Name: imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
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この作業は、RSF (助成金 #17-15-01290) と RFBR (助成金 #19-015-00273) によって部分的にサポートされました。著者らは、ロモノーソフ・モスクワ州立大学開発プログラム(PNR 5.13)とベロゼルスキー物理化学生物学研究所の相関イメージングにおけるニコン・センター・オブ・エクセレンスに、イメージング機器へのアクセスに感謝している。

このプロトコルは、接着細胞用に最適化されており、HeLa、HT1080、およびCHO細胞株で試験されました。
1. 細胞標識と固定
<ol><li>酸洗浄されたカバースリップ上のプレートセルを3cmのペトリ皿に入れます。使用される細胞株に推奨される培地中の細胞を70%コンフルエントに増殖させる。</li>
	<li>EdU(5-エチニル-2'-デオキシウリジン)を10 mMストックから10 μM最終濃...

<ol>
	<li>Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicating+large+genomes:+divide+and+conquer.">Replicating large genomes: divide and conquer.</a> Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).</li><li>M&#233;chali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+DNA+replication+origins:+Many+choices+for+appropriate+answers.">Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers.</a> Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).</li><li>Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+DNA+replication.">Organization of DNA replication.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).</li><li>Su, Q. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+reveals+spatiotemporal+propagation+of+human+replication+foci+mediated+by+CTCF-organized+chromatin+structures.">Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).</li><li>Leonhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+factories+in+living+cells.">Dynamics of DNA replication factories in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).</li><li>Philimonenko, A. A., Hodn&#253;, Z., Jackson, D. A., Hoz&#225;k, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microarchitecture+of+DNA+replication+domains.">The microarchitecture of DNA replication domains.</a> Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).</li><li>Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organizations+of+replicon+domains+during+DNA+synthetic+phase+in+the+mammalian+nucleus.">Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus.</a> Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+DNA+replication+sites+in+mammalian+cells.">Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).</li><li>Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+early+and+late+replicating+DNA+in+human+chromosome+territories.">Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories.</a> Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).</li><li>Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+three-dimensional+replication+patterns+during+the+S-phase,+analysed+by+double+labelling+of+DNA+and+confocal+microscopy.">Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy.</a> Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).</li><li>Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-like+chromatin:+Toward+understanding+the+real+chromatin+organization+present+in+the+cell.">Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell.</a> Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).</li><li>Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+early+chromosome+condensation:+A+hierarchical+folding,+axial+glue+model+of+chromosome+structure.">Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure.</a> Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).</li><li>Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+interphase+large-scale+chromatin+structure+from+analysis+of+engineered+chromosome+regions.">Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions.</a> Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 236 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation.">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li><li>Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChromEMT:+Visualizing+3D+chromatin+structure+and+compaction+in+interphase+and+mitotic+cells.">ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells.</a> Science. 357 (6349), (2017).</li><li>Hoz&#225;k, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+factories+and+nuclear+bodies:+the+ultrastructural+characterization+of+replication+sites+during+the+cell+cycle.">Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle.</a> Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).</li><li>Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+of+DNA+replication+reveals+dynamic+plasticity+of+large-scale+chromatin+fibers.">Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers.</a> Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+electron+microscopic+immunocytochemistry+with+silver-enhanced+1.4-nm+gold+particles+to+localize+GAD+in+the+cerebellar+nuclei.">The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).</li><li>Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+immunogold+labeling+confirms+large-scale+chromatin+folding+motifs.">In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs.</a> Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).</li><li>Sawada, H., Esaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nanogold+followed+by+silver+enhancement+and+gold+toning+for+preembedding+immunolocalization+in+osmium-fixed,+Epon-embedded+tissues.">Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freeze+substitution+fixation-based+gold+enlarging+technique+for+EM+studies+of+endocytosed+Nanogold-labeled+molecules.">A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).</li><li>Weipoltshammer, K., Sch&#233;fer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography.">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).</li></ol>

ここで説明する方法には、以前に公開されたプロトコルに比べていくつかの利点があります。第一に、複製されたDNAを標識するためにClick-chemistryを使用することで、抗体によるBrdU検出のためのDNA変性の前提条件の必要性が排除され、クロマチンの超構造をよりよく保存できます。 
第二に、グルタルアルデヒド固定および結合していないアルデヒド基の適切なクエンチ後...

DNA複製は、細胞分裂中の遺伝情報の忠実なコピーと伝達に必要な基本的な生物学的プロセスです。高等真核生物では、DNA複製は厳しい時空間調節を受け、これは複製起点1の逐次活性化に現れる。同期的に起動する隣接するレプリケーション オリジンは、レプリコン2 のクラスターを形成します。光学顕微鏡のレベルでは、進行中のDNA複製の部位は、様々な数およびサイズの複製病巣として検出される。複製病巣は、標識されたDNA 3,4の複製タイミングに応じて細胞核内の空間分布の特定のパターンを示し、これは次に、その遺伝子活性と密接に相関している。空間と時間で厳密に順序付けられた明確に定義されたDNA複製配列のおかげで、複製標識は、複製プロセス自体の研究だけでなく、定義された転写活性および圧縮レベルを有する特定のDNAサブフラクションを区別するためにも、正確なDNA標識の強力な方法である。複製クロマチンの可視化は、通常、DNA複製機構の主要タンパク質成分の検出(免疫染色または蛍光タンパク質タグ5,6の発現による)または修飾DNA合成前駆体の組み込みによって行われる7,8,9,10 .これらのうち、新しく複製されたDNAへの改変ヌクレオチドの組み込みに基づく方法のみが、複製中のクロマチンの立体構造変化の捕捉を可能にし、複製完了後の複製ドメインの挙動を追跡する。
高等真核生物では、クロマチンへのDNAパッケージングは、基本的な遺伝的機能(転写、複製、修復など)の調節にさらなるレベルの複雑さを加える。クロマチンフォールディングは、鋳型合成に必要な調節トランスファクターおよびDNA立体構造変化(二重らせん巻き戻し)に対するDNAのアクセス可能性に影響します。したがって、細胞核におけるDNA依存性の合成プロセスには、クロマチンの凝縮した抑制状態から、よりアクセスしやすく、開いた立体構造への構造遷移が必要であることが一般に受け入れられている。細胞学的には、これら2つのクロマチン状態は、ヘテロクロマチンおよびユークロマチンとして定義される。しかし、核内でDNAが折り畳まれる様式については、まだコンセンサスがない。この仮説は、ヌクレオソーム繊維が相分離機構によって充填密度が制御されるランダムなポリマーとして振る舞う「ポリマー溶融」モデル11から、厚さの増加12、13のクロマチン繊維様構造の逐次形成を仮定する階層折り畳みモデルまで及ぶ。階層フォールディングモデルは最近、in situDNA−DNA接触(染色体立体構造キャプチャ、3C)の解析に基づく分子アプローチから支持を得て、クロマチン構造ドメインの階層の存在を実証した14。複製単位は、これらのクロマチンドメイン15と非常によく相関していることに注意することが重要です。これらのモデルの主な批判は、細胞膜の透過処理や非クロマチン成分の除去などのサンプル調製手順によって引き起こされる潜在的な人工クロマチン凝集に基づいており、超構造研究のためのクロマチンコントラストを改善しながら、様々なプローブ(例えば、抗体)のクロマチンアクセシビリティを改善する。DNA結合性フルオロフォア媒介のジアミノベンジジン(ChromEMT6)の光酸化による電子顕微鏡検査のための選択的DNA染色における最近の技術的進歩は、この障害の排除を可能にした。しかし、複製DNAの電子顕微鏡可視化についても同じ考察が成り立つ17,18.ここでは、インタクトなアルデヒド架橋細胞において、新たに合成されたDNAとトータルクロマチンの同時高分解能超微細構造マッピングを可能にする技術について説明します。この技術は、クリックケミストリーによるEdU標識DNAの検出と、ビオチン化プローブ、ストレプトアビジン-ナノゴールド、およびChromEMTを組み合わせたものです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555-azide</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>A20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>C3730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Boval</td>
			<td>LY-0080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>26544-38-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90-72-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin monomer</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90529-77-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25%, EM Grade)</td>
			<td>TED PELLA, INC</td>
			<td>18426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>258850010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141396.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>213462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>25134-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver lactate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>359750-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>S11223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Nanogold conjugate</td>
			<td>Nanoprobes</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrachloroauric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>HT1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L</td>
			<td>298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka Chemica</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper single slot grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Cy5 HQ</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife Ultra Wet 45o</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DU</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-tilt sample holder</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Multi Bio RS-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer</td>
			<td>Jeol</td>
			<td>JEM-2100</td>
			<td>Alternatives: FEI, Hitachi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UltraCut-E</td>
			<td>Alternatives: RMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography

細胞核におけるDNAフォールディングの原理と、基本的な遺伝子機能(転写、複製、分離など)の充足中に起こるその動的形質転換は、構造的に保存された核における特定のクロマチン遺伝子座の高分解能可視化に対する実験的アプローチの欠如のために、ほとんど理解されていないままである。ここでは、新たに合成されたDNAのEdU標識と、その後の標識検出とナノ金粒子のAg増幅、クロマチンのChromEM染色を組み合わせることにより、単層細胞培養における複製ドメインを その場で可視化するためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、室温サンプル処理のためのクロマチンの最良の構造保存を提供する従来のグルタルアルデヒド固定と互換性のある、高コントラスト、高効率の埋め込み前標識を可能にします。事前埋め込み標識の別の利点は、切片化のために目的の細胞を予め選択する可能性である。これは、不均一な細胞集団の分析、ならびに複製部位におけるクロマチン組織の高分解能3D分析に対する電子断層撮影アプローチとの適合性、および複製後のクロマチン再配列および相間における姉妹染色分体偏析の分析にとって特に重要である。

哺乳動物細胞核における複製病巣は、S期進行に応じて核内の分布の明確なパターンを示す。これらのパターンは、複製される遺伝子座の転写活性と相関する。ここで提示された方法は、かなり強い固定手順を利用するので、室温化学固定によって得られたクロマチンの最良の構造保存を提供する条件下でも、様々な転写状態におけるクロマチン遺伝子座の特異的検出に複製パルス標識を使用...

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Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

このプロトコルは、事前埋め込みEdU-ストレプトアビジン-ナノゴールド標識とChromEMTの組み合わせを採用した、構造的に保存されたクロマチンin in situにおける 複製部位の高解像度マッピングのための技術を提示する。

電子断層撮影による超構造保存クロマチン中の複製ドメインのイメージング

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

我々は、新たに合成されたDNAのEdU標識とナノ金粒子の銀増強による標識検出およびクロマチンのChromEM染色による細胞内の複製ドメインの電子顕微鏡可視化のためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、従来のグルタルアルデヒド固定による高コントラストのプレ包埋標識を提供し、室温サンプル処理のためのクロマチンの最良の構造保存を提供します。このプロトコルは、ペトリ皿のカバースリップ上で増殖する付着細胞に対して最適化されている。最終濃度10マイクロモルにEdUを加え、所望の標識時間の間、細胞をインキュベーターに入れる。標識細胞を100ミリモルのカコジル酸ナトリウム溶液中の2.5%グルアラデヒド水で1時間固定する。固定時間が長くなると、EdU標識に悪影響を及ぼす可能性があります。5ミリモルの塩化マグネシウムを添加したPBSで試料をすすぐことによってグルタルアルデヒドを除去し、さらにPBSスターとみなす。10分間3回洗う。PBSスター中のトリオーネX-100の1%溶液で原形質膜を透過処理し、それぞれ5分間2つの変更を行う。この溶液はさらにPBSスターT.と呼ばれます.PBSスターでサンプルを広範囲に洗浄します。それぞれ 5 分間に 5 つの変更を行います。PBSスター中の20ミリモルのグリシンで残留アルデヒド基を、10分間2回クエンチする。サンプルを1%BSAのPBSスターに30分間置きます。BSAでブロッキングしながら、EdU検出用の反応カクテルを準備する。成分添加の順序は重要です。EdUビオチン - アジドコンジュゲーションは、反応カクテル内の蒸発および濃度シフトを最小限に抑えるために、湿潤チャンバ内で行われる。湿った部屋を準備します。細胞を上に向けてパラフィルム上にカバースリップを置き、50〜100マイクロリットルの反応カクテルをカバースリップ上に重ねる。反応は室温で30分かかる。試料をPBSスターTで洗浄して反応を停止し、それぞれ5分間を5回行った。PBSスターTの1%BSAでさらに30分間ブロックします。ストレプトアビジン-ナノゴールド溶液をPBSスターTに1%BSAで調製する。サンプルをストレプトアビジンと共に、新しく調製した湿ったチャンバー内でプラス4度で一晩インキュベートする。手順は、EdUビオチン - アジドコンジュゲーションと同じである。反応を停止し、試料を洗浄し、PBSスターT.T安定化ビオチンストレプトアビジン複合体をPBSスターでそれぞれ10分間5回、30分間、PBSスターの1%グルタルアルデヒドで安定化させる。脱イオン水で激しく洗浄してグルタルアルデヒドを除去する。残留アルデヒド基を水素化ホウ素ナトリウム1ミリリットルあたり1ミリグラムでクエンチする。もう一度よく洗ってください。次のステップは、ゴールデンコース上の銀堆積によってナノゴールド粒子のサイズを増加させることである。暗室の活動を最小限に抑えるためにプレミックスを準備します。洗浄バッファーでサンプルを平衡化し、暗室に進みます。暗室で成分を混合して洗浄液を調製し、それをサンプルに塗布する。アカシア粉末溶液は、非常に視認性が高い。したがって、成分を混合している間は、気泡や泡の形成を避けるためにチューブをゆっくりと揺らしてください。反応には2〜5分かかります。最適な反応時間を決定するためにテストランを実行することをお勧めします。より長いインキュベーション時間は、不特定の銀沈着をもたらし得る。反応を止めるには、3~5種類のイオン交換水を入れてサンプルを素早くすすいでください。その後、それぞれ5分間、さらに3つの変更が行われました。四酸化オスミウムによる溶解から銀ナノ粒子を保護するために、サンプルを0.05%テトラクロロ金酸中で暗所で2分間インキュベートする。イオン交換水で十分に洗ってください。この段階で、さらなるコントラストがDNA含有物質に付加される。サンプルをDRAQ5 DNA染色で飽和させます。ジアミオノベンジジン溶液をサンプルに加え、1分間インキュベートする。カバースリップをガラス底のペトリ皿に移動し、倒立顕微鏡のステージに置きます。640ナノメートルの赤色光で複数の視野を照射する。左パネルは、DRAQ5の完全な写真漂白を示しています。右側のパネルでは、DAB沈殿物を示す透過光で同じ視野が撮像されている。脱イオン水でサンプルを洗浄します。次の段階はヒュームフードの下で行われるべきです。部分還元型四酸化オスミウム溶液を調製した。注意してください。この物質は非常に揮発性で有毒です。調製した溶液を試料上に塗布する。この段階では、還元されたオスミウム化合物はジアミオノベンジジン沈着と反応し、DNAのコントラストを増加させる。オスミウム含有溶液は、地域の規制に従って廃棄し、サンプルを3回、それぞれ5分間洗浄します。サンプルは、エタノール濃度を上昇させる一連の中でさらに脱水され、続いてエタノール樹脂混合物による細胞の浸潤が続く。アルコールレジンミックスを新しく調製した純樹脂に置き換えます。適切なサイズの埋め込み型に、新しく調製した樹脂を充填します。セルを下に向けてカバースリップを樹脂で満たされたキャビティの上に置きます。樹脂を37度で24時間硬化させる。その後、少なくとも2日間60度で。カバーの底面から樹脂を取り出します。スラブを液体窒素に落とし、沸騰した水に移します。ガラスが外れる必要があります。必要に応じて繰り返します。照射された視野は、ジアミオノベンジジン沈着およびDAB染色のためにはっきりと見えるべきである。弓のこぎりまたはその他の適切な器具を使用して、スラブから関心のある領域を切り取ります。切り欠きをウルトラミクロトームのシンプルホルダーに入れます。最終的なブロックトリミング用にウルトラミクロトームを設定します。カミソリの刃を使って、ピラミッド型の枕を用意します。ピラミッドの上の平らな領域のサイズは、約400 x 200ミクロンでなければなりません。準備したピラミッドをウルトラミクロトームアームに取り付け、ナイフを取り付けます。セクションを準備します。断面の厚さは、実験要件に合わせて調整できます。EM断層撮影を目指しています。そこで、半薄切片とも呼ばれる厚さ250ナノメートルの切片を用意しました。ナイフの端からセクションを取り外し、スロットグリッドに取り付けます。私たちはスロットグリッドを使用しました、彼らは周りにあるために丸い1ミリメートル、1ミリメートルの側面開口部でした。小さな開口部サイズは、セクションのより良い安定性を提供します。グリッド上でサンプルを乾燥させます。この時点で、セクションは観測の準備ができています。グリッドを電子顕微鏡サンプルホルダーに入れます。試料を電子顕微鏡に装填する。チルトシリーズを取得します。哺乳動物細胞核における複製病巣は、S期進行に応じて明確な分布パターンを示す。蛍光標識アジドとのクリック反応によって確認された成功したEdU標識は、上部にグルタルアルデヒド固定後の不均一な細胞集団における典型的な複製パターンを実証する。ストレプトアビジン標識は、グルタルアルデヒドの影響を受け得る。そこでまず、底面のストレプトアビジンナノゴールドと同じ条件で蛍光ストレプトアビジン染色を確認する。銀増強手順の良好な結果は、底部に示されているいくつかの核の暗褐色染色および非常にかすんだ黄色のサイトプラスト染色である。事前埋め込み標識の利点は、切片化のために細胞を選択する可能性である。この段階では、標識パターンが明視野顕微鏡下で見えるようになるため、可能です。適切なラベル付けにより、適切に区切られたレプリケーション サイトが作成されます。矢印はクロマチン繊維を染色したDABを示す。右側のバックグラウンド標識は、1平方ミクロンあたり数個のナノ粒子に限定されています。半薄い切片は断層撮影の準備ができており、金ナノ粒子を添加する必要はありません。複製が有効な部位におけるクロマチン組織の研究に使用される記載されたアプローチ。クロマチン分離の高解像度イメージングを含むクロマチンの複製後再配列の分析用。また、大きな染色体ドメインの複製標識や、高次クロマチンフォールディングおよびヘテロクロマチンの研究にも使用されます。この画像化技術は、他の非顕微鏡的アプローチによって生成されるデータの基準点としても重要である。この方法は、超解像技術を含む相関顕微鏡研究にも適合させることができる。これは、細胞の様々な生理学的状態におけるクロマチン高次構造とそのダイナミクスの研究における新しい地平を開く。

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

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RNA精製によってクロマチンの単離（チャープ）

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

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電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

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成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

enChIPによって特定のゲノム領域と関連する分子の同定の単離

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

走査型透過電子トモグラフィーにより太い生物学的サンプルの調製と観察

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

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3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

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Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

高圧低温電子トモグラフィー法によるシアノ バクテリアの DNA 締固めの可視化

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

超構造保存細胞における膜蛋白質局在化の電子顕微鏡分析のためのクライオAPEX法

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...