Name: imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
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Diese Arbeit wurde zum Teil von RSF (Grant #17-15-01290) und RFBR (Grant #19-015-00273) unterstützt. Die Autoren danken dem Lomonosov Moscow State University Development Program (PNR 5.13) und dem Nikon Center of Excellence in korrelativer Bildgebung am Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology für den Zugang zu bildgebenden Instrumenten.

Das Protokoll ist für adhärente Zellen optimiert und wurde an HeLa-, HT1080- und CHO-Zelllinien getestet.
1. Zellmarkierung und -fixierung
<ol><li>Plattenzellen auf säuregereinigten Deckgläsern in einer 3 cm Petrischale. Züchten Sie die Zellen in den Medien, die für die verwendete Zelllinie empfohlen werden, zu 70% Konfluenz.</li>
	<li>Fügen Sie EdU (5-Ethynyl-2'-desoxyuridin) aus 10 mM Stamm bis 10 μM Endkonzentration hinzu und legen Sie die Zellen für 10 min oder ...

<ol>
	<li>Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicating+large+genomes:+divide+and+conquer.">Replicating large genomes: divide and conquer.</a> Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).</li><li>M&#233;chali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+DNA+replication+origins:+Many+choices+for+appropriate+answers.">Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers.</a> Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).</li><li>Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+DNA+replication.">Organization of DNA replication.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).</li><li>Su, Q. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+reveals+spatiotemporal+propagation+of+human+replication+foci+mediated+by+CTCF-organized+chromatin+structures.">Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).</li><li>Leonhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+factories+in+living+cells.">Dynamics of DNA replication factories in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).</li><li>Philimonenko, A. A., Hodn&#253;, Z., Jackson, D. A., Hoz&#225;k, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microarchitecture+of+DNA+replication+domains.">The microarchitecture of DNA replication domains.</a> Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).</li><li>Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organizations+of+replicon+domains+during+DNA+synthetic+phase+in+the+mammalian+nucleus.">Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus.</a> Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+DNA+replication+sites+in+mammalian+cells.">Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).</li><li>Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+early+and+late+replicating+DNA+in+human+chromosome+territories.">Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories.</a> Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).</li><li>Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+three-dimensional+replication+patterns+during+the+S-phase,+analysed+by+double+labelling+of+DNA+and+confocal+microscopy.">Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy.</a> Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).</li><li>Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-like+chromatin:+Toward+understanding+the+real+chromatin+organization+present+in+the+cell.">Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell.</a> Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).</li><li>Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+early+chromosome+condensation:+A+hierarchical+folding,+axial+glue+model+of+chromosome+structure.">Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure.</a> Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).</li><li>Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+interphase+large-scale+chromatin+structure+from+analysis+of+engineered+chromosome+regions.">Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions.</a> Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 236 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation.">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li><li>Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChromEMT:+Visualizing+3D+chromatin+structure+and+compaction+in+interphase+and+mitotic+cells.">ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells.</a> Science. 357 (6349), (2017).</li><li>Hoz&#225;k, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+factories+and+nuclear+bodies:+the+ultrastructural+characterization+of+replication+sites+during+the+cell+cycle.">Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle.</a> Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).</li><li>Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+of+DNA+replication+reveals+dynamic+plasticity+of+large-scale+chromatin+fibers.">Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers.</a> Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+electron+microscopic+immunocytochemistry+with+silver-enhanced+1.4-nm+gold+particles+to+localize+GAD+in+the+cerebellar+nuclei.">The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).</li><li>Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+immunogold+labeling+confirms+large-scale+chromatin+folding+motifs.">In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs.</a> Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).</li><li>Sawada, H., Esaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nanogold+followed+by+silver+enhancement+and+gold+toning+for+preembedding+immunolocalization+in+osmium-fixed,+Epon-embedded+tissues.">Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freeze+substitution+fixation-based+gold+enlarging+technique+for+EM+studies+of+endocytosed+Nanogold-labeled+molecules.">A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).</li><li>Weipoltshammer, K., Sch&#233;fer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography.">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).</li></ol>

Die hier beschriebene Methode hat mehrere Vorteile gegenüber zuvor veröffentlichten Protokollen. Erstens eliminiert die Verwendung der Click-Chemie zur Markierung replizierter DNA die Notwendigkeit der DNA-Denaturierung, die für den BrdU-Nachweis mit Antikörpern erforderlich ist, wodurch die Chromatin-Ultrastruktur besser erhalten wird. 
Zweitens minimiert die Verwendung von Biotin als sekundärer Ligand, der nach der Glutaraldehydfixierung und dem ordnungsgemäßen Abschrecken von ungebun...

Die DNA-Replikation ist ein grundlegender biologischer Prozess, der für das originalgetreue Kopieren und Übertragen der genetischen Information während der Zellteilung erforderlich ist. Bei höheren Eukaryoten unterliegt die DNA-Replikation einer engen räumlich-zeitlichen Regulation, die sich in einer sequentiellen Aktivierung der Replikationsursprüngemanifestiert 1. Benachbarte Replikationsursprünge, die synchron ausgelöst werden, bilden Cluster von replicons2. Auf der Ebene der optischen Mikroskopie werden Stellen der laufenden DNA-Replikation als Replikationsherde unterschiedlicher Anzahl und Größe nachgewiesen. Replikationsherde zeigen spezifische Muster der räumlichen Verteilung innerhalb des Zellkerns, abhängig vom Replikationszeitpunkt der markierten DNA3,4, die wiederum eng mit ihrer Genaktivität korreliert ist. Dank der klar definierten Sequenz der DNA-Replikation, die streng in Raum und Zeit geordnet ist, ist die replizierende Markierung eine leistungsstarke Methode der präzisen DNA-Markierung nicht nur für die Untersuchung des Replikationsprozesses an sich, sondern auch zur Unterscheidung einer spezifischen DNA-Unterfraktion mit definierter Transkriptionsaktivität und Verdichtungsebene. Die Visualisierung von replizierendem Chromatin erfolgt in der Regel durch den Nachweis von Hauptproteinkomponenten der DNA-Replikationsmaschinerie (entweder durch Immunfärbung oder durch Expression fluoreszierender Protein-Tags5,6) oder durch die Einbeziehung modifizierter DNA-Synthesevorläufer 7,8,9,10 . Von diesen ermöglichen nur Methoden, die auf der Einarbeitung modifizierter Nukleotide in neu replizierte DNA basieren, die Erfassung von Konformationsänderungen im Chromatin während der Replikation und verfolgen das Verhalten replizierender Domänen nach Abschluss ihrer Replikation.
In höheren Eukaryoten fügt die DNA-Verpackung in Chromatin der Regulation grundlegender genetischer Funktionen (Transkription, Replikation, Reparation usw.) eine weitere Ebene der Komplexität hinzu. Die Chromatinfaltung beeinflusst die Zugänglichkeit der DNA zu regulatorischen Transfaktoren und DNA-Konformationsänderungen (Doppelhelix-Abwicklung), die für die Template-Synthese erforderlich sind. Daher ist es allgemein anerkannt, dass DNA-abhängige synthetische Prozesse im Zellkern einen strukturellen Übergang von Chromatin von seinem kondensierten, repressiven Zustand zu einer zugänglicheren, offenen Konformation erfordern. Zytologisch sind diese beiden Chromatinzustände als Heterochromatin und Euchromatin definiert. Es gibt jedoch immer noch keinen Konsens über die Art und Weise der DNA-Faltung im Zellkern. Die Hypothesen reichen von einem "Polymerschmelze" -Modell11, bei dem sich die nukleosomale Faser wie ein zufälliges Polymer verhält, bei dem die Packungsdichte durch Phasentrennungsmechanismen gesteuert wird, bis hin zu hierarchischen Faltungsmodellen, die die sequentielle Bildung von chromatinfaserähnlichen Strukturen mit zunehmender Dicke postulieren12,13. Hierarchische Faltungsmodelle haben kürzlich Unterstützung durch molekulare Ansätze erhalten, die auf der Analyse von In-situ-DNA-DNA-Kontakten (Chromosomenkonformationsabscheidung, 3C) basieren und die Existenz der Hierarchie der strukturellen Chromatindomänendemonstrieren 14. Es ist wichtig zu beachten, dass Replikationseinheiten sehr gut mit diesen Chromatindomänen korrelieren15. Die Hauptkritik an diesen Modellen basiert auf der potenziellen künstlichen Chromatinaggregation, die durch Probenvorbereitungsverfahren wie die Permeabilisierung von Zellmembranen und die Entfernung von Nicht-Chromatin-Komponenten verursacht wird, um den Chromatinkontrast für ultrastrukturelle Studien zu verbessern und gleichzeitig die Chromatin-Zugänglichkeit für verschiedene Sonden (z. B. Antikörper) zu verbessern. Jüngste technische Fortschritte bei der selektiven DNA-Färbung für die Elektronenmikroskopie durch DNA-bindende fluorophorvermittelte Photooxidation von Diaminobenzidin (ChromEMT6) haben die Beseitigung dieses Hindernisses ermöglicht. Die gleichen Überlegungen gelten jedoch für die elektronenmikroskopische Visualisierung der sich replizierenden DNA17,18. Hier beschreiben wir eine Technik, die die gleichzeitige hochauflösende ultrastrukturelle Kartierung von neu synthetisierter DNA und Gesamtchromatin in intakten aldehydvernetzten Zellen ermöglicht. Die Technik kombiniert den Nachweis von EdU-markierter DNA durch Click-Chemie mit biotinylierten Sonden und Streptavidin-Nanogold und ChromEMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555-azide</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>A20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>C3730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Boval</td>
			<td>LY-0080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>26544-38-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90-72-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin monomer</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90529-77-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25%, EM Grade)</td>
			<td>TED PELLA, INC</td>
			<td>18426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>258850010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141396.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>213462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>25134-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver lactate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>359750-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>S11223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Nanogold conjugate</td>
			<td>Nanoprobes</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrachloroauric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>HT1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L</td>
			<td>298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka Chemica</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper single slot grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Cy5 HQ</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife Ultra Wet 45o</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DU</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-tilt sample holder</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Multi Bio RS-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer</td>
			<td>Jeol</td>
			<td>JEM-2100</td>
			<td>Alternatives: FEI, Hitachi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UltraCut-E</td>
			<td>Alternatives: RMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography

Die Prinzipien der DNA-Faltung im Zellkern und ihre dynamischen Transformationen, die während der Erfüllung grundlegender genetischer Funktionen (Transkription, Replikation, Segregation usw.) auftreten, sind nach wie vor wenig verstanden, was zum Teil auf das Fehlen experimenteller Ansätze zur hochauflösenden Visualisierung spezifischer Chromatinorte in strukturell konservierten Kernen zurückzuführen ist. Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung replitiver Domänen in Monolayer-Zellkultur in situ vor, indem wir die EdU-Markierung neu synthetisierter DNA mit anschließender Markierungsdetektion mit Ag-Amplifikation von Nanogoldpartikeln und ChromEM-Färbung von Chromatin kombinieren. Dieses Protokoll ermöglicht die kontrastreiche, hocheffiziente Voreinbettungsmarkierung, die mit der traditionellen Glutaraldehydfixierung kompatibel ist und die beste strukturelle Konservierung von Chromatin für die Probenverarbeitung bei Raumtemperatur bietet. Ein weiterer Vorteil der Prä-Embedding-Kennzeichnung ist die Möglichkeit, Zellen von Interesse für die Schnittaufnahme vorzuselektieren. Dies ist besonders wichtig für die Analyse heterogener Zellpopulationen sowie für die Kompatibilität mit elektronentomographischen Ansätzen zur hochauflösenden 3D-Analyse der Chromatinorganisation an Replikationsstellen und zur Analyse der postreplizierenden Chromatin-Neuanordnung und Schwesterchromatid-Segregation in der Interphase.

Replikationsherde in Säugetierzellkernen zeigen je nach S-Phasen-Progression unterschiedliche Verteilungsmuster innerhalb des Kerns. Diese Muster korrelieren mit der transkriptionellen Aktivität der replizierten Loci. Da die hier vorgestellte Methode ein ziemlich starkes Fixationsverfahren verwendet, ist es ziemlich einfach, die repliktive Pulsmarkierung für den spezifischen Nachweis von Chromatin-Loci in verschiedenen Transkriptionszuständen zu verwenden, selbst unter Bedingungen, die eine beste strukturelle Konserv...

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Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Dieses Protokoll stellt eine Technik zur hochauflösenden Kartierung von Replikationsstellen in strukturell konserviertem Chromatin in situ vor, die eine Kombination aus voreingebetteter EdU-Streptatvid-Nanogold-Markierung und ChromEMT verwendet.

Abbildung replikativer Domänen in ultrastrukturell konserviertem Chromatin mittels Elektronentomographie

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Wir präsentieren ein Protokoll zur elektronenmikroskopischen Visualisierung der replizierenden Domänen in der Zelle durch die EdU-Markierung der neu synthetisierten DNA und Markierungsdetektion mit Silberverstärkung von Nanogoldpartikeln und ChromEM-Färbung des Chromatins. Dieses Protokoll gibt die kontrastreiche Voreinbettungsmarkierung mit herkömmlicher Glutaraldehydfixierung, die die beste strukturelle Konservierung des Chromatins für die Probenverarbeitung bei Raumtemperatur bietet. Dieses Protokoll ist für die Haftzelle optimiert, die auf den Deckgläsern in der Petrischale wächst.Fügen Sie EdU zu 10 Mikromol Endkonzentration hinzu und legen Sie die Zellen für die gewünschte Markierungszeit in den Inkubator. Fixieren Sie die markierten Zellen mit 2,5% Gluaradehydrat in einer 100-Millimol-Natriumcacodylatlösung für eine Stunde. Eine längere Fixationszeit kann sich nachteilig auf die EdU-Kennzeichnung auswirken.Entfernen Sie Glutaraldehyd, indem Sie die Proben mit PBS spülen, das mit fünf Millimol Magnesiumchlorid ergänzt wird, das weiterhin als PBS-Stern angesehen wird. Dreimal für 10 Minuten waschen. Permeabilisieren Sie Plasmamembranen mit 1% Lösung von Trione X-100 in PBS Star, nehmen Sie zwei Änderungen für jeweils fünf Minuten vor.Diese Lösung wird weiter als PBS star T.Ausführlich die Probe mit PBS star waschen. Fünf Änderungen für jeweils fünf Minuten. Löschen Sie die verbleibenden Aldehydgruppen mit 20 Millimol Glycin in PBS Star, zweimal für 10 Minuten.Legen Sie die Probe eine halbe Stunde lang mit 1% BSA in PBS star. Bereiten Sie während der Blockierung in BSA den Reaktionscocktail für die EdU-Erkennung vor. Die Reihenfolge der Komponentenaddition ist wichtig.Die EdU-Biotin-Azid-Konjugation wird in der feuchten Kammer durchgeführt, um die Verdunstung und Konzentrationsverschiebungen im Reaktionscocktail zu minimieren. Bereiten Sie die feuchte Kammer vor. Legen Sie das Deckglas mit einer Zelle nach oben auf den Parafilm und schichten Sie 50 bis 100 Mikroliter des Reaktionscocktails auf das Deckglas.Die Reaktion dauert bei Raumtemperatur 30 Minuten. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Probe in PBS-Stern T waschen, fünfmal für jeweils fünf Minuten. Blockieren Sie erneut mit 1% BSA in PBS-Stern T für eine weitere halbe Stunde.Streptavidin-Nanogold-Lösung in PBS star T mit 1%BSA vorbereiten. Inkubieren Sie die Probe mit Streptavidin über Nacht bei plus vier Grad in einer neu vorbereiteten Feuchtkammer. Das Verfahren ist das gleiche wie bei der EdU-Biotin-Azid-Konjugation.Stoppen Sie die Reaktion und waschen Sie die Probe, fünfmal für jeweils 10 Minuten mit PBS-Stern T.Stabilisieren Sie den Biotin-Streptavidin-Komplex durch zusätzliche Fixierung von 1% Glutaraldehyd PBS-Stern für eine halbe Stunde. Entfernen Sie Glutaraldehyd durch intensives Waschen mit entionisiertem Wasser. Restaldehydgruppen mit einem Milligramm pro Milliliter Natriumborhydrid abschrecken.Noch einmal gründlich waschen. Der nächste Schritt besteht darin, die Größe von Nanogold-Partikeln durch Silberabscheidung auf dem goldenen Kurs zu erhöhen. Bereiten Sie Premixe vor, um die Aktivität in der Dunkelkammer zu minimieren.Gleichen Sie die Proben mit dem Waschpuffer aus und begeben Sie sich in eine Dunkelkammer. Mischen Sie in der Dunkelkammer die Komponenten, um die Waschlösung vorzubereiten, und tragen Sie sie auf die Proben auf. Akazienpulverlösung ist hochvisisch.Während des Mischens der Komponenten schaukeln Sie das Rohr langsam, um Blasen- und Schaumbildung zu vermeiden. Die Reaktion dauert zwei bis fünf Minuten. Wir empfehlen, einen Testlauf durchzuführen, um die optimale Reaktionszeit zu bestimmen.Eine längere Inkubationszeit kann zu einer unspezifischen Silberabscheidung führen. Um die Reaktion zu stoppen, spülen Sie die Probe schnell mit drei bis fünf Änderungen des deionisierten Wassers ab. Gefolgt von drei weiteren Änderungen für jeweils fünf Minuten.Um die Silbernanopartikel vor der Auflösung durch das Osmiumtetroxid zu schützen, inkubieren Sie die Proben in 0,05% Tetrachloraurinsäure für zwei Minuten im Dunkeln. Gründlich mit deionisiertem Wasser waschen. In diesem Stadium wird dem DNA-haltigen Material zusätzlicher Kontrast hinzugefügt.Sättigen Sie die Probe mit DRAQ5-DNA-Färbung. Diamionobenzidinlösung in die Probe geben und eine Minute lang inkubieren. Bewegen Sie das Deckglas in die Petrischale mit Glasboden und legen Sie es auf den Tisch des umgekehrten Mikroskops.Bestrahlen Sie mehrere Sichtfelder mit 640 Nanometer rotem Licht. Das linke Feld zeigt die komplette Fotobleiche von DRAQ5. Auf der rechten Seite ist das gleiche Sichtfeld im Durchlichtlicht abgebildet, das DAB-Niederschlag zeigt.Waschen Sie Proben mit deionisiertem Wasser. Die nächste Stufe sollte unter dem Abzug durchgeführt werden. Hergestellt eine teilweise reduzierte Osmiumtetroxidlösung.Sei vorsichtig. Diese Substanz ist sehr flüchtig und giftig. Tragen Sie die vorbereitete Lösung auf die Probe auf.In diesem Stadium reagieren die reduzierten Osmiumverbindungen mit Diamionobenzidinablagerungen und erhöhen den Kontrast der DNA. Entsorgen Sie die osmiumhaltige Lösung gemäß Ihren lokalen Vorschriften und waschen Sie die Proben dreimal für jeweils fünf Minuten. Die Probe wird in einer Reihe von steigenden Ethanolkonzentrationen weiter dehydriert, gefolgt von der Infiltration der Zellen mit Ethanolharzmischungen.Ersetzen Sie die Alkoholharzmischung durch frisch zubereitetes reines Harz. Füllen Sie die richtig dimensionierte Einbettform mit einem frisch zubereiteten Harz. Legen Sie das Deckglas mit einer Zelle nach unten über den mit Harz gefüllten Hohlraum.Aushärten Sie das Harz für 24 Stunden bei 37 Grad. Dann bei 60 Grad für mindestens zwei Tage. Entfernen Sie Harz von einer Unterseite einer Abdeckung.Lassen Sie die Platte in einen flüssigen Stickstoff fallen und geben Sie sie dann in kochendes Wasser um. Das Glas sollte sich lösen. Wiederholen Sie dies bei Bedarf.Bestrahlte Sichtfelder sollten aufgrund der Diamionobenzidinabscheidung und der DAB-Färbung deutlich sichtbar sein. Schneiden Sie den Interessenbereich mit der Bügelsäge oder einem anderen geeigneten Instrument aus der Platte aus. Legen Sie den Ausschnitt in den einfachen Ultramikrotom-Halter.Richten Sie das Ultramikrotom für das endgültige Blocktrimmen ein. Bereiten Sie mit der Rasierklinge den pyramidenförmigen Pfeiler vor. Die Größe einer flachen Fläche auf der Spitze der Pyramide sollte etwa 400 x 200 Mikrometer betragen.Montieren Sie die vorbereitete Pyramide in den Ultramikrotomarm und installieren Sie das Messer. Bereiten Sie die Abschnitte vor. Die Profildicke kann an die experimentellen Anforderungen angepasst werden.Wir streben die EM-Tomographie an. Also haben wir Abschnitte mit einer Dicke von 250 Nanometern vorbereitet, die auch als Halbdünnschnitte bezeichnet werden. Lösen Sie die Abschnitte von der Messerkante und montieren Sie sie auf einem Schlitzgitter.Wir benutzten ein Schlitzgitter, sie waren rund ein Millimeter, um um herum zu sein, ein Millimeter seitliche Öffnung. Die geringe Öffnungsgröße sorgt für eine bessere Stabilität der Abschnitte. Lassen Sie die Proben auf dem Gitter trocknen.In diesem Moment sind die Abschnitte bereit für die Beobachtung. Legen Sie das Gitter in den elektronenmikroskopischen Probenhalter. Laden Sie die Probe in das Elektronenmikroskop.Erwerben Sie die Tilt-Serie. Replikationsherde in Zellkernen von Säugetieren zeigen je nach S-Phasen-Progression unterschiedliche Verteilungsmuster. Erfolgreiche EdU-Markierung, die durch die Klickreaktion mit fluoreszierend markiertem Azid bestätigt wurde, zeigt ein typisches Replikationsmuster in der heterogenen Zellpopulation nach Glutaraldehydfixierung an der Spitze.Die Streptavidin-Markierung kann durch Glutaraldehyd beeinflusst werden. Überprüfen Sie also zuerst die Fluoreszenz-Streptavidin-Färbung unter den gleichen Bedingungen wie Streptavidin-Nanogold auf dem Boden. Ein gutes Ergebnis des Silberverbesserungsverfahrens ist eine dunkelbraune Färbung einiger Kerne und eine sehr schwache gelbe Cytoplast-Färbung, die auf der Unterseite zu sehen ist.Vorteil einer Voreinbettungsbeschriftung ist die Möglichkeit, Zellen für den Schnitt auszuwählen. Dies ist in diesem Stadium möglich, da die Markierungsmuster unter einem Hellfeldmikroskop sichtbar werden. Die entsprechende Beschriftung führt zu den gut abgegrenzten Replikationsstandorten.Pfeilspitzen zeigen die DAB-gefärbten Chromatinfasern. Die Hintergrundbeschriftung auf der rechten Seite ist auf wenige Nanopartikel pro Quadratmikrometer beschränkt. Halbdünne Schnitte sind bereit für die Tomographie und erfordern keine Zugabe von Goldnanopartikeln.Der beschriebene Ansatz, der für die Studien der Chromatinorganisation an Standorten mit aktivierter Replikation verwendet wird. Zur Analyse der postreplizierten Neuanordnung von Chromatin einschließlich hochauflösender Bildgebung der Chromatinsegregation. Es wurde auch für die replizierte Markierung großer Chromosomendomänen und Studien zur Chromatinfaltung und Heterochromatin höherer Ordnung verwendet.Diese bildgebende Technik ist auch als Referenzpunkt für die Daten wichtig, die durch andere nicht-mikroskopische Ansätze erzeugt werden. Die Methode kann auch in korrelierte mikroskopische Studien einschließlich Superauflösungstechniken integriert werden. Dies eröffnet neue Horizonte in der Erforschung der Chromatin-Struktur höherer Ordnung und ihrer Dynamik in den verschiedenen physiologischen Zuständen der Zelle.

Research

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