Name: imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af RSF (bevilling nr. 17-15-01290) og RFBR (bevilling nr. 19-015-00273). Forfatterne takker Lomonosov Moscow State University udviklingsprogram (PNR 5.13) og Nikon Center of Excellence i korrelativ billeddannelse ved Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology for adgang til billeddannelsesinstrumentering.

Protokollen er optimeret til klæbende celler og blev testet på HeLa-, HT1080- og CHO-cellelinjer.
1. Cellemærkning og fiksering
<ol><li>Pladeceller på syrerengjorte dæksedler i en 3 cm petriskål. Dyrk cellerne i de medier, der anbefales til cellelinjen, der bruges til 70% sammenflyd.</li>
	<li>Der tilsættes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridin) fra 10 mM stam til 10 μM endelig koncentration, og cellerne anbrings i inkubatoren i 10 minutter eller længere (afhængigt af fors...

<ol>
	<li>Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicating+large+genomes:+divide+and+conquer.">Replicating large genomes: divide and conquer.</a> Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).</li><li>M&#233;chali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+DNA+replication+origins:+Many+choices+for+appropriate+answers.">Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers.</a> Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).</li><li>Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+DNA+replication.">Organization of DNA replication.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).</li><li>Su, Q. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+reveals+spatiotemporal+propagation+of+human+replication+foci+mediated+by+CTCF-organized+chromatin+structures.">Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).</li><li>Leonhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+factories+in+living+cells.">Dynamics of DNA replication factories in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).</li><li>Philimonenko, A. A., Hodn&#253;, Z., Jackson, D. A., Hoz&#225;k, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microarchitecture+of+DNA+replication+domains.">The microarchitecture of DNA replication domains.</a> Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).</li><li>Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organizations+of+replicon+domains+during+DNA+synthetic+phase+in+the+mammalian+nucleus.">Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus.</a> Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+DNA+replication+sites+in+mammalian+cells.">Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).</li><li>Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+early+and+late+replicating+DNA+in+human+chromosome+territories.">Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories.</a> Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).</li><li>Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+three-dimensional+replication+patterns+during+the+S-phase,+analysed+by+double+labelling+of+DNA+and+confocal+microscopy.">Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy.</a> Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).</li><li>Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-like+chromatin:+Toward+understanding+the+real+chromatin+organization+present+in+the+cell.">Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell.</a> Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).</li><li>Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+early+chromosome+condensation:+A+hierarchical+folding,+axial+glue+model+of+chromosome+structure.">Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure.</a> Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).</li><li>Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+interphase+large-scale+chromatin+structure+from+analysis+of+engineered+chromosome+regions.">Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions.</a> Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 236 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation.">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li><li>Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChromEMT:+Visualizing+3D+chromatin+structure+and+compaction+in+interphase+and+mitotic+cells.">ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells.</a> Science. 357 (6349), (2017).</li><li>Hoz&#225;k, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+factories+and+nuclear+bodies:+the+ultrastructural+characterization+of+replication+sites+during+the+cell+cycle.">Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle.</a> Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).</li><li>Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+of+DNA+replication+reveals+dynamic+plasticity+of+large-scale+chromatin+fibers.">Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers.</a> Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+electron+microscopic+immunocytochemistry+with+silver-enhanced+1.4-nm+gold+particles+to+localize+GAD+in+the+cerebellar+nuclei.">The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).</li><li>Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+immunogold+labeling+confirms+large-scale+chromatin+folding+motifs.">In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs.</a> Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).</li><li>Sawada, H., Esaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nanogold+followed+by+silver+enhancement+and+gold+toning+for+preembedding+immunolocalization+in+osmium-fixed,+Epon-embedded+tissues.">Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freeze+substitution+fixation-based+gold+enlarging+technique+for+EM+studies+of+endocytosed+Nanogold-labeled+molecules.">A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).</li><li>Weipoltshammer, K., Sch&#233;fer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography.">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).</li></ol>

Metoden beskrevet her har flere fordele i forhold til tidligere offentliggjorte protokoller. For det første eliminerer brugen af Click-kemi til mærkning af replikeret DNA nødvendigheden af DNA-denatureringsforudsætning for BrdU-påvisning med antistoffer, hvilket bedre bevarer kromatin ultrastruktur. 
For det andet minimerer udnyttelsen af biotin som en sekundær ligand, der genereres efter glutaraldehydfiksering og korrekt slukning af ubundne aldehydgrupper, kemisk modifikation af målet,...

DNA-replikation er en grundlæggende biologisk proces, der kræves for trofast kopiering og transmission af den genetiske information under celledeling. I højere eukaryoter udsættes DNA-replikation for tæt rumlig-tidsmæssig regulering, hvilket manifesteres i sekventiel aktivering af replikationsoprindelse1. Nabo replikation oprindelser affyring synkront danner klynger af replikoner2. På niveau med optisk mikroskopi detekteres steder med igangværende DNA-replikation som replikationsfokus af forskellig antal og størrelse. Replikationsfoci viser specifikke mønstre af rumlig fordeling i cellekernen afhængigt af replikationstidspunktet for det mærkede DNA 3,4, som igen er tæt korreleret med dets genaktivitet. Takket være veldefineret sekvens af DNA-replikation, strengt ordnet i rum og tid, er replikativ mærkning en kraftfuld metode til præcis DNA-mærkning ikke kun til undersøgelse af replikationsprocessen i sig selv, men også til at diskriminere en specifik DNA-underfraktion med defineret transkriptionsaktivitet og komprimeringsniveau. Visualisering af replikerende kromatin udføres normalt ved påvisning af vigtige proteinkomponenter i DNA-replikationsmaskiner (enten ved immunstainering eller ved ekspression af fluorescerende proteinmærker 5,6) eller ved inkorporering af modificerede DNA-synteseprækursorer 7,8,9,10 . Af disse er det kun metoder baseret på inkorporering af modificerede nukleotider i nyligt replikeret DNA, der muliggør indfangning af konformationsændringer i kromatin under replikation og sporer opførelsen af repliktive domæner, efter at deres replikation er afsluttet.
I højere eukaryoter tilføjer DNA-emballering i kromatin et andet niveau af kompleksitet til reguleringen af grundlæggende genetiske funktioner (transkription, replikation, reparation osv.). Kromatinfoldning påvirker DNA's tilgængelighed til regulatoriske transfaktorer og DNA-konformationsændringer (dobbelt helix-afvikling), der kræves til skabelonsyntesen. Derfor er det almindeligt accepteret, at DNA-afhængige syntetiske processer i cellekernen kræver en strukturel overgang af kromatin fra dets kondenserede, undertrykkende tilstand til en mere tilgængelig, åben konformation. Cytologisk defineres disse to kromatintilstande som heterochromatin og euchromatin. Der er dog stadig ingen konsensus om tilstanden af DNA-foldning i kernen. Hypoteserne spænder fra en "polymersmelte" model11, hvor nukleosomal fiber opfører sig som en tilfældig polymer, for hvilken pakningstætheden styres af faseseparationsmekanismer, til hierarkiske foldemodeller, der postulerer sekventiel dannelse af kromatinfiberlignende strukturer med stigende tykkelse12,13. Hierarkiske foldemodeller fik for nylig støtte fra molekylære tilgange baseret på analysen af in situ DNA-DNA-DNA-kontakter (kromosomkonformationsfangst, 3C), der demonstrerer eksistensen af hierarkiet af kromatinstrukturelle domæner14. Det er vigtigt at bemærke, at replikationsenheder korrelerer meget godt med disse kromatindomæner15. Den største kritik af disse modeller er baseret på potentiel kunstig kromatinaggregering forårsaget af prøveforberedelsesprocedurer, såsom permeabilisering af cellemembraner og fjernelse af ikke-kromatinkomponenter, for at forbedre kromatinkontrasten til ultrastrukturelle undersøgelser og samtidig forbedre kromatintilgængeligheden for forskellige sonder (f.eks. Antistoffer). Nylige tekniske fremskridt inden for selektiv DNA-farvning til elektronmikroskopi ved DNA-bindende fluorofor-medieret fotooxidation af diaminobenzidin (ChromEMT6) har gjort det muligt at fjerne denne hindring. De samme overvejelser gælder dog for elektronmikroskopivisualisering af replikerende DNA 17,18. Her beskriver vi en teknik, der muliggør samtidig ultrastrukturel kortlægning i høj opløsning af nysyntetiseret DNA og total kromatin i intakte aldehyd-tværbundne celler. Teknikken kombinerer påvisning af EdU-mærket DNA ved click-kemi med biotinylerede sonder og streptavidin-nanogold og ChromEMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555-azide</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>A20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>C3730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Boval</td>
			<td>LY-0080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>26544-38-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90-72-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin monomer</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90529-77-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25%, EM Grade)</td>
			<td>TED PELLA, INC</td>
			<td>18426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>258850010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141396.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>213462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>25134-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver lactate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>359750-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>S11223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Nanogold conjugate</td>
			<td>Nanoprobes</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrachloroauric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>HT1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L</td>
			<td>298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka Chemica</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper single slot grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Cy5 HQ</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife Ultra Wet 45o</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DU</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-tilt sample holder</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Multi Bio RS-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer</td>
			<td>Jeol</td>
			<td>JEM-2100</td>
			<td>Alternatives: FEI, Hitachi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UltraCut-E</td>
			<td>Alternatives: RMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography

Principper for DNA-foldning i cellekernen og dens dynamiske transformationer, der forekommer under opfyldelsen af grundlæggende genetiske funktioner (transkription, replikation, adskillelse osv.), Forbliver dårligt forstået, delvis på grund af manglen på eksperimentelle tilgange til visualisering i høj opløsning af specifikke kromatinlodi i strukturelt bevarede kerner. Her præsenterer vi en protokol til visualisering af repliktive domæner i monolagscellekultur in situ ved at kombinere EdU-mærkning af nysyntetiseret DNA med efterfølgende etiketdetektion med Ag-amplifikation af Nanogold-partikler og ChromEM-farvning af kromatin. Denne protokol giver mulighed for høj kontrast, højeffektiv forindlejringsmærkning, kompatibel med traditionel glutaraldehydfiksering, der giver den bedste strukturelle bevarelse af kromatin til rumtemperaturprøvebehandling. En anden fordel ved forindlejring af mærkning er muligheden for at forudvælge celler af interesse for sektionering. Dette er især vigtigt for analysen af heterogene cellepopulationer samt kompatibilitet med elektrontomografimetoder til højopløselig 3D-analyse af kromatinorganisation på replikationssteder og analysen af postreplikativ kromatinomlejring og søsterkromatidsegregering i interfasen.

Replikationsfoci i pattedyrs cellekerner viser forskellige fordelingsmønstre i kernen afhængigt af S-faseprogression. Disse mønstre korrelerer med transkriptionel aktivitet af loci, der replikeres. Da den metode, der præsenteres her, anvender en ret stærkfikseringsprocedure, er det ret ligetil at anvende replikativ pulsmærkning til specifik påvisning af kromatin loci i forskellige transkriptionelle tilstande, selv under forhold, der tilbyder den bedste strukturelle bevarelse af kromatin opnået ved kemisk fikserin...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography at JoVE.com

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Denne protokol præsenterer en teknik til kortlægning i høj opløsning af replikationssteder i strukturelt bevaret kromatin in situ , der anvender en kombination af præindlejring af EdU-streptavidin-Nanogold-mærkning og ChromEMT.

Billeddannelse af repliktive domæner i ultrastrukturralt bevaret kromatin ved elektrontomografi

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Vi præsenterer en protokol til elektronmikroskopisk visualisering af de repliktive domæner i cellen ved EdU-mærkning af det nyligt syntetiserede DNA og etiketdetektion med sølvforbedring af Nanogold-partikler og ChromEM-farvning af kromatinet. Denne protokol giver forindlejringsmærkning med høj kontrast med traditionel glutaraldehydfiksering, der giver den bedste strukturelle bevarelse af kromatinet til behandling af stuetemperaturprøven. Denne protokol er optimeret til den vedhæftningscelle, der vokser på dækslipsene i petriskålen.Tilsæt EdU til 10 mikromol endelig koncentration og læg cellerne i inkubatoren for den ønskede mærkningstid. Fastgør de mærkede celler med 2,5% gluaradehydrat i en 100 millimol natriumkacodylatopløsning i en time. Længere fikseringstid kan påvirke EdU-mærkningen negativt.Glutaraldehyd fjernes ved at skylle prøverne med PBS suppleret med fem millimol magnesiumchlorid, der yderligere betragtes som PBS-stjerne. Vask tre gange i 10 minutter. Permeabilisere plasmamembraner med 1% opløsning af Trione X-100 i PBS-stjerne, foretage to ændringer i fem minutter hver.Denne løsning kaldes desuden PBS-stjernen T.Vasker prøven i udstrakt grad med PBS-stjerne. Fem ændringer i fem minutter hver. Sluk de resterende aldehydgrupper med 20 millimol glycin i PBS-stjernen, to gange i 10 minutter.Anbring prøven i PBS-stjerne med 1% BSA i en halv time. Mens du blokerer i BSA, skal du forberede reaktionscocktailen til EdU-detektion. Rækkefølgen af komponenttilsætning er vigtig.EdU biotin-azidkonjugering udføres i det fugtige kammer for at minimere fordampnings- og koncentrationsforskydningerne i reaktionscocktailen. Forbered det fugtige kammer. Placer dæksedlen på parafilmen med en celle vendt op, og læg 50 til 100 mikroliter af reaktionscocktailen på dæksedlen.Reaktionen tager 30 minutter ved stuetemperatur. Stop reaktionen ved at vaske prøven i PBS-stjerne T, fem gange i fem minutter hver. Bloker igen med 1% BSA i PBS-stjerne T i yderligere en halv time.Forbered streptavidin-Nanogold-opløsning i PBS-stjerne T med 1% BSA. Inkuber prøven med streptavidin natten over ved plus fire grader i et nyforberedt fugtigt kammer. Proceduren er den samme som med EdU biotin-azidkonjugering.Stop reaktionen og vask prøven, fem gange i 10 minutter hver med PBS-stjernen T.Stabiliser biotin streptavidinkomplekset ved yderligere fiksering vil 1% glutaraldehyd PBS stjerne i en halv time. Fjern glutaraldehyd ved intens vask med deioniseret vand. Sluk resterende aldehydgrupper med et milligram pr. Milliliter natriumborhydrid.Vask igen grundigt. Næste skridt er at øge størrelsen af Nanogold-partikler ved hjælp af sølvaflejring på det gyldne kursus. Forbered forblandinger for at minimere mørkekammeraktivitet.Ligevægt prøverne med vaskebuffer og fortsæt til et mørkekammer. I mørkekammeret blandes komponenterne for at forberede vaskeopløsningen og påføres den på prøverne. Acacia pulveropløsning er meget visikler.Så under blanding af komponenterne skal du rocke røret langsomt for at undgå dannelse af boble og skum. Reaktionen tager fra to til fem minutter. Vi anbefaler at udføre en testkørsel for at bestemme den optimale reaktionstid.Længere inkubationstid kan resultere i en uspecifik sølvaflejring. For at stoppe reaktionen skylles prøven hurtigt med tre til fem ændringer af det deioniserede vand. Efterfulgt af yderligere tre ændringer i fem minutter hver.For at beskytte sølvnanopartiklerne mod opløsning af osmiumtetroxidet inkuberes prøverne i 0,05% tetrachloraurinsyre i to minutter i mørket. Vask grundigt med deioniseret vand. På dette stadium tilsættes yderligere kontrast til det DNA, der indeholder materiale.Mæt prøven med DRAQ5 DNA-plet. Tilsæt diamionobenzidinopløsning til prøven og inkuber i et minut. Flyt dækslaget ind i glasbunden Petriskål, og læg det på scenen i det omvendte mikroskop.Bestråle flere synsfelter med 640 nanometer rødt lys. Venstre panel viser den komplette fotoblegning af DRAQ5. På højre panel er det samme synsfelt afbildet i det transmitterede lys, der viser DAB-bundfald.Vask prøver med deioniseret vand. Næste trin skal udføres under stinkhætten. Fremstillet delvist reduceret osmiumtetroxidopløsning.Vær forsigtig. Dette stof er meget flygtigt og giftigt. Påfør den tilberedte opløsning på prøven.På dette stadium reagerer de reducerede osmiumforbindelser med diamionobenzidinaflejringer og øger DNA'ets kontrast. Bortskaf osmiumholdig opløsning i henhold til din lokale regulering og vask prøver tre gange i fem minutter hver. Prøven dehydreres yderligere i en række stigende ethanolkoncentrationer efterfulgt af infiltration af cellerne med ethanolharpiksblandinger.Udskift alkoholharpiksblandingen med frisklavet ren harpiks. Fyld den korrekt dimensionerede indlejringsform med en frisklavet harpiks. Placer dækslen med en celle, der vender nedad over det harpiksfyldte hulrum.Hærd harpiksen i 24 timer ved 37 grader. Derefter ved 60 grader i mindst to dage. Fjern harpiks fra en bundflade af et dæksler.Slip pladen i et flydende nitrogen og overfør derefter til kogende vand. Glasset skal løsnes. Gentag om nødvendigt.Bestrålede synsfelter skal være tydeligt synlige på grund af diamionobenzidinaflejring og DAB-farvning. Skær interesseområdet ud af pladen ved hjælp af hacksaven eller et andet egnet instrument. Anbring udskæringen i den ultramikrotom enkle holder.Konfigurer ultramikrotomet til endelig bloktrimning. Brug barberbladet til at forberede den pyramideformede pillet. Størrelsen af et fladt område oven på pyramiden skal være ca. 400 med 200 mikron.Monter den forberedte pyramide i ultramikrotomarmen og installer kniven. Forbered afsnittene. Sektionstykkelsen kan justeres, så den passer til forsøgskravene.Vi tilstræber EM-tomografi. Så vi forberedte sektioner med en tykkelse på 250 nanometer også kaldet halvtynde sektioner. Fjern sektionerne fra knivens kant og monter dem på et slotgitter.Vi brugte et slotgitter, de var runde en millimeter for at være omkring, en millimeter sideåbning. Den lille åbningsstørrelse giver bedre stabilitet af sektionerne. Lad prøverne tørre på gitteret.I øjeblikket er sektionerne klar til observation. Anbring gitteret i elektronmikroskopprøveholderen. Læg prøven i elektronmikroskopet.Erhverv vippeserier. Replikationsfoci i pattedyrcellekerner viser forskellige fordelingsmønstre afhængigt af S-faseprogressionen. Vellykket EdU-mærkning bekræftet af klikreaktionen med fluorescerende mærketazid demonstrerer typisk replikationsmønster i den heterogene cellepopulation efter glutaraldehydfiksering ovenpå.Streptavidin mærkning kan påvirkes af glutaraldehyd. Så kontroller først fluorescens streptavidin farvning under samme betingelse som streptavidin nanogold på bunden. Godt resultat af sølvforbedringsproceduren er en mørkebrun farvning af nogle kerner og meget besvimet gul cytoplastplet, vist på bunden.Fordelen ved en forindlejringsmærkning er muligheden for at vælge celler til sektioneringen. Det er muligt på dette stadium, fordi mærkningsmønstrene bliver synlige under et lyst feltmikroskop. Den relevante mærkning resulterer i de velafgrænsede replikationssteder.Pilespids viser DAB-farvede kromatinfibre. Baggrundsmærkningen til højre er begrænset til nogle få nanopartikler pr. Kvadratmikron. Halvtynde sektioner er klar til tomografi og kræver ikke tilsætning af guldnanopartikler.Den beskrevne tilgang, der anvendes til undersøgelser af kromatinorganisation på steder med aktiveret replikation. Til analyse af postreplikativ omlejring af kromatin, herunder billeddannelse i høj opløsning af kromatinsegregering. Det bruges også til replikeret mærkning af store kromosomale domæner og undersøgelser af højere orden kromatinfoldning og heterochromatin.Denne billeddannelsesteknik er også vigtig som referencepunkt for de data, der genereres af andre ikke-mikroskopiske tilgange. Metoden kan også rummes i korrelerede mikroskopiske undersøgelser, herunder superopløsningsteknikker. Dette åbner nye horisonter i studier af kromatin højere ordens struktur og dens dynamik i cellens forskellige fysiologiske tilstande.

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatin Isolering af RNA Oprensning (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Visualisering af ATP synthase Dimerer i mitokondrier af Electron Cryo-tomografi

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Isolering af specifikke genomiske regioner og Identifikation af associerede molekyler ved enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Forberedelse og Observation af Thick Biologiske prøver ved scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Forberedelse af prøver og billeddannelse af Exosomes af transmissions Elektron Mikroskopi

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D mitokondrie ultrastruktur af Drosophila indirekte flyvning muskel afsløret af seriel-sektion elektron tomografi

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisering af DNA jordpakning i cyanobakterier af høj spænding Cryo-elektron tomografi

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiske prøveforberedelse højtryks frysebehandling, mikrobølgeovn-assisteret kontrastforbedring og Minimal harpiks indlejring for volumen Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

CryoAPEX-metoden til elektronmikroskopianalyse af membranproteinlokalisering i ultrastrukturelt bevarede celler

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...