Name: imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
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Ce travail a été soutenu en partie par RSF (subvention #17-15-01290) et RFBR (subvention #19-015-00273). Les auteurs remercient le programme de développement de l’Université d’État Lomonosov de Moscou (PNR 5.13) et le Centre d’excellence Nikon en imagerie corrélative de l’Institut Belozersky de biologie physico-chimique pour leur accès à l’instrumentation d’imagerie.

Le protocole est optimisé pour les cellules adhérentes et a été testé sur les lignées cellulaires HeLa, HT1080 et CHO.
1. Étiquetage et fixation des cellules
<ol><li>Cellules de plaque sur des couvercles nettoyés à l’acide dans une boîte de Petri de 3 cm. Cultiver les cellules dans le milieu recommandé pour la lignée cellulaire utilisée à 70% de confluence.</li>
	<li>Ajouter l’EdU (5-éthyynyl-2'-désoxyuridine) à partir de 10 mM de stock jusqu’à la con...

<ol>
	<li>Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicating+large+genomes:+divide+and+conquer.">Replicating large genomes: divide and conquer.</a> Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).</li><li>M&#233;chali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+DNA+replication+origins:+Many+choices+for+appropriate+answers.">Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers.</a> Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).</li><li>Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+DNA+replication.">Organization of DNA replication.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).</li><li>Su, Q. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+reveals+spatiotemporal+propagation+of+human+replication+foci+mediated+by+CTCF-organized+chromatin+structures.">Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).</li><li>Leonhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+factories+in+living+cells.">Dynamics of DNA replication factories in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).</li><li>Philimonenko, A. A., Hodn&#253;, Z., Jackson, D. A., Hoz&#225;k, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microarchitecture+of+DNA+replication+domains.">The microarchitecture of DNA replication domains.</a> Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).</li><li>Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organizations+of+replicon+domains+during+DNA+synthetic+phase+in+the+mammalian+nucleus.">Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus.</a> Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+DNA+replication+sites+in+mammalian+cells.">Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).</li><li>Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+early+and+late+replicating+DNA+in+human+chromosome+territories.">Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories.</a> Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).</li><li>Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+three-dimensional+replication+patterns+during+the+S-phase,+analysed+by+double+labelling+of+DNA+and+confocal+microscopy.">Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy.</a> Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).</li><li>Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-like+chromatin:+Toward+understanding+the+real+chromatin+organization+present+in+the+cell.">Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell.</a> Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).</li><li>Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+early+chromosome+condensation:+A+hierarchical+folding,+axial+glue+model+of+chromosome+structure.">Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure.</a> Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).</li><li>Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+interphase+large-scale+chromatin+structure+from+analysis+of+engineered+chromosome+regions.">Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions.</a> Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 236 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation.">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li><li>Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChromEMT:+Visualizing+3D+chromatin+structure+and+compaction+in+interphase+and+mitotic+cells.">ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells.</a> Science. 357 (6349), (2017).</li><li>Hoz&#225;k, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+factories+and+nuclear+bodies:+the+ultrastructural+characterization+of+replication+sites+during+the+cell+cycle.">Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle.</a> Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).</li><li>Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+of+DNA+replication+reveals+dynamic+plasticity+of+large-scale+chromatin+fibers.">Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers.</a> Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+electron+microscopic+immunocytochemistry+with+silver-enhanced+1.4-nm+gold+particles+to+localize+GAD+in+the+cerebellar+nuclei.">The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).</li><li>Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+immunogold+labeling+confirms+large-scale+chromatin+folding+motifs.">In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs.</a> Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).</li><li>Sawada, H., Esaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nanogold+followed+by+silver+enhancement+and+gold+toning+for+preembedding+immunolocalization+in+osmium-fixed,+Epon-embedded+tissues.">Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freeze+substitution+fixation-based+gold+enlarging+technique+for+EM+studies+of+endocytosed+Nanogold-labeled+molecules.">A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).</li><li>Weipoltshammer, K., Sch&#233;fer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography.">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).</li></ol>

La méthode décrite ici présente plusieurs avantages par rapport aux protocoles précédemment publiés. Tout d’abord, l’utilisation de la chimie du clic pour le marquage de l’ADN répliqué élimine la nécessité d’une dénaturation de l’ADN préalable à la détection de BrdU avec des anticorps, préservant ainsi mieux l’ultrastructure de la chromatine. 
Deuxièmement, l’utilisation de la biotine comme ligand secondaire généré après la fixation du glutaraldéhyde et la t...

La réplication de l’ADN est un processus biologique de base requis pour la copie fidèle et la transmission de l’information génétique pendant la division cellulaire. Chez les eucaryotes supérieurs, la réplication de l’ADN est soumise à une régulation spatio-temporelle étroite, qui se manifeste par une activation séquentielle des origines de la réplication1. Les origines de réplication voisines tirant de manière synchrone forment des groupes de replicons2. Au niveau de la microscopie optique, les sites de réplication continue de l’ADN sont détectés comme des foyers de réplication de nombre et de taille variés. Les foyers de réplication présentent des modèles spécifiques de distribution spatiale dans le noyau cellulaire en fonction du moment de la réplication de l’ADN marqué 3,4, qui, à son tour, est étroitement corrélé avec son activité génique. Grâce à une séquence bien définie de réplication de l’ADN, strictement ordonnée dans l’espace et le temps, le marquage réplicatif est une méthode puissante de marquage précis de l’ADN non seulement pour l’étude du processus de réplication en soi, mais aussi pour discriminer une sous-fraction spécifique de l’ADN avec une activité de transcription et un niveau de compactage définis. La visualisation de la chromatine répliquante est généralement réalisée par la détection des principaux composants protéiques de la machinerie de réplication de l’ADN (soit par immunocoloration, soit par expression de marqueurs de protéines fluorescentes 5,6) ou par l’incorporation de précurseurs modifiés de synthèse de l’ADN 7,8,9,10 . Parmi celles-ci, seules les méthodes basées sur l’incorporation de nucléotides modifiés dans l’ADN nouvellement répliqué permettent de capturer les changements conformationnels de la chromatine pendant la réplication et de retracer le comportement des domaines réplicatifs une fois leur réplication terminée.
Chez les eucaryotes supérieurs, l’emballage de l’ADN en chromatine ajoute un autre niveau de complexité à la régulation des fonctions génétiques de base (transcription, réplication, réparation, etc.). Le repliement de la chromatine affecte l’accessibilité de l’ADN aux transfacteurs régulateurs et aux changements conformationnels de l’ADN (dénouement en double hélice) nécessaires à la synthèse du gabarit. Par conséquent, il est généralement admis que les processus synthétiques dépendants de l’ADN dans le noyau cellulaire nécessitent une transition structurelle de la chromatine de son état condensé et répressif vers une conformation plus accessible et ouverte. Cytologiquement, ces deux états de chromatine sont définis comme l’hétérochromatine et l’euchromatine. Cependant, il n’y a toujours pas de consensus concernant le mode de repliement de l’ADN dans le noyau. Les hypothèses vont d’un modèle de « polymère fondu »11, où la fibre nucléosomique se comporte comme un polymère aléatoire pour lequel la densité d’emballage est contrôlée par des mécanismes de séparation de phase, à des modèles de pliage hiérarchique postulant la formation séquentielle de structures ressemblant à des fibres de chromatine d’épaisseur croissante12,13. Les modèles de repliement hiérarchique ont récemment été soutenus par des approches moléculaires basées sur l’analyse des contacts ADN-ADN in situ (capture de conformation chromosomique, 3C), démontrant l’existence de la hiérarchie des domaines structurels de la chromatine14. Il est important de noter que les unités de réplication sont très bien corrélées à ces domaines de la chromatine15. La principale critique de ces modèles est basée sur l’agrégation potentielle de la chromatine artificielle causée par les procédures de préparation des échantillons, telles que la perméabilisation des membranes cellulaires et l’élimination des composants non chromatines, afin d’améliorer le contraste de la chromatine pour les études ultrastructurales tout en améliorant l’accessibilité de la chromatine pour diverses sondes (par exemple, les anticorps). Les progrès techniques récents dans la coloration sélective de l’ADN pour la microscopie électronique par photo-oxydation de la diaminobenzidine médiée par fluorophore liant l’ADN (ChromEMT6) ont permis d’éliminer cet obstacle. Cependant, les mêmes considérations sont vraies pour la visualisation par microscopie électronique de l’ADNrépliqué 17,18. Nous décrivons ici une technique qui permet la cartographie ultrastructurale simultanée à haute résolution de l’ADN nouvellement synthétisé et de la chromatine totale dans des cellules réticulées au aldéhyde intactes. La technique combine la détection de l’ADN marqué EdU par Click-chemistry avec des sondes biotinylées et streptavidin-Nanogold, et ChromEMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555-azide</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>A20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>C3730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Boval</td>
			<td>LY-0080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>26544-38-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90-72-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin monomer</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90529-77-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25%, EM Grade)</td>
			<td>TED PELLA, INC</td>
			<td>18426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>258850010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141396.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>213462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>25134-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver lactate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>359750-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>S11223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Nanogold conjugate</td>
			<td>Nanoprobes</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrachloroauric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>HT1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L</td>
			<td>298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka Chemica</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper single slot grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Cy5 HQ</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife Ultra Wet 45o</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DU</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-tilt sample holder</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Multi Bio RS-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer</td>
			<td>Jeol</td>
			<td>JEM-2100</td>
			<td>Alternatives: FEI, Hitachi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UltraCut-E</td>
			<td>Alternatives: RMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography

Les principes du repliement de l’ADN dans le noyau cellulaire et ses transformations dynamiques qui se produisent lors de l’accomplissement des fonctions génétiques de base (transcription, réplication, ségrégation, etc.) restent mal compris, en partie en raison du manque d’approches expérimentales de visualisation à haute résolution de loci de chromatine spécifiques dans des noyaux structurellement préservés. Nous présentons ici un protocole pour la visualisation des domaines réplicatifs dans la culture cellulaire monocouche in situ, en combinant le marquage EdU de l’ADN nouvellement synthétisé avec la détection ultérieure du marquage avec l’amplification Ag des particules Nanogold et la coloration ChromEM de la chromatine. Ce protocole permet l’étiquetage pré-intégration à contraste élevé et à haute efficacité, compatible avec la fixation traditionnelle du glutaraldéhyde qui offre la meilleure conservation structurelle de la chromatine pour le traitement des échantillons à température ambiante. Un autre avantage de l’étiquetage de pré-intégration est la possibilité de présélectionner les cellules d’intérêt pour la section. Ceci est particulièrement important pour l’analyse de populations cellulaires hétérogènes, ainsi que pour la compatibilité avec les approches de tomographie électronique pour l’analyse 3D à haute résolution de l’organisation de la chromatine sur les sites de réplication, et l’analyse du réarrangement post-réplicatif de la chromatine et de la ségrégation des chromatides sœurs dans l’interphase.

Les foyers de réplication dans les noyaux de cellules de mammifères présentent des modèles distincts de distribution dans le noyau en fonction de la progression de la phase S. Ces modèles sont en corrélation avec l’activité transcriptionnelle des loci en cours de réplication. Étant donné que la méthode présentée ici utilise une procédure de fixation assez forte, il est assez simple d’utiliser le marquage d’impulsions réplicatives pour la détection spécifique de loci de chromatine dans divers états...

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Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Ce protocole présente une technique de cartographie à haute résolution des sites de réplication dans la chromatine structurellement préservée in situ qui utilise une combinaison de marquage pré-intégration EdU-streptavidin-Nanogold et ChromEMT.

Imagerie des domaines réplicatifs dans la chromatine ultrastructurellement préservée par tomographie électronique

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Nous présentons un protocole pour la visualisation microscopique électronique des domaines réplicatifs dans la cellule par le marquage EdU de l’ADN nouvellement synthétisé et la détection d’étiquettes avec amélioration de l’argent des particules Nanogold et coloration ChromEM de la chromatine. Ce protocole donne l’étiquetage de pré-intégration à contraste élevé avec la fixation traditionnelle du glutaraldéhyde qui donne la meilleure conservation structurelle de la chromatine pour le traitement de l’échantillon à température ambiante. Ce protocole est optimisé pour la cellule d’adhérence qui se développe sur les couvercles de la boîte de Pétri.Ajouter EdU à la concentration finale de 10 micro-moles et placer les cellules dans l’incubateur pendant le temps de marquage souhaité. Fixez les cellules marquées avec 2,5% de gluaradehydrate dans une solution de cacodylate de sodium de 100 millimoles pendant une heure. Un temps de fixation plus long peut nuire à l’étiquetage EdU.Éliminer le glutaraldéhyde en rinçant les échantillons avec du PBS complété par cinq millimoles de chlorure de magnésium, considéré comme une étoile PBS. Laver trois fois pendant 10 minutes. Perméabiliser les membranes plasmiques avec une solution à 1% de Trione X-100 dans l’étoile PBS, effectuer deux changements pendant cinq minutes chacun.Cette solution est en outre appelée étoile PBS T.Lavez abondamment l’échantillon avec une étoile PBS. Cinq changements pendant cinq minutes chacun. Éteignez les groupes aldéhydes résiduels avec 20 millimoles de glycine dans l’étoile PBS, deux fois pendant 10 minutes.Placez l’échantillon dans l’étoile PBS avec 1% BSA pendant une demi-heure. Pendant le blocage dans BSA, préparez le cocktail de réaction pour la détection EdU. L’ordre d’ajout des composants est important.La conjugaison biotine-azoture EdU est effectuée dans la chambre humide pour minimiser l’évaporation et les changements de concentration dans le cocktail réactionnel. Préparez la chambre humide. Placez le couvercle sur le parafilm avec une cellule tournée vers le haut et superposez 50 à 100 microlitres du cocktail de réaction sur le couvercle.La réaction prend 30 minutes à température ambiante. Arrêtez la réaction en lavant l’échantillon dans l’étoile PBS T, cinq fois pendant cinq minutes chacun. Bloquez à nouveau avec 1% BSA dans l’étoile PBS T pendant une autre demi-heure.Préparer la solution de streptavidine-Nanogold dans PBS star T avec 1% de BSA. Incuber l’échantillon avec de la streptavidine pendant la nuit à plus quatre degrés dans une chambre humide nouvellement préparée. La procédure est la même qu’avec la conjugaison biotine-azoture EdU.Arrêtez la réaction et lavez l’échantillon, cinq fois pendant 10 minutes chacun avec l’étoile PBS T.Stabiliser le complexe de biotine streptavidine par fixation supplémentaire va 1% glutaraldéhyde PBS étoile pendant une demi-heure. Éliminer le glutaraldéhyde par lavage intense à l’eau désionisée. Éteindre les groupes aldéhydes résiduels avec un milligramme par millilitre de borohydrure de sodium.Laver à nouveau soigneusement. La prochaine étape consiste à augmenter la taille des particules de Nanogold au moyen d’un dépôt d’argent sur le parcours d’or. Préparez des prémélanges pour minimiser l’activité de la chambre noire.Équilibrez les échantillons avec un tampon de lavage et passez à une chambre noire. Dans la chambre noire, mélangez les composants pour préparer la solution de lavage et appliquez-la sur les échantillons. La solution de poudre d’acacia est hautement visiculaire.Ainsi, lors du mélange des composants, faites basculer le tube lentement pour éviter la formation de bulles et de mousse. La réaction prend de deux à cinq minutes. Nous vous recommandons d’effectuer un test pour déterminer le temps de réaction optimal.Un temps d’incubation plus long peut entraîner un dépôt d’argent non spécifique. Pour arrêter la réaction, rincez rapidement l’échantillon avec trois à cinq changements de l’eau désionisée. Suivi de trois autres changements pendant cinq minutes chacun.Pour protéger les nanoparticules d’argent de la dissolution par le tétroxyde d’osmium, incuber les échantillons dans de l’acide tétrachloroaurique à 0,05% pendant deux minutes dans l’obscurité. Laver soigneusement à l’eau désionisée. À ce stade, un contraste supplémentaire est ajouté au matériau contenant de l’ADN.Saturer l’échantillon avec une coloration d’ADN DRAQ5. Ajouter la solution de diamionobenzidine à l’échantillon et incuber pendant une minute. Déplacez le couvercle dans la boîte de Petri inférieure en verre et placez-le sur la scène du microscope inversé.Irradier plusieurs champs de vision avec une lumière rouge de 640 nanomètres. Le panneau de gauche montre le blanchiment photo complet de DRAQ5. Sur le panneau de droite, le même champ de vision est imagé dans la lumière transmise montrant le précipité DAB.Laver les échantillons avec de l’eau désionisée. L’étape suivante doit être effectuée sous la hotte. Préparation d’une solution de tétroxyde d’osmium partiellement réduite.Fais attention. Cette substance est très volatile et toxique. Appliquer la solution préparée sur l’échantillon.À ce stade, les composés d’osmium réduits réagissent avec les dépôts de diamionobenzidine et augmentent le contraste de l’ADN. Éliminez la solution contenant de l’osmium conformément à votre réglementation locale et lavez les échantillons trois fois pendant cinq minutes chacun. L’échantillon est ensuite déshydraté dans une série de concentrations croissantes d’éthanol suivies de l’infiltration des cellules avec des mélanges de résine d’éthanol.Remplacez le mélange de résine d’alcool par de la résine pure fraîchement préparée. Remplissez le moule d’encastrement de taille appropriée avec une résine fraîchement préparée. Placez le couvercle avec une cellule tournée vers le bas au-dessus de la cavité remplie de résine.Durcir la résine pendant 24 heures à 37 degrés. Puis à 60 degrés pendant au moins deux jours. Retirez la résine d’une surface inférieure d’un couvercle.Déposer la dalle dans un azote liquide, puis transférer dans de l’eau bouillante. Le verre doit se détacher. Répétez l’opération si nécessaire.Les champs de vision irradiés doivent être clairement visibles en raison du dépôt de diamionobenzidine et de la coloration DAB. Découpez la zone d’intérêt de la dalle à l’aide de la scie à métaux ou de tout autre instrument approprié. Placez la découpe dans le support simple ultramicrotome.Configurez l’ultramicrotome pour le rognage final du bloc. À l’aide de la lame de rasoir, préparez le pilulier en forme de pyramide. La taille d’une zone plate au sommet de la pyramide devrait être d’environ 400 par 200 microns.Montez la pyramide préparée dans le bras ultramicrotome et installez le couteau. Préparez les sections. L’épaisseur de la section peut être ajustée pour répondre aux exigences expérimentales.Nous visons la tomographie EM. Nous avons donc préparé des sections d’une épaisseur de 250 nanomètres, également appelées sections semi-minces. Détachez les sections du bord du couteau et montez-les sur une grille de fente.Nous avons utilisé une grille de fentes, elles étaient rondes d’un millimètre pour être autour, une ouverture latérale d’un millimètre. La petite taille d’ouverture offre une meilleure stabilité des sections. Laissez les échantillons sécher sur la grille.En ce moment, les sections sont prêtes pour l’observation. Placez la grille dans le porte-échantillon du microscope électronique. Chargez l’échantillon dans le microscope électronique.Acquérir la série tilt. Les foyers de réplication dans les noyaux de cellules de mammifères présentent des modèles de distribution distincts en fonction de la progression de la phase S. Le marquage réussi de l’EdU confirmé par la réaction de clic avec de l’azoture marqué par fluorescence démontre un schéma de réplication typique dans la population cellulaire hétérogène après fixation du glutaraldéhyde sur le dessus.Le marquage de la streptavidine peut être influencé par le glutaraldéhyde. Vérifiez donc d’abord la coloration à la streptavidine de fluorescence dans les mêmes conditions que la streptavidine nanogold sur le fond. Le bon résultat de la procédure d’amélioration de l’argent est une coloration brun foncé de certains noyaux et une tache de cytoplaste jaune très faible, montrée sur le fond.L’avantage d’un étiquetage de pré-intégration est la possibilité de sélectionner des cellules pour le sectionnement. C’est possible à ce stade car les motifs d’étiquetage deviennent visibles sous un microscope à champ lumineux. L’étiquetage approprié permet d’obtenir les sites de réplication bien délimités.Arrowhead montre les fibres de chromatine colorées DAB. L’étiquetage de fond à droite est limité à quelques nanoparticules par micron carré. Les sections semi-minces sont prêtes pour la tomographie et ne nécessitent pas l’ajout de nanoparticules d’or.L’approche décrite utilisée pour les études de l’organisation de la chromatine sur des sites avec réplication activée. Pour l’analyse du réarrangement post-réplicatif de la chromatine, y compris l’imagerie à haute résolution de la ségrégation de la chromatine. Il est également utilisé pour le marquage répliqué de grands domaines chromosomiques et les études du repliement de la chromatine d’ordre supérieur et de l’hétérochromatine.Cette technique d’imagerie est également importante comme point de référence pour les données générées par d’autres approches non microscopiques. La méthode peut également être intégrée dans des études microscopiques corrélées, y compris des techniques de super résolution. Cela ouvre de nouveaux horizons dans l’étude de la structure d’ordre supérieur de la chromatine et de sa dynamique dans les différents états physiologiques de la cellule.

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