Name: imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography at JoVE.com

이 작업은 RSF (보조금 #17-15-01290) 및 RFBR (보조금 #19-015-00273)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 저자는 Lomonosov Moscow State University 개발 프로그램 (PNR 5.13)과 Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology의 상관 관계 이미징 분야의 Nikon Center of Excellence에 감사 드리며 이미징 계측에 대한 액세스를 제공합니다.

상기 프로토콜은 부착성 세포에 최적화되어 있으며 HeLa, HT1080 및 CHO 세포주에서 시험하였다.
1. 세포 표지 및 고정
<ol><li>산성 세척 커버 슬립에있는 플레이트 셀은 3cm 페트리 접시에 담겨 있습니다. 70% 컨플루언시로 사용되는 세포주에 권장되는 배지에서 세포를 성장시킨다.</li>
	<li>10 mM 스톡으로부터 10 μM 최종 농도까지 EdU (5-에티닐-2'-데옥시우리딘)를 첨가하?...

<ol>
	<li>Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicating+large+genomes:+divide+and+conquer.">Replicating large genomes: divide and conquer.</a> Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).</li><li>M&#233;chali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+DNA+replication+origins:+Many+choices+for+appropriate+answers.">Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers.</a> Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).</li><li>Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+DNA+replication.">Organization of DNA replication.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).</li><li>Su, Q. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+reveals+spatiotemporal+propagation+of+human+replication+foci+mediated+by+CTCF-organized+chromatin+structures.">Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).</li><li>Leonhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+factories+in+living+cells.">Dynamics of DNA replication factories in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).</li><li>Philimonenko, A. A., Hodn&#253;, Z., Jackson, D. A., Hoz&#225;k, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microarchitecture+of+DNA+replication+domains.">The microarchitecture of DNA replication domains.</a> Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).</li><li>Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organizations+of+replicon+domains+during+DNA+synthetic+phase+in+the+mammalian+nucleus.">Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus.</a> Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+DNA+replication+sites+in+mammalian+cells.">Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).</li><li>Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+early+and+late+replicating+DNA+in+human+chromosome+territories.">Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories.</a> Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).</li><li>Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+three-dimensional+replication+patterns+during+the+S-phase,+analysed+by+double+labelling+of+DNA+and+confocal+microscopy.">Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy.</a> Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).</li><li>Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-like+chromatin:+Toward+understanding+the+real+chromatin+organization+present+in+the+cell.">Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell.</a> Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).</li><li>Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+early+chromosome+condensation:+A+hierarchical+folding,+axial+glue+model+of+chromosome+structure.">Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure.</a> Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).</li><li>Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+interphase+large-scale+chromatin+structure+from+analysis+of+engineered+chromosome+regions.">Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions.</a> Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 236 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation.">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li><li>Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChromEMT:+Visualizing+3D+chromatin+structure+and+compaction+in+interphase+and+mitotic+cells.">ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells.</a> Science. 357 (6349), (2017).</li><li>Hoz&#225;k, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+factories+and+nuclear+bodies:+the+ultrastructural+characterization+of+replication+sites+during+the+cell+cycle.">Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle.</a> Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).</li><li>Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+of+DNA+replication+reveals+dynamic+plasticity+of+large-scale+chromatin+fibers.">Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers.</a> Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+electron+microscopic+immunocytochemistry+with+silver-enhanced+1.4-nm+gold+particles+to+localize+GAD+in+the+cerebellar+nuclei.">The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).</li><li>Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+immunogold+labeling+confirms+large-scale+chromatin+folding+motifs.">In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs.</a> Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).</li><li>Sawada, H., Esaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nanogold+followed+by+silver+enhancement+and+gold+toning+for+preembedding+immunolocalization+in+osmium-fixed,+Epon-embedded+tissues.">Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freeze+substitution+fixation-based+gold+enlarging+technique+for+EM+studies+of+endocytosed+Nanogold-labeled+molecules.">A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).</li><li>Weipoltshammer, K., Sch&#233;fer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography.">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).</li></ol>

여기에 설명된 방법은 이전에 게시된 프로토콜에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 복제된 DNA를 표지하기 위한 클릭화학의 사용은 항체를 이용한 BrdU 검출을 위한 DNA 변성 전제조건의 필요성을 제거하여, 크로마틴 울트라구조를 더 잘 보존한다. 
둘째, 글루타르알데히드 고정 및 결합되지 않은 알데히드 그룹의 적절한 담금질 후에 생성되는 보조 리간드로 비오틴의 활용?...

DNA 복제는 세포 분열 동안 유전 정보의 충실한 복사 및 전달에 필요한 기본적인 생물학적 과정입니다. 고등 진핵생물에서, DNA 복제는 엄격한 시공간-시간적 조절을 받게 되며, 이는 복제 기원의 순차적 활성화로 나타난다1. 이웃 복제 기원은 동기적으로 발사되어 replicons2의 클러스터를 형성합니다. 광학 현미경 검사의 수준에서, 진행중인 DNA 복제 부위는 다양한 수와 크기의 복제 초점으로 검출됩니다. 복제 초점은 표지된 DNA 3,4의 복제 타이밍에 따라 세포 핵 내 공간 분포의 특정 패턴을 표시하며, 이는 차례로 유전자 활성과 밀접한 상관 관계가 있다. 공간과 시간에 엄격하게 정렬된 잘 정의된 DNA 복제 시퀀스 덕분에, 복제 표지는 복제 과정 그 자체에 대한 연구뿐만 아니라 전사 활성 및 압축 수준이 정의된 특정 DNA 하위 분획을 구별하는 강력한 DNA 표지 방법입니다. 복제 크로마틴의 시각화는 일반적으로 DNA 복제 기계의 주요 단백질 성분 검출 (면역 염색 또는 형광 단백질 태그5,6의 발현) 또는 변형 된 DNA 합성 전구체 7,8,9,10의 혼입을 통해 수행됩니다. . 이들 중에서, 변형된 뉴클레오티드를 새로 복제된 DNA에 혼입하는 것에 기초한 방법만이 복제 동안 크로마틴의 형태적 변화의 포획을 허용하고, 복제가 완료된 후 복제 도메인의 거동을 추적한다.
고등 진핵생물에서 염색질로의 DNA 패키징은 기본 유전 기능 (전사, 복제, 배상 등)의 조절에 또 다른 수준의 복잡성을 추가합니다. 크로마틴 폴딩은 주형 합성에 필요한 조절 트랜스 팩터 및 DNA 형태 변화 (이중 나선 풀기)에 대한 DNA의 접근성에 영향을 미칩니다. 따라서, 세포 핵에서의 DNA 의존성 합성 과정은 크로마틴의 응축되고 억압적인 상태로부터 보다 접근하기 쉽고, 개방된 형태로의 구조적 전이를 필요로 한다는 것이 일반적으로 받아들여진다. 세포학적으로, 이들 두 크로마틴 상태는 헤테로크로마틴 및 유크로마틴으로 정의된다. 그러나 핵에서 DNA 폴딩 방식에 관한 합의는 아직 이루어지지 않았다. 가설은 핵솜 섬유가 패킹 밀도가 상 분리 메커니즘에 의해 제어되는 임의의 중합체로서 행동하는 "중합체 용융" 모델(11)로부터, 두께12,13을 증가시키는 크로마틴 섬유형 구조의 순차적 형성을 가정하는 계층적 폴딩 모델에 이르기까지 다양하다. 계층적 폴딩 모델은 최근 계내 DNA-DNA 접촉(염색체 입체 형태 포획, 3C)의 분석에 기초한 분자 접근법으로부터 지지를 얻었으며, 이는 크로마틴 구조 도메인(14)의 계층 구조의 존재를 입증한다. 복제 단위는 이러한 크로마틴 도메인(15)과 매우 잘 상관관계가 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 이들 모델에 대한 주요 비판은 다양한 프로브 (예 : 항체)에 대한 크로마틴 접근성을 향상시키면서 초 구조 연구를 위해 크로마틴 대비를 개선하기 위해 세포막의 투과 및 비 염색질 성분의 제거와 같은 샘플 준비 절차에 의해 야기 된 잠재적 인 인공 염색질 응집에 기초합니다. DNA 결합 형광단에 의한 전자 현미경을 위한 선택적 DNA 염색의 최근 기술 발전은 디아미노벤지딘(ChromEMT6)의 광산화-매개 이러한 장애물의 제거를 허용하였다. 그러나, DNA17,18을 복제하는 전자 현미경 시각화에 대해서도 동일한 고려사항이 적용된다. 여기서 우리는 무손상 알데히드 가교 세포에서 새로 합성 된 DNA와 총 크로마틴의 동시 고해상도 초구조적 매핑을 가능하게하는 기술을 설명합니다. 이 기술은 클릭 화학에 의한 EdU 표지 DNA의 검출을 비오티닐화 프로브 및 스트렙타비딘-나노골드 및 ChromEMT와 결합합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555-azide</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>A20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>C3730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Boval</td>
			<td>LY-0080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>26544-38-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90-72-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin monomer</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90529-77-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25%, EM Grade)</td>
			<td>TED PELLA, INC</td>
			<td>18426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>258850010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141396.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>213462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>25134-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver lactate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>359750-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>S11223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Nanogold conjugate</td>
			<td>Nanoprobes</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrachloroauric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>HT1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L</td>
			<td>298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka Chemica</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper single slot grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Cy5 HQ</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife Ultra Wet 45o</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DU</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-tilt sample holder</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Multi Bio RS-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer</td>
			<td>Jeol</td>
			<td>JEM-2100</td>
			<td>Alternatives: FEI, Hitachi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UltraCut-E</td>
			<td>Alternatives: RMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography

세포 핵에서 DNA 폴딩의 원리와 기본적인 유전 기능 (전사, 복제, 분리 등)의 이행 중에 발생하는 동적 변형은 부분적으로 구조적으로 보존 된 핵에서 특정 염색질 유전자좌의 고해상도 시각화에 대한 실험 접근법이 부족하기 때문에 잘 이해되지 않고 있습니다. 여기서 우리는 새로 합성 된 DNA의 EdU 표지와 나노 골드 입자의 Ag 증폭 및 크로마틴의 ChromEM 염색을 통한 후속 라벨 검출을 결합하여 단층 세포 배양물 에서 복제 도메인을 시각화하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 상온 시료 처리를 위한 크로마틴의 최상의 구조적 보존을 제공하는 전통적인 글루타르알데히드 고정과 호환되는 고대비, 고효율 사전 임베딩 라벨링을 가능하게 합니다. 라벨링을 사전 임베딩하는 또 다른 이점은 단면화를 위해 관심있는 세포를 미리 선택할 수 있다는 것이다. 이것은 이종 세포 집단의 분석뿐만 아니라 복제 부위에서 크로마틴 조직의 고해상도 3D 분석에 대한 전자 단층 촬영 접근법과의 호환성, 복제 후 크로마틴 재배열 및 자매 염색질 분리의 분석에 특히 중요합니다.

포유류 세포 핵에서의 복제 초점은 S상 진행에 따라 핵 내 분포의 뚜렷한 패턴을 나타낸다. 이러한 패턴은 복제되는 유전자좌의 전사 활성과 상관관계가 있다. 여기에 제시된 방법은 다소 강한 고정 절차를 이용하기 때문에, 실온 화학적 고정에 의해 얻어지는 크로마틴의 최상의 구조적 보존을 제공하는 조건 하에서도 다양한 전사 상태에서 크로마틴 유전자좌의 특정 검출을 위해 복제 펄스 라벨?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography at JoVE.com

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

이 프로토콜은 구조적으로 보존된 크로마틴에서 복제 부위의 고해상도 매핑을 위한 기술을 제시하며 , 이 기술은 사전 임베딩 EdU-스트렙타비딘-나노골드 라벨링과 ChromEMT의 조합을 사용합니다.

전자 단층 촬영에 의한 초구조적으로 보존 된 크로마틴의 복제 도메인 이미징

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

우리는 새로 합성 된 DNA의 EdU 표지 및 나노 골드 입자의 은색 강화 및 크로마틴의 ChromEM 염색을 통한 라벨 검출에 의해 세포 내의 복제 도메인의 전자 현미경 시각화를위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 상온 샘플 처리를 위해 크로마틴의 최상의 구조적 보존을 제공하는 전통적인 글루타르알데히드 고정으로 고대비 사전 임베딩 라벨링을 제공합니다. 이 프로토콜은 페트리 접시의 커버슬립 상에서 성장하는 부착 세포에 최적화되어 있습니다.EdU를 최종 농도 10 마이크로몰에 첨가하고, 원하는 라벨링 시간 동안 세포를 인큐베이터에 넣는다. 표지 된 세포를 100 밀리몰 소듐 카코딜레이트 용액에 2.5 % gluaradehydrate로 1 시간 동안 고정하십시오. 고정 시간이 길면 EdU 라벨링에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다.샘플을 다섯 밀리몰의 염화마그네슘으로 보충된 PBS로 헹구어 글루타르알데히드를 제거하고, PBS 스타로 더 간주한다. 10 분 동안 세 번 씻으십시오. PBS 별에 Trione X-100의 1 % 용액으로 원형질막을 투과시키고 각각 5 분 동안 두 번 변경하십시오.이 용액은 PBS 스타 T.Exexex로 샘플을 PBS 스타로 광범위하게 세척하는 것으로 추가로 지칭된다. 각각 다섯 분 동안 다섯 가지 변경 사항. 잔류 알데히드 그룹을 PBS 별에 20 밀리몰의 글리신으로 담금질하고, 10분 동안 2회 켄칭한다.샘플을 1%BSA로 PBS 별에 넣고 반시간 동안 보관한다. BSA에서 차단하면서 EdU 검출을 위해 반응 칵테일을 준비하십시오. 구성 요소 추가 순서가 중요합니다.EdU 비오틴-아지드 컨쥬게이션은 반응 칵테일에서 증발 및 농도 이동을 최소화하기 위해 습한 챔버에서 수행된다. 촉촉한 챔버를 준비하십시오. 커버슬립을 파라 필름 위에 올려놓고 세포를 위로 향하게 하고 50 내지 100 마이크로리터의 반응 칵테일을 커버슬립 위에 올려 놓는다.반응은 실온에서 30 분 걸립니다. PBS 별 T에서 샘플을 세척하여, 각각 다섯 분 동안 다섯 번 세척하여 반응을 중지시킨다. PBS 별 T에 1%BSA로 다시 차단하여 반 시간 더 차단합니다.PBS 별 T에 스트렙타비딘-나노골드 용액을 1%BSA로 준비한다. 샘플을 스트렙타비딘으로 하룻밤 동안 플러스 네 도에서 새로 준비된 습한 챔버에서 배양하십시오. 이 절차는 EdU 비오틴-아지드 접합과 동일합니다.반응을 중지하고 샘플을 세척하고, PBS로 각각 10분 동안 다섯 번 스타티.안정화 비오틴 스트렙타비딘 복합체를 추가로 고정시켜 PBS 스타글루타르알데히드 1%글루타르알데히드를 반시간 동안 고정시킨다. 탈이온수로 강렬한 세척으로 글루타르알데히드를 제거하십시오. 잔류 알데히드 그룹을 밀리리터 나트륨 보로하이드라이드 당 하나의 밀리그램으로 담금질한다.다시 철저히 씻으십시오. 다음 단계는 황금 코스에 은을 증착함으로써 나노 금 입자의 크기를 증가시키는 것입니다. 암실 활동을 최소화하기 위해 프리믹스를 준비하십시오.샘플을 세척 완충액으로 평형화시키고 암실로 진행하십시오. 암실에서 성분을 혼합하여 세척액을 준비하고 샘플에 적용하십시오. 아카시아 분말 용액은 매우 점도가 높습니다.따라서 구성 요소를 혼합하는 동안 거품과 거품 형성을 피하기 위해 튜브를 천천히 흔드십시오. 반응은 두 분에서 다섯 분 정도 걸립니다. 최적의 반응 시간을 결정하기 위해 테스트 실행을 수행하는 것이 좋습니다.더 긴 인큐베이션 시간은 비특이적 인 은 증착을 초래할 수 있습니다. 반응을 멈추려면 탈이온수의 세 가지 내지 다섯 가지 변화로 샘플을 빠르게 헹구십시오. 그 다음에는 각각 다섯 분 동안 세 가지 변경 사항이 더 있습니다.오스뮴 테트록사이드에 의한 용해로부터 은 나노입자를 보호하기 위해, 샘플을 암흑 속에서 두 분 동안 0.05% 테트라클로로우르산에서 인큐베이션한다. 탈 이온수로 철저히 씻으십시오. 이 단계에서, 추가적인 콘트라스트가 함유 물질을 함유하는 DNA에 첨가된다.DRAQ5 DNA 염색으로 샘플을 포화시킵니다. 디아미오노벤지딘 용액을 샘플에 첨가하고 일분 동안 인큐베이션한다. 커버 슬립을 유리 바닥 페트리 접시로 옮기고 거꾸로 된 현미경의 무대에 놓습니다.640 나노 미터 적색 빛으로 여러 시야를 조사하십시오. 왼쪽 패널은 DRAQ5의 완전한 사진 표백을 보여줍니다. 오른쪽 패널에서, DAB 침전물을 나타내는 투과광에서 동일한 시야각이 영상화된다.탈이온수로 샘플을 세척하십시오. 다음 단계는 흄 후드 아래에서 수행되어야합니다. 부분적으로 환원된 오스뮴 테트록사이드 용액을 제조하였다.조심하세요. 이 물질은 매우 휘발성이며 독성이 있습니다. 준비된 용액을 샘플 상에 바릅니다.이 단계에서, 환원된 오스뮴 화합물은 디아미오노벤지딘 침착과 반응하여 DNA의 콘트라스트를 증가시킨다. 현지 규정에 따라 오스뮴 함유 용액을 폐기하고 샘플을 다섯 분 동안 세 번 씻으십시오. 샘플은 일련의 증가된 에탄올 농도에서 추가로 탈수되고, 이어서 에탄올 수지 혼합물로 세포의 침윤이 뒤따른다.알코올 수지 믹스를 갓 준비된 순수한 수지로 교체하십시오. 적절한 크기의 임베딩 몰드를 갓 준비된 수지로 채 웁니다. 셀이 수지로 채워진 캐비티 위로 아래로 향하도록 커버슬립을 놓습니다.37도에서 24 시간 동안 수지를 경화하십시오. 그런 다음 적어도 이틀 동안 60도에서. 덮개의 바닥면에서 수지를 제거하십시오.슬래브를 액체 질소에 떨어 뜨린 다음 끓는 물로 옮깁니다. 유리는 분리되어야합니다. 필요한 경우 반복하십시오.조사된 시야는 디아미오노벤지딘 침착 및 DAB 염색으로 인해 명확하게 볼 수 있어야 한다. 쇠톱이나 다른 적절한 도구를 사용하여 슬래브에서 관심 영역을 잘라냅니다. 컷아웃을 울트라마이크로톰 단순 홀더에 넣습니다.최종 블록 트리밍을 위해 울트라 마이크로 톰을 설정하십시오. 면도날을 사용하여 피라미드 모양의 필렛을 준비하십시오. 피라미드 꼭대기에있는 평평한 면적의 크기는 약 400 x 200 미크론이어야합니다.준비된 피라미드를 울트라 마이크로 톰 암에 장착하고 칼을 설치하십시오. 섹션을 준비합니다. 단면 두께는 실험 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다.우리는 EM 단층 촬영을 목표로합니다. 그래서 우리는 250 나노 미터 두께의 섹션을 세미 씬 섹션이라고도합니다. 나이프 가장자리에서 섹션을 분리하여 슬롯 그리드에 장착합니다.우리는 슬롯 그리드를 사용했고, 그들은 한 밀리미터 둘레에 둥글고, 한 밀리미터의 측면 개구부가있었습니다. 작은 개구부 크기는 섹션의 더 나은 안정성을 제공합니다. 샘플을 그리드에서 말리십시오.현재 섹션은 관찰 할 준비가되었습니다. 그리드를 전자 현미경 샘플 홀더에 넣습니다. 샘플을 전자 현미경에 적재하십시오.틸트 시리즈를 획득합니다. 포유류 세포 핵에서의 복제 초점은 S상 진행에 따라 뚜렷한 분포 패턴을 나타낸다. 형광 표지된 아지드와의 클릭 반응에 의해 확인된 성공적인 EdU 라벨링은 글루타르알데히드가 상부에 고정된 후 이종 세포 집단에서 전형적인 복제 패턴을 입증한다.스트렙타비딘 라벨링은 글루타르알데히드에 의해 영향을 받을 수 있다. 그래서 먼저 스트렙타비딘 나노골드와 동일한 조건으로 염색한 스트렙타비딘 형광을 하단에 확인한다. 은 증진 절차의 좋은 결과는 바닥에 표시된 일부 핵과 매우 희미한 노란색 세포 플라스트 염색의 짙은 갈색 염색입니다.사전 임베딩 라벨링의 장점은 단면화를 위해 셀을 선택할 수 있다는 것이다. 이 단계에서는 라벨링 패턴이 밝은 현장 현미경으로 보이기 때문에 가능합니다. 적절한 레이블 지정으로 인해 잘 구분된 복제 사이트가 생성됩니다.화살촉은 DAB 염색된 크로마틴 섬유를 보여준다. 오른쪽의 배경 라벨링은 평방 미크론 당 몇 개의 나노 입자로 제한됩니다. 반박형 섹션은 단층 촬영을 할 준비가되어 있으며 금 나노 입자를 추가 할 필요가 없습니다.기술된 접근법은 복제가 가능한 부위에서 크로마틴 조직의 연구에 사용되었다. 크로마틴 분리의 고해상도 이미징을 포함하는 크로마틴의 복제 후 재배열 분석용. 또한 큰 염색체 도메인의 복제 표지 및 고차 크로마틴 폴딩 및 헤테로 크로마틴의 연구에 사용됩니다.이러한 이미징 기술은 또한 다른 비현미경적 접근법에 의해 생성된 데이터의 기준점으로서 중요하다. 이 방법은 또한 초해상도 기술을 포함하는 상관 관계된 현미경 연구에 수용될 수 있다. 이것은 크로마틴 고차 구조와 세포의 다양한 생리 학적 상태에서의 역학에 대한 연구에서 새로운 지평을 열어줍니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

연구

생물학

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

특정 게놈 지역과 enChIP으로 관련 분자의 식별의 분리

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 직렬 섹션 전자 단층 촬영에 의해 밝혀 초파리 간접 비행 근육의

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 CryoAPEX 방법

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...