Name: imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography at JoVE.com

Dit werk werd deels ondersteund door RSF (subsidie #17-15-01290) en RFBR (subsidie #19-015-00273). De auteurs bedanken lomonosov Moscow State University development program (PNR 5.13) en Nikon Center of Excellence in correlative imaging aan het Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology voor toegang tot beeldvormingsinstrumenten.

Het protocol is geoptimaliseerd voor adherente cellen en is getest op HeLa, HT1080 en CHO cellijnen.
1. Celletikettering en fixatie
<ol><li>Plaatcellen op zuur gereinigde coverslips in een petrischaaltje van 3 cm. Laat de cellen in de media die worden aanbevolen voor de cellijn die wordt gebruikt, groeien tot 70% confluentie.</li>
	<li>Voeg EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) toe van 10 mM voorraad tot 10 μM eindconcentratie en plaats de cellen gedurende 10 minuten of langer in...

<ol>
	<li>Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicating+large+genomes:+divide+and+conquer.">Replicating large genomes: divide and conquer.</a> Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).</li><li>M&#233;chali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+DNA+replication+origins:+Many+choices+for+appropriate+answers.">Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers.</a> Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).</li><li>Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+DNA+replication.">Organization of DNA replication.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).</li><li>Su, Q. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+reveals+spatiotemporal+propagation+of+human+replication+foci+mediated+by+CTCF-organized+chromatin+structures.">Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).</li><li>Leonhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+factories+in+living+cells.">Dynamics of DNA replication factories in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).</li><li>Philimonenko, A. A., Hodn&#253;, Z., Jackson, D. A., Hoz&#225;k, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microarchitecture+of+DNA+replication+domains.">The microarchitecture of DNA replication domains.</a> Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).</li><li>Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organizations+of+replicon+domains+during+DNA+synthetic+phase+in+the+mammalian+nucleus.">Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus.</a> Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+DNA+replication+sites+in+mammalian+cells.">Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).</li><li>Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+early+and+late+replicating+DNA+in+human+chromosome+territories.">Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories.</a> Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).</li><li>Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+three-dimensional+replication+patterns+during+the+S-phase,+analysed+by+double+labelling+of+DNA+and+confocal+microscopy.">Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy.</a> Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).</li><li>Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-like+chromatin:+Toward+understanding+the+real+chromatin+organization+present+in+the+cell.">Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell.</a> Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).</li><li>Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+early+chromosome+condensation:+A+hierarchical+folding,+axial+glue+model+of+chromosome+structure.">Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure.</a> Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).</li><li>Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+interphase+large-scale+chromatin+structure+from+analysis+of+engineered+chromosome+regions.">Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions.</a> Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 236 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation.">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li><li>Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChromEMT:+Visualizing+3D+chromatin+structure+and+compaction+in+interphase+and+mitotic+cells.">ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells.</a> Science. 357 (6349), (2017).</li><li>Hoz&#225;k, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+factories+and+nuclear+bodies:+the+ultrastructural+characterization+of+replication+sites+during+the+cell+cycle.">Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle.</a> Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).</li><li>Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+of+DNA+replication+reveals+dynamic+plasticity+of+large-scale+chromatin+fibers.">Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers.</a> Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+electron+microscopic+immunocytochemistry+with+silver-enhanced+1.4-nm+gold+particles+to+localize+GAD+in+the+cerebellar+nuclei.">The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).</li><li>Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+immunogold+labeling+confirms+large-scale+chromatin+folding+motifs.">In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs.</a> Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).</li><li>Sawada, H., Esaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nanogold+followed+by+silver+enhancement+and+gold+toning+for+preembedding+immunolocalization+in+osmium-fixed,+Epon-embedded+tissues.">Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freeze+substitution+fixation-based+gold+enlarging+technique+for+EM+studies+of+endocytosed+Nanogold-labeled+molecules.">A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).</li><li>Weipoltshammer, K., Sch&#233;fer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography.">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).</li></ol>

De hier beschreven methode heeft verschillende voordelen ten opzichte van eerder gepubliceerde protocollen. Ten eerste elimineert het gebruik van Click-chemie voor het labelen van gerepliceerd DNA de noodzaak van DNA-denaturatievoorwaarde voor BrdU-detectie met antilichamen, waardoor chromatine ultrastructuur beter behouden blijft. 
Ten tweede minimaliseert het gebruik van biotine als secundair ligand dat wordt gegenereerd na glutaaraldehydefixatie en het correct blussen van ongebonden aldehyd...

DNA-replicatie is een fundamenteel biologisch proces dat nodig is voor het getrouw kopiëren en overbrengen van de genetische informatie tijdens de celdeling. Bij hogere eukaryoten wordt DNA-replicatie onderworpen aan een strakke spatio-temporele regulatie, die zich manifesteert in sequentiële activering van replicatieoorsprong1. Naburige replicatieoorsprongen die synchroon worden afgevuurd, vormen clusters van repliconen2. Op het niveau van optische microscopie worden plaatsen van voortdurende DNA-replicatie gedetecteerd als replicatiehaarden van verschillende aantallen en groottes. Replicatiehaarden vertonen specifieke patronen van ruimtelijke verdeling binnen de celkern, afhankelijk van de replicatietiming van het gelabelde DNA 3,4, dat op zijn beurt nauw gecorreleerd is met zijn genactiviteit. Dankzij de goed gedefinieerde sequentie van DNA-replicatie, strikt geordend in ruimte en tijd, is replicative labeling een krachtige methode voor nauwkeurige DNA-labeling, niet alleen voor de studie van het replicatieproces op zich, maar ook om een specifieke DNA-subfractie te onderscheiden met gedefinieerde transcriptieactiviteit en verdichtingsniveau. Visualisatie van replicerend chromatine wordt meestal uitgevoerd door de detectie van belangrijke eiwitcomponenten van DNA-replicatiemachines (hetzij door immunostaining of door expressie van fluorescerende eiwittags 5,6) of door de integratie van gemodificeerde DNA-syntheseprecursoren 7,8,9,10 . Hiervan maken alleen methoden op basis van de opname van gemodificeerde nucleotiden in nieuw gerepliceerd DNA het mogelijk om conformationele veranderingen in chromatine tijdens replicatie vast te leggen en het gedrag van replicerende domeinen te traceren nadat hun replicatie is voltooid.
Bij hogere eukaryoten voegt DNA-verpakking in chromatine een ander niveau van complexiteit toe aan de regulatie van genetische basisfuncties (transcriptie, replicatie, reparatie, enz.). Chromatinevouwing beïnvloedt de toegankelijkheid van DNA tot regulerende transfactoren en DNA-conformatieveranderingen (dubbele helixafwikkeling) die nodig zijn voor de sjabloonsynthese. Daarom wordt algemeen aanvaard dat DNA-afhankelijke synthetische processen in de celkern een structurele overgang van chromatine vereisen van zijn gecondenseerde, repressieve toestand naar een meer toegankelijke, open conformatie. Cytologisch worden deze twee chromatinetoestanden gedefinieerd als heterochromatine en euchromatine. Er is echter nog steeds geen consensus over de wijze van DNA-vouwing in de kern. De hypothesen variëren van een "polymeersmelt" model11, waarbij nucleosomale vezel zich gedraagt als een willekeurig polymeer waarvoor de pakkingsdichtheid wordt geregeld door fasescheidingsmechanismen, tot hiërarchische vouwmodellen die sequentiële vorming van chromatinevezelachtige structuren van toenemende diktepostuleren 12,13. Hiërarchische vouwmodellen kregen onlangs steun van moleculaire benaderingen op basis van de analyse van in situ DNA-DNA-contacten (chromosoomconformatievangst, 3C), wat het bestaan van de hiërarchie van chromatine structurele domeinen14 aantoont. Het is belangrijk op te merken dat replicatie-eenheden zeer goed correleren met deze chromatinedomeinen15. De belangrijkste kritiek op deze modellen is gebaseerd op mogelijke kunstmatige chromatineaggregatie veroorzaakt door monstervoorbereidingsprocedures, zoals permeabilisatie van celmembranen en verwijdering van niet-chromatinecomponenten, om het chromatinecontrast voor ultrastructurele studies te verbeteren en tegelijkertijd de toegankelijkheid van chromatine voor verschillende probes (bijv. Antilichamen) te verbeteren. Recente technische vooruitgang in selectieve DNA-kleuring voor elektronenmicroscopie door DNA-bindende fluorofoor-gemedieerde foto-oxidatie van diaminobenzidine (ChromEMT6) heeft de eliminatie van dit obstakel mogelijk gemaakt. Dezelfde overwegingen gelden echter voor elektronenmicroscopievisualisatie van het repliceren van DNA17,18. Hier beschrijven we een techniek die het mogelijk maakt om tegelijkertijd ultrastructurele mapping met hoge resolutie nieuw gesynthetiseerd DNA en totaal chromatine in intacte aldehyde-gekruiste cellen mogelijk te maken. De techniek combineert detectie van EdU-gelabeld DNA door Click-chemie met gebiotinyleerde probes en streptavidin-Nanogold en ChromEMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555-azide</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>A20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>C3730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Boval</td>
			<td>LY-0080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>26544-38-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90-72-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin monomer</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90529-77-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25%, EM Grade)</td>
			<td>TED PELLA, INC</td>
			<td>18426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>258850010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141396.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>213462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>25134-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver lactate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>359750-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>S11223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Nanogold conjugate</td>
			<td>Nanoprobes</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrachloroauric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>HT1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L</td>
			<td>298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka Chemica</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper single slot grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Cy5 HQ</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife Ultra Wet 45o</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DU</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-tilt sample holder</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Multi Bio RS-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer</td>
			<td>Jeol</td>
			<td>JEM-2100</td>
			<td>Alternatives: FEI, Hitachi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UltraCut-E</td>
			<td>Alternatives: RMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography

Principes van DNA-vouwing in de celkern en de dynamische transformaties die optreden tijdens de vervulling van fundamentele genetische functies (transcriptie, replicatie, segregatie, enz.) blijven slecht begrepen, deels als gevolg van het gebrek aan experimentele benaderingen voor hoge resolutie visualisatie van specifieke chromatine loci in structureel bewaard gebleven kernen. Hier presenteren we een protocol voor de visualisatie van replicerende domeinen in monolaagcelcultuur in situ, door EdU-labeling van nieuw gesynthetiseerd DNA te combineren met daaropvolgende labeldetectie met Ag-amplificatie van Nanogold-deeltjes en ChromEM-kleuring van chromatine. Dit protocol maakt de contrastrijke, zeer efficiënte pre-embedding etikettering mogelijk, compatibel met traditionele glutaaraldehydefixatie die de beste structurele conservering van chromatine biedt voor monsterverwerking op kamertemperatuur. Een ander voordeel van pre-embedding labeling is de mogelijkheid om vooraf cellen te selecteren die van belang zijn voor secties. Dit is vooral belangrijk voor de analyse van heterogene celpopulaties, evenals compatibiliteit met elektronentomografiebenaderingen voor hoge-resolutie 3D-analyse van chromatine-organisatie op replicatieplaatsen, en de analyse van postreplicatieve chromatineherschikking en zusterchromatidenscheiding in de interfase.

Replicatiehaarden in celkernen van zoogdieren vertonen verschillende distributiepatronen binnen de kern, afhankelijk van de progressie in de S-fase. Deze patronen correleren met transcriptionele activiteit van de loci die wordt gerepliceerd. Aangezien de hier gepresenteerde methode gebruik maakt van een vrij sterkefixatieprocedure, is het vrij eenvoudig om replicatieve pulsetikettering te gebruiken voor specifieke detectie van chromatine loci in verschillende transcriptionele toestanden, zelfs onder omstandigheden die de...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography at JoVE.com

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Dit protocol presenteert een techniek voor het in kaart brengen van replicatielocaties met hoge resolutie in structureel geconserveerd chromatine in situ die een combinatie van pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold-labeling en ChromEMT gebruikt.

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin door Electron Tomography

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

We presenteren een protocol voor de elektronenmicroscopische visualisatie van de replicerende domeinen in de cel door de EdU-etikettering van het nieuw gesynthetiseerde DNA en labeldetectie met zilververbetering van Nanogold-deeltjes en ChromEM-kleuring van het chromatine. Dit protocol geeft de pre-embedding-etikettering met hoog contrast met traditionele glutaaraldehydefixatie die de beste structurele conservering van het chromatine geeft voor de monsterverwerking bij kamertemperatuur. Dit protocol is geoptimaliseerd voor de hechtingscel die groeit op de coverslips in de petrischaal.Voeg EdU toe aan de eindconcentratie van 10 micromol en plaats de cellen in de incubator voor de gewenste etiketteringstijd. Fixeer de gelabelde cellen met 2,5% gluaradehydraat in een 100 millimol natriumcacellodaatoplossing gedurende één uur. Langere fixatietijd kan de EdU-etikettering nadelig beïnvloeden.Verwijder glutaaraldehyde door de monsters te spoelen met PBS aangevuld met vijf millimol magnesiumchloride, verder beschouwd als PBS-ster. Was drie keer gedurende 10 minuten. Permeabiliseer plasmamembranen met 1% oplossing van Trione X-100 in PBS-ster, breng twee veranderingen aan gedurende vijf minuten elk.Deze oplossing wordt verder aangeduid als PBS-ster T.Was het monster uitgebreid met PBS-ster. Vijf wissels voor elk vijf minuten. Blus de resterende aldehydegroepen met 20 millimol glycine in PBS star, twee keer gedurende 10 minuten.Plaats het monster gedurende een half uur in PBS star met 1%BSA. Bereid tijdens het blokkeren in BSA de reactiecocktail voor op EdU-detectie. De volgorde van componenttoevoeging is belangrijk.EdU biotine-azide conjugatie wordt uitgevoerd in de vochtige kamer om de verdamping en concentratieverschuivingen in de reactiecocktail te minimaliseren. Bereid de vochtige kamer voor. Plaats de coverslip op de parafilm met een naar boven gerichte cellen en leg 50 tot 100 microliter van de reactiecocktail op de coverslip.Reactie duurt 30 minuten bij kamertemperatuur. Stop de reactie door het monster in PBS-ster T te wassen, vijf keer gedurende vijf minuten elk. Blokkeer opnieuw met 1%BSA in PBS ster T voor nog een half uur.Bereid streptavidin-Nanogold oplossing in PBS ster T met 1%BSA. Incubeer het monster met streptavidin 's nachts bij plus vier graden in een nieuw bereide vochtige kamer. De procedure is dezelfde als bij EdU biotine-azide conjugatie.Stop de reactie en was het monster, vijf keer gedurende 10 minuten elk met PBS-ster T.Stabiliseer biotine streptavidin complex door extra fixatie zal 1% glutaaraldehyde PBS ster gedurende een half uur. Verwijder glutaaraldehyde door intensief te wassen met gedeïoniseerd water. Blus resterende aldehydegroepen met één milligram per milliliter natriumboorhydride.Was opnieuw grondig. De volgende stap is het vergroten van de grootte van Nanogold deeltjes door middel van zilverafzetting op de gulden koers. Bereid premixen voor om de activiteit in de donkere kamer te minimaliseren.Breng de monsters in evenwicht met de wasbuffer en ga naar een donkere kamer. Meng in de donkere kamer de componenten om de wasoplossing te bereiden en breng deze aan op de monsters. Acacia poeder oplossing is zeer visicles.Dus tijdens het mengen van de componenten, schommel de buis langzaam om bubbel- en schuimvorming te voorkomen. De reactie duurt twee tot vijf minuten. We raden aan om een testrun uit te voeren om de optimale reactietijd te bepalen.Een langere incubatietijd kan resulteren in een niet-specifieke zilverafzetting. Om de reactie te stoppen, spoelt u het monster snel af met drie tot vijf keer het gedeïoniseerde water. Gevolgd door nog drie wissels gedurende elk vijf minuten.Om de zilveren nanodeeltjes te beschermen tegen oplossing door het osmiumtetroxide, incubeer je de monsters in 0,05% tetrachloorzuur gedurende twee minuten in het donker. Was grondig met gedeïoniseerd water. In dit stadium wordt extra contrast toegevoegd aan het DNA-bevattende materiaal.Verzadig het monster met DRAQ5 DNA-kleuring. Voeg diamionobenzidine-oplossing toe aan het monster en incubeer gedurende één minuut. Verplaats de hoeslip in de petrischaal met glazen bodem en plaats deze op het podium van de omgekeerde microscoop.Bestraal verschillende gezichtsvelden met 640 nanometer rood licht. Linkerpaneel toont de volledige fotobleking van DRAQ5. Op het rechterpaneel wordt hetzelfde gezichtsveld weergegeven in het doorgelaten licht dat DAB-neerslag vertoont.Was monsters met gedeïoniseerd water. De volgende fase moet onder de zuurkast worden uitgevoerd. Bereide gedeeltelijk gereduceerde osmiumtetroxide-oplossing.Wees voorzichtig. Deze stof is zeer vluchtig en giftig. Breng de bereide oplossing aan op het monster.In dit stadium reageren de gereduceerde osmiumverbindingen met diamionobenzidineafzettingen en verhogen ze het contrast van het DNA. Gooi osmium bevattende oplossing volgens uw lokale regelgeving weg en was monsters drie keer gedurende vijf minuten elk. Het monster wordt verder gedehydrateerd in een reeks toenemende ethanolconcentraties gevolgd door de infiltratie van de cellen met ethanolharsmengsels.Vervang alcoholharsmix door vers bereide pure hars. Vul de juiste inbeddingsvorm met een vers bereide hars. Plaats de dekplaat met een cel naar beneden gericht over de met hars gevulde holte.Laat de hars 24 uur uitharden bij 37 graden. Daarna op 60 graden voor minstens twee dagen. Verwijder hars van een onderoppervlak van een hoes.Laat de plaat in een vloeibare stikstof vallen en breng deze vervolgens over in kokend water. Het glas moet loskomen. Herhaal indien nodig.Bestraalde gezichtsvelden moeten duidelijk zichtbaar zijn vanwege de diamionobenzidineafzetting en DAB-kleuring. Knip het interessegebied uit de plaat met behulp van de ijzerzaag of een ander geschikt instrument. Plaats de uitsparing in de ultramicrotome eenvoudige houder.Stel de ultramicrotoom in voor het laatste trimmen van blokken. Bereid met het scheermesje de piramidevormige pilet voor. De grootte van een vlak gebied bovenop de piramide moet ongeveer 400 bij 200 micron zijn.Monteer de geprepareerde piramide in de ultramicrotome arm en installeer het mes. Bereid de secties voor. De sectiedikte kan worden aangepast aan de experimentele vereisten.We streven naar EM-tomografie. Dus bereidden we secties voor met een dikte van 250 nanometer, ook wel semi-dunne secties genoemd. Maak de secties los van de rand van het mes en monteer ze op een sleufraster.We gebruikten een gleufrooster, ze waren rond een millimeter om rond te zijn, een millimeter zijopening. De kleine opening zorgt voor een betere stabiliteit van de secties. Laat de monsters drogen op het rooster.Op dit moment zijn de secties klaar voor observatie. Plaats het rooster in de monsterhouder van de elektronenmicroscoop. Laad het monster in de elektronenmicroscoop.Koop kantelseries. Replicatiehaarden in celkernen van zoogdieren vertonen verschillende distributiepatronen, afhankelijk van de progressie van de S-fase. Succesvolle EdU-etikettering bevestigd door de klikreactie met fluorescerend gelabeld azide toont een typisch replicatiepatroon in de heterogene celpopulatie na glutaaraldehydefixatie bovenop.Streptavidin etikettering kan worden beïnvloed door glutaaraldehyde. Controleer dus eerst de fluorescentie streptavidin kleuring onder dezelfde conditie als streptavidin nanogold op de bodem. Goed resultaat van de zilververbeteringsprocedure is een donkerbruine kleuring van enkele kernen en zeer flauwgevallen gele cytoplastvlek, weergegeven op de bodem.Voordeel van een pre-embedding labeling is de mogelijkheid om cellen te selecteren voor de sectioning. Het is in dit stadium mogelijk omdat de etiketteringspatronen zichtbaar worden onder een heldere veldmicroscoop. De juiste etikettering resulteert in de goed afgebakende replicatiesites.Pijlpunten tonen de DAB-gekleurde chromatinevezels. De achtergrondetikettering aan de rechterkant is beperkt tot enkele nanodeeltjes per vierkante micron. Halfdunne secties zijn klaar voor tomografie en vereisen geen toevoeging van gouden nanodeeltjes.De beschreven aanpak die wordt gebruikt voor de studies van chromatineorganisatie op locaties met ingeschakelde replicatie. Voor analyse van postreplicatieve herschikking van chromatine inclusief hoge resolutie beeldvorming van chromatine segregatie. Het werd ook gebruikt voor gerepliceerde etikettering van grote chromosomale domeinen en studies van hogere orde chromatinevouwing en heterochromatine.Deze beeldvormingstechniek is ook belangrijk als referentiepunt voor de gegevens die worden gegenereerd door andere niet-microscopische benaderingen. De methode kan ook worden ondergebracht in gecorreleerde microscopische studies, waaronder superresolutietechnieken. Dit opent nieuwe horizonten in studies van chromatine hogere orde structuur en de dynamiek ervan in de verschillende fysiologische toestanden van de cel.

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatine Isolatie door RNA-zuivering (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Visualisatie van ATP synthase Dimeren in Mitochondriën door Electron Cryo-tomografie

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Isolatie van specifieke genomische regio en identificatie van geassocieerde moleculen door enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Voorbereiding en observatie van Thick biologische monsters door Scanning Transmission Electron Tomografie

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Bereiding van de monsters en de beeldvorming van de Exosomes door transmissie-elektronenmicroscopie

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D mitochondriale ultrastructuur van Drosophila indirecte vlucht spier geopenbaard door seriële-sectie Elektronentomografie

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisatie van DNA verdichting in cyanobacteriën door hoogspannings-Cryo-Elektronentomografie

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

De CryoAPEX-methode voor elektronenmicroscopieanalyse van membraaneiwitlokalisatie binnen ultrastructureel bewaarde cellen

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...