Name: imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av RSF (tilskudd #17-15-01290) og RFBR (tilskudd #19-015-00273). Forfatterne takker Lomonosov Moscow State University development program (PNR 5.13) og Nikon Center of Excellence i korrelativ bildebehandling ved Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology for tilgang til bildeinstrumentering.

Protokollen er optimalisert for adherentceller og ble testet på HeLa-, HT1080- og CHO-cellelinjer.
1. Cellemerking og fiksering
<ol><li>Plateceller på syrerengjorte dekslerlips i en 3 cm Petri-tallerken. Utvid cellene i mediet som anbefales for cellelinjen som brukes til 70 % samløp.</li>
	<li>Tilsett EdU (5-ethynyl-2'-deoksyuridin) fra 10 mM lager til 10 μM sluttkonsentrasjon og plasser cellene i inkubatoren i 10 minutter eller lenger (avhengig av eksperimentmålet). Fo...

<ol>
	<li>Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicating+large+genomes:+divide+and+conquer.">Replicating large genomes: divide and conquer.</a> Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).</li><li>M&#233;chali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+DNA+replication+origins:+Many+choices+for+appropriate+answers.">Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers.</a> Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).</li><li>Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+DNA+replication.">Organization of DNA replication.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).</li><li>Su, Q. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+reveals+spatiotemporal+propagation+of+human+replication+foci+mediated+by+CTCF-organized+chromatin+structures.">Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).</li><li>Leonhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+factories+in+living+cells.">Dynamics of DNA replication factories in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).</li><li>Philimonenko, A. A., Hodn&#253;, Z., Jackson, D. A., Hoz&#225;k, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microarchitecture+of+DNA+replication+domains.">The microarchitecture of DNA replication domains.</a> Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).</li><li>Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organizations+of+replicon+domains+during+DNA+synthetic+phase+in+the+mammalian+nucleus.">Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus.</a> Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+DNA+replication+sites+in+mammalian+cells.">Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).</li><li>Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+early+and+late+replicating+DNA+in+human+chromosome+territories.">Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories.</a> Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).</li><li>Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+three-dimensional+replication+patterns+during+the+S-phase,+analysed+by+double+labelling+of+DNA+and+confocal+microscopy.">Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy.</a> Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).</li><li>Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-like+chromatin:+Toward+understanding+the+real+chromatin+organization+present+in+the+cell.">Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell.</a> Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).</li><li>Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+early+chromosome+condensation:+A+hierarchical+folding,+axial+glue+model+of+chromosome+structure.">Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure.</a> Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).</li><li>Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+interphase+large-scale+chromatin+structure+from+analysis+of+engineered+chromosome+regions.">Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions.</a> Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 236 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation.">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li><li>Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChromEMT:+Visualizing+3D+chromatin+structure+and+compaction+in+interphase+and+mitotic+cells.">ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells.</a> Science. 357 (6349), (2017).</li><li>Hoz&#225;k, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+factories+and+nuclear+bodies:+the+ultrastructural+characterization+of+replication+sites+during+the+cell+cycle.">Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle.</a> Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).</li><li>Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+of+DNA+replication+reveals+dynamic+plasticity+of+large-scale+chromatin+fibers.">Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers.</a> Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+electron+microscopic+immunocytochemistry+with+silver-enhanced+1.4-nm+gold+particles+to+localize+GAD+in+the+cerebellar+nuclei.">The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).</li><li>Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+immunogold+labeling+confirms+large-scale+chromatin+folding+motifs.">In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs.</a> Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).</li><li>Sawada, H., Esaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nanogold+followed+by+silver+enhancement+and+gold+toning+for+preembedding+immunolocalization+in+osmium-fixed,+Epon-embedded+tissues.">Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freeze+substitution+fixation-based+gold+enlarging+technique+for+EM+studies+of+endocytosed+Nanogold-labeled+molecules.">A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).</li><li>Weipoltshammer, K., Sch&#233;fer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography.">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).</li></ol>

Metoden som er beskrevet her har flere fordeler i forhold til tidligere publiserte protokoller. For det første eliminerer bruken av Click-kjemi for merking av replikert DNA nødvendigheten av DNA-denatureringsforutsetning for BrdU-deteksjon med antistoffer, og dermed bedre bevare kromatin ultrastruktur. 
For det andre minimerer utnyttelse av biotin som sekundær ligand som genereres etter glutaraldehydfiksering og riktig slukking av ubundne aldehydgrupper kjemisk modifikasjon av målet, og fo...

DNA-replikasjon er en grunnleggende biologisk prosess som kreves for trofast kopiering og overføring av genetisk informasjon under celledeling. Ved høyere eukaryoter blir DNA-replikasjon utsatt for stram romlig-temporal regulering, som manifesteres i sekvensiell aktivering av replikasjonsopprinnelse1. Nærliggende replikeringsopprinnelsesopprinnelse som avfyres synkront, danner klynger av svar2. På nivået av optisk mikroskopi oppdages steder med pågående DNA-replikasjon som replikasjonsfokus av forskjellig antall og størrelse. Replikasjonsfokus viser spesifikke mønstre for romlig fordeling i cellekjernen, avhengig av replikeringstidspunktet for det merkede DNA 3,4, som igjen er tett korrelert med genaktiviteten. Takket være veldefinert sekvens av DNA-replikasjon, strengt bestilt i rom og tid, er replikering en kraftig metode for presis DNA-merking, ikke bare for studiet av replikeringsprosess i seg selv, men også for å diskriminere en bestemt DNA-subfraksjon med definert transkripsjonsaktivitet og komprimeringsnivå. Visualisering av replikering av kromatin utføres vanligvis ved påvisning av store proteinkomponenter i DNA-replikasjonsmaskiner (enten ved immunstaining eller ved uttrykk for fluorescerende proteinkoder 5,6) eller ved inkorporering av modifiserte DNA-synteseforløpere 7,8,9,10 . Av disse er det bare metoder basert på inkorporering av modifiserte nukleotider i nylig replikert DNA som gjør det mulig å fange opp konformasjonsendringer i kromatin under replikering, og spore oppførselen til replikeringsdomener etter at replikeringen er fullført.
I høyere eukaryoter legger DNA-emballasje til kromatin et annet nivå av kompleksitet til regulering av grunnleggende genetiske funksjoner (transkripsjon, replikasjon, oppreisning, etc.). Kromatinfolding påvirker tilgjengeligheten av DNA til regulatoriske transfaktorer og DNA-konformasjonsendringer (dobbel helix-avslapping) som kreves for malsyntesen. Derfor er det generelt akseptert at DNA-avhengige syntetiske prosesser i cellekjernen krever en strukturell overgang av kromatin fra kondensert, undertrykkende tilstand til en mer tilgjengelig, åpen konformasjon. Cytologisk er disse to kromatinstatene definert som heterokromatin og eukromatin. Det er imidlertid fortsatt ingen konsensus om modusen for DNA-folding i kjernen. Hypotesene spenner fra en "polymersmelting" modell11, hvor nukleosomal fiber oppfører seg som en tilfeldig polymer som pakketettheten styres av faseseparasjonsmekanismer, til hierarkiske foldemodeller som postulerer sekvensiell dannelse av kromatinfiberlignende strukturer med økende tykkelse12,13. Hierarkiske foldemodeller fikk nylig støtte fra molekylære tilnærminger basert på analysen av in situ DNA-DNA-kontakter (kromosomkonformasjonsfangst, 3C), som demonstrerer eksistensen av hierarkiet av kromatinstrukturelle domener14. Det er viktig å merke seg at replikeringsenheter korrelerer veldig godt med disse kromatindomenene15. Den største kritikken av disse modellene er basert på potensiell kunstig kromatinaggregering forårsaket av prøveprepareringsprosedyrer, for eksempel permeabilisering av cellemembraner og fjerning av ikke-kromatinkomponenter, for å forbedre kromatinkontrast for ultrastrukturelle studier samtidig som kromatintilgjengeligheten for ulike sonder (f.eks. antistoffer). Nylige tekniske fremskritt innen selektiv DNA-farging for elektronmikroskopi ved DNA-bindende fluoroformediert fotooksidasjon av diaminobenzidin (ChromEMT6) har tillatt eliminering av dette hinderet. De samme hensynene gjelder imidlertid for elektronmikroskopivisualisering av replikering av DNA17,18. Her beskriver vi en teknikk som muliggjør samtidig høyoppløselig ultrastrukturell kartlegging av nylig syntetisert DNA og total kromatin i intakte aldehyd-krysskoblede celler. Teknikken kombinerer deteksjon av EdU-merket DNA av Click-kjemi med biotinylerte sonder og streptavidin-Nanogold, og ChromEMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555-azide</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>A20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>C3730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Boval</td>
			<td>LY-0080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>26544-38-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90-72-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin monomer</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90529-77-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25%, EM Grade)</td>
			<td>TED PELLA, INC</td>
			<td>18426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>258850010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141396.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>213462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>25134-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver lactate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>359750-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>S11223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Nanogold conjugate</td>
			<td>Nanoprobes</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrachloroauric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>HT1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L</td>
			<td>298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka Chemica</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper single slot grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Cy5 HQ</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife Ultra Wet 45o</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DU</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-tilt sample holder</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Multi Bio RS-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer</td>
			<td>Jeol</td>
			<td>JEM-2100</td>
			<td>Alternatives: FEI, Hitachi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UltraCut-E</td>
			<td>Alternatives: RMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography

Prinsipper for DNA-folding i cellekjernen og dens dynamiske transformasjoner som oppstår under oppfyllelsen av grunnleggende genetiske funksjoner (transkripsjon, replikasjon, segregering, etc.) forblir dårlig forstått, delvis på grunn av mangel på eksperimentelle tilnærminger til høyoppløselig visualisering av spesifikk kromatin loci i strukturelt bevarte kjerner. Her presenterer vi en protokoll for visualisering av replikeringsdomener i monolayercellekultur in situ, ved å kombinere EdU-merking av nylig syntetisert DNA med påfølgende etikettdeteksjon med Ag-forsterkning av Nanogold-partikler og ChromEM-farging av kromatin. Denne protokollen muliggjør høykontrast, høyeffektiv forhåndsinnbyggingsmerking, kompatibel med tradisjonell glutaraldehydfiksering som gir den beste strukturelle bevaringen av kromatin for prøvebehandling ved romtemperatur. En annen fordel med forhåndsinnbygging av merking er muligheten til å forhåndsbestille celler av interesse for inndeling. Dette er spesielt viktig for analysen av heterogene cellepopulasjoner, samt kompatibilitet med elektrontomografi tilnærminger til høyoppløselig 3D-analyse av kromatinorganisasjon på replikeringssteder, og analyse av postreplikativ kromatin omorganisering og søsterkromotid segregering i interfasen.

Replikasjonsfokus i pattedyrcellekjerner viser tydelige distribusjonsmønstre i kjernen avhengig av S-faseprogresjon. Disse mønstrene korrelerer med transkripsjonsaktiviteten til loci som blir replikert. Siden metoden som presenteres her bruker en ganske sterkfixasjonsprosedyre, er det ganske greit å bruke replikerende pulsmerking for spesifikk deteksjon av kromatin loci i ulike transkripsjonstilstander, selv under forhold som tilbyr best strukturell bevaring av kromatin oppnådd ved romtemperatur kjemisk fiksering.</p...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography at JoVE.com

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Denne protokollen presenterer en teknikk for høyoppløselig kartlegging av replikeringssteder i strukturelt bevart kromatin in situ som bruker en kombinasjon av pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold merking og ChromEMT.

Bildereplikatoriske domener i ultrastrukturelt bevart kromatin av elektrontomografi

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Vi presenterer en protokoll for elektronmikroskopisk visualisering av de replikerende domenene i cellen ved EdU-merking av det nylig syntetiserte DNA- og etikettdeteksjonen med sølvforbedring av nanogoldpartikler og ChromEM-farging av kromatinet. Denne protokollen gir forhåndsinnbyggingsmerking med høy kontrast med tradisjonell glutaraldehydfiksering som gir den beste strukturelle bevaringen av kromatin for romtemperaturprøvebehandling. Denne protokollen er optimalisert for tilslutningscellen som vokser på dekslene i Petri-parabolen.Tilsett EdU til 10 mikromols sluttkonsentrasjon og plasser cellene i inkubatoren for ønsket merketid. Fest de merkede cellene med 2,5% gluaradehydrat i en 100 millimoles natriumkakroktylatoppløsning i en time. Lengre fikseringstid kan påvirke EdU-merkingen negativt.Fjern glutaraldehyd ved å skylle prøvene med PBS supplert med fem millimol magnesiumklorid, videre ansett som PBS-stjerne. Vask tre ganger i 10 minutter. Permeabiliser plasmamembraner med 1% løsning av Trione X-100 i PBS-stjerne, gjør to endringer i fem minutter hver.Denne løsningen er videre referert til som PBS stjerne T.Omfattende vaske prøven med PBS stjerne. Fem endringer i fem minutter hver. Slukk de resterende aldehydgruppene med 20 millimol glycin i PBS-stjerne, to ganger i 10 minutter.Plasser prøven i PBS-stjerne med 1 %BSA i en halv time. Mens du blokkerer i BSA, klargjør reaksjonscocktailen for EdU-deteksjon. Rekkefølgen på komponenttillegg er viktig.EdU biotin-azide konjugering utføres i det fuktige kammeret for å minimere fordampning og konsentrasjonsskift i reaksjonscocktailen. Forbered det fuktige kammeret. Legg dekslene på parafilmen med en celle vendt opp og lag 50 til 100 mikroliter av reaksjonscocktailen på dekslene.Reaksjonen tar 30 minutter ved romtemperatur. Stopp reaksjonen ved å vaske prøven i PBS stjerne T, fem ganger i fem minutter hver. Blokker på nytt med 1%BSA i PBS-stjerne T i ytterligere en halv time.Forbered streptavidin-Nanogold-løsning i PBS-stjerne T med 1%BSA. Inkuber prøven med streptavidin over natten ved pluss fire grader i et nyoppberedt fuktig kammer. Prosedyren er den samme som med EdU biotin-azide konjugering.Stopp reaksjonen og vask prøven, fem ganger i 10 minutter hver med PBS-stjerne T.Stabilize biotin streptavidin kompleks ved ytterligere fiksering vil 1% glutaraldehyd PBS stjerne i en halv time. Fjern glutaraldehyd ved intens vask med deionisert vann. Slukke gjenværende aldehydgrupper med ett milligram per milliliter natriumborohydrid.Vask grundig igjen. Neste trinn er å øke størrelsen på Nanogold partikler ved hjelp av sølvavsetning på den gylne banen. Forbered forblandinger for å minimere mørkeromsaktivitet.Likevekt prøvene med vaskebuffer og fortsett til et mørkerom. I mørkerommet blander du komponentene for å forberede vaskeløsningen og bruke den på prøvene. Akacia pulveroppløsning er svært visikler.Så under blanding av komponentene, rock røret sakte for å unngå boble- og skumdannelse. Reaksjonen tar fra to til fem minutter. Vi anbefaler å utføre en testkjøring for å bestemme den optimale reaksjonstiden.Lengre inkubasjonstid kan resultere i en uspesifisert sølvavsetning. For å stoppe reaksjonen, skyll prøven raskt med tre til fem endringer i det avioniserte vannet. Etterfulgt av tre endringer til i fem minutter hver.For å beskytte sølv nanopartikler fra oppløsning av osmium tetroxide, inkubere prøvene i 0,05% tetrakloraurinsyre i to minutter i mørket. Vask grundig med deionisert vann. På dette stadiet legges ytterligere kontrast til DNA-et som inneholder materiale.Mette prøven med DRAQ5 DNA-flekk. Tilsett diamionobenzidinoppløsning i prøven og inkuber i ett minutt. Flytt dekslene inn i glassbunnen Petri-tallerkenen, og legg den på scenen til det omvendte mikroskopet.Bestråle flere synsfelt med 640 nanometer rødt lys. Venstre panel viser fullstendig fotobleking av DRAQ5. På høyre panel er det samme synsfeltet avbildet i det overførte lyset som viser DAB-utfelling.Vask prøver med deionisert vann. Neste trinn skal utføres under avtrekkshetten. Fremstilt delvis redusert osmium tetroksidoppløsning.Vær forsiktig. Dette stoffet er svært flyktig og giftig. Påfør den forberedte løsningen på prøven.På dette stadiet reagerer de reduserte osmiumforbindelsene med diamionobenzidinavsetninger og øker kontrasten til DNA. Kast osmiumholdig oppløsning i henhold til lokal regulering og vask prøver tre ganger i fem minutter hver. Prøven er ytterligere dehydrert i en rekke økende etanolkonsentrasjoner etterfulgt av infiltrasjon av cellene med etanolharpiksblandinger.Bytt ut alkoholharpiksblanding med nylaget ren harpiks. Fyll den riktig store innbyggingsformen med en nylaget harpiks. Plasser dekslene med en celle som vender ned over det harpiksfylte hulrommet.Kurere harpiksen i 24 timer ved 37 grader. Deretter ved 60 grader i minst to dager. Fjern harpiks fra en bunnoverflate av et deksler.Slipp platen i et flytende nitrogen og overfør deretter til kokende vann. Glasset skal løsne. Gjenta om nødvendig.Bestrålede synsfelt bør være tydelig synlige på grunn av diamionobenzidinavsetningen og DAB-fargingen. Klipp ut interesseområdet fra platen ved hjelp av hacksaw eller et annet egnet instrument. Plasser utsnittet i den ultramikrotom enkle holderen.Sett opp ultramikrotomet for endelig blokktrimming. Bruk barberbladet til å forberede den pyramideformede pilletten. Størrelsen på et flatt område på toppen av pyramiden skal være ca 400 x 200 mikron.Monter den forberedte pyramiden i ultramikrotomarmen og installer kniven. Forbered delene. Seksjonstykkelsen kan justeres for å passe til de eksperimentelle kravene.Vi sikter mot EM-tomografi. Så vi forberedte seksjoner med en tykkelse på 250 nanometer også referert til som halvtynne seksjoner. Løsne seksjonene fra knivens kant og monter dem på et sporgitter.Vi brukte et sporgitter, de var runde en millimeter å være rundt, en millimeter sideåpning. Den lille åpningsstørrelsen gir bedre stabilitet i seksjonene. La prøvene tørke på rutenettet.For øyeblikket er seksjonene klare til observasjon. Plasser gitteret i elektronmikroskopets prøveholder. Legg prøven i elektronmikroskopet.Skaff deg vippeserier. Replikasjonsfokus i pattedyrcellekjerner viser distinkte distribusjonsmønstre avhengig av S-faseprogresjonen. Vellykket EdU-merking bekreftet av klikkreaksjonen med fluorescerende merket azide demonstrerer typisk replikasjonsmønster i den heterogene cellepopulasjonen etter glutaraldehydfiksering på toppen.Streptavidin merking kan påvirkes av glutaraldehyd. Så kontroller først fluorescens streptavidin farging under samme tilstand som streptavidin nanogold på bunnen. Godt resultat av sølv forbedringer prosedyren er en mørk brun farging av noen kjerner og svært besvimt gul cytoplast flekk, vist på bunnen.Fordelen med en forhåndsinnbyggingsmerking er muligheten til å merke celler for inndelingen. Det er mulig på dette stadiet fordi merkingsmønstrene blir synlige under et lyst feltmikroskop. Riktig merking resulterer i de godt avgrensede replikeringsområdene.Pilspiss viser DAB-fargede kromatinfibre. Bakgrunnsmerkingen til høyre er begrenset til noen få nanopartikler per kvadratmikron. Semi-tynne seksjoner er klare for tomografi og krever ikke tilsetning av gull nanopartikler.Den beskrevne tilnærmingen som brukes til studier av kromatinorganisasjon på steder med aktivert replikering. For analyse av postreplikativ omorganisering av kromatin inkludert høyoppløselig avbildning av kromatin segregering. Den brukes også til replikert merking av store kromosomale domener og studier av høyere orden kromatin folding og heterochromatin.Denne bildeteknikken er også viktig som referansepunkt for dataene som genereres av andre ikke-mikroskopiske tilnærminger. Metoden kan også innkvarteres i korrelerte mikroskopiske studier, inkludert superoppløsningsteknikker. Dette åpner nye horisonter i studier av kromatin høyere ordensstruktur og dens dynamikk i cellens ulike fysiologiske tilstander.

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Purification (kvitre)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Visualisering av ATP synthase dimer i Mitokondrier av Electron Cryo-tomografi

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Isolering av Spesifikke Genomiske Regioner og Identifisering av Associated Molekyler av enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Utarbeidelse og Observasjon av Thick biologiske prøver av Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Eksempel forberedelse og bildebehandling for Exosomes av overføring elektronmikroskop

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D mitokondrie Ultrastructure av Drosophila indirekte Flight muskel avslørt av seriell-delen Electron tomografi

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisering av DNA komprimering i Cyanobakterie av høyspent Cryo-elektron tomografi

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiske utvalg forberedelse av høytrykks fryser, mikrobølgeovn-assistert kontrast ekstrautstyr og Minimal harpiks innebygging volum Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

CryoAPEX-metoden for elektronmikroskopianalyse av membranproteinlokalisering innenfor ultrastrukturelt bevarte celler

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...