسب براتنج طازج. ضع الغطاء مع خلية متجهة لأسفل فوق التجويف المملوء بالراتنج.علاج الراتنج لمدة 24 ساعة في 37 درجة. ثم عند 60 درجة لمدة يومين على الأقل. إزالة الراتنج من السطح السفلي للأغطية.أسقط البلاطة في نيتروجين سائل ثم انقلها إلى الماء المغلي. يجب فصل الزجاج. كرر ذلك إذا لزم الأمر.يجب أن تكون مجالات الرؤية المشععة مرئية بوضوح بسبب ترسب دياميونوبينزيدين وتلطيخ DAB. اقطع منطقة الاهتمام من البلاطة باستخدام المنشار أو أي أداة مناسبة أخرى. ضع القاطع في حامل الميكروتوم البسيط.قم بإعداد ultramicrotome لتشذيب الكتلة النهائية. باستخدام شفرة الحلاقة ، قم بإعداد بيليه على شكل هرم. يجب أن يكون حجم المنطقة المسطحة على قمة الهرم حوالي 400 × 200 ميكرون.قم بتركيب الهرم المحضر في ذراع ultramicrotome وقم بتثبيت السكين. إعداد الأقسام. يمكن تعديل سمك القسم ليناسب المتطلبات التجريبية.نحن نهدف إلى التصوير المقطعي EM. لذلك قمنا بإعداد مقاطع بسماكة 250 نانومتر يشار إليها أيضا باسم الأقسام شبه الرقيقة. افصل الأقسام من حافة السكين وقم بتركيبها على شبكة فتحة.استخدمنا شبكة فتحات ، كانت مستديرة ملليمتر واحد لتكون حولها ، فتحة جانبية ملليمتر واحد. يوفر حجم الفتحة الصغير استقرارا أفضل للأقسام. دع العينات تجف على الشبكة.في هذه اللحظة ، الأقسام جاهزة للمراقبة. ضع الشبكة في حامل عينة المجهر الإلكتروني. قم بتحميل العينة في المجهر الإلكتروني.الحصول على سلسلة الإمالة. تعرض بؤر النسخ المتماثل في نوى خلايا الثدييات أنماطا متميزة من التوزيع اعتمادا على تقدم الطور S. يوضح تصنيف EdU الناجح الذي أكده تفاعل النقر باستخدام أزيد المسمى بالفلورسنت نمط النسخ المتماثل النموذجي في مجموعة الخلايا غير المتجانسة بعد تثبيت الجلوتارالدهيد في الأعلى.يمكن أن يتأثر وضع العلامات على الستربتافيدين بالغوتارالدهيد. لذا تحقق أولا من تلطيخ الستربتافيدين الفلوري تحت نفس حالة الستربتافيدين نانوغولد في القاع. النتيجة الجيدة لإجراء تحسينات الفضة هي تلطيخ بني داكن لبعض النوى وبقعة زرقاء صفراء باهتة للغاية ، كما هو موضح في الأسفل.ميزة وضع العلامات قبل التضمين هي إمكانية تحديد خلايا للتقسيم. من الممكن في هذه المرحلة لأن أنماط وضع العلامات تصبح مرئية تحت مجهر حقل مشرق. ينتج عن وضع العلامات المناسبة مواقع النسخ المتماثل المحددة جيدا.يظهر رأس السهم ألياف الكروماتين الملطخة DAB. يقتصر وضع العلامات الخلفية على اليمين على عدد قليل من الجسيمات النانوية لكل ميكرون مربع. الأقسام شبه الرقيقة جاهزة للتصوير المقطعي ولا تتطلب إضافة جسيمات الذهب النانوية.النهج الموصوف المستخدم في دراسات تنظيم الكروماتين في المواقع ذات النسخ المتماثل الممكن. لتحليل إعادة ترتيب الكروماتين بعد النسخ المتماثل بما في ذلك التصوير عالي الدقة لفصل الكروماتين. كما أنه يستخدم لوضع العلامات المكررة على المجالات الكروموسومية الكبيرة ودراسات طي الكروماتين الأعلى رتبة و heterochromatin.تقنية التصوير هذه مهمة أيضا كنقطة مرجعية للبيانات الناتجة عن النهج الأخرى غير المجهرية. يمكن أيضا استيعاب هذه الطريقة في الدراسات المجهرية المرتبطة بما في ذلك تقنيات الدقة الفائقة. هذا يفتح آفاقا جديدة في دراسات بنية الكروماتين ذات الترتيب الأعلى وديناميكياتها في الحالات الفسيولوجية المختلفة للخلية.

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

التصور من ATP سينسيز Dimers في الميتوكوندريا بواسطة الكترون البرد المقطعي

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

عزل المناطق الجينوم محددة وتحديد أسوشيتد الجزيئات التي enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

إعداد ومراقبة العينات البيولوجية سميكة من قبل الضوئي نقل الإلكترون التصوير المقطعي

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

نموذج إعداد وتصوير اكسوسوميس مجهر إلكتروني

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D أولتراستروكتوري الميتوكوندريا عضلة الرحلات غير المباشرة المورفولوجية كشفت عن طريق التصوير المقطعي الإلكترون المسلسل-القسم

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

التصور للضغط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء بالتصوير المقطعي الفولت العالي Cryo-إلكترون

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

طريقة CryoAPEX لتحليل المجهر الإلكتروني لتوطين بروتين الغشاء داخل الخلايا المحفوظة فائقة الهيكلية

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...