Name: imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography at JoVE.com

Эта работа была поддержана частично РНФ (грант No17-15-01290) и РФФИ (грант No19-015-00273). Авторы благодарят программу развития МГУ им. М.В. Ломоносова (ПНР 5.13) и Центр передового опыта «Никон» по корреляционной визуализации при Белозерском институте физико-химической биологии за доступ к приборам визуализации.

Протокол оптимизирован для адгезивных клеток и был протестирован на клеточных линиях HeLa, HT1080 и CHO.
1. Маркировка и фиксация клеток
<ol><li>Пластинчатые ячейки на очищенных кислотой крышках в чашке Петри 3 см. Вырастите клетки в среде, рекомендуемой для используемой ?...

<ol>
	<li>Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicating+large+genomes:+divide+and+conquer.">Replicating large genomes: divide and conquer.</a> Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).</li><li>M&#233;chali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+DNA+replication+origins:+Many+choices+for+appropriate+answers.">Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers.</a> Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).</li><li>Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+DNA+replication.">Organization of DNA replication.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).</li><li>Su, Q. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+reveals+spatiotemporal+propagation+of+human+replication+foci+mediated+by+CTCF-organized+chromatin+structures.">Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).</li><li>Leonhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+factories+in+living+cells.">Dynamics of DNA replication factories in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).</li><li>Philimonenko, A. A., Hodn&#253;, Z., Jackson, D. A., Hoz&#225;k, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microarchitecture+of+DNA+replication+domains.">The microarchitecture of DNA replication domains.</a> Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).</li><li>Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organizations+of+replicon+domains+during+DNA+synthetic+phase+in+the+mammalian+nucleus.">Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus.</a> Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+DNA+replication+sites+in+mammalian+cells.">Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).</li><li>Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+early+and+late+replicating+DNA+in+human+chromosome+territories.">Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories.</a> Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).</li><li>Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+three-dimensional+replication+patterns+during+the+S-phase,+analysed+by+double+labelling+of+DNA+and+confocal+microscopy.">Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy.</a> Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).</li><li>Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-like+chromatin:+Toward+understanding+the+real+chromatin+organization+present+in+the+cell.">Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell.</a> Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).</li><li>Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+early+chromosome+condensation:+A+hierarchical+folding,+axial+glue+model+of+chromosome+structure.">Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure.</a> Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).</li><li>Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+interphase+large-scale+chromatin+structure+from+analysis+of+engineered+chromosome+regions.">Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions.</a> Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 236 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation.">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li><li>Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChromEMT:+Visualizing+3D+chromatin+structure+and+compaction+in+interphase+and+mitotic+cells.">ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells.</a> Science. 357 (6349), (2017).</li><li>Hoz&#225;k, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+factories+and+nuclear+bodies:+the+ultrastructural+characterization+of+replication+sites+during+the+cell+cycle.">Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle.</a> Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).</li><li>Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+of+DNA+replication+reveals+dynamic+plasticity+of+large-scale+chromatin+fibers.">Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers.</a> Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+electron+microscopic+immunocytochemistry+with+silver-enhanced+1.4-nm+gold+particles+to+localize+GAD+in+the+cerebellar+nuclei.">The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).</li><li>Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+immunogold+labeling+confirms+large-scale+chromatin+folding+motifs.">In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs.</a> Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).</li><li>Sawada, H., Esaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nanogold+followed+by+silver+enhancement+and+gold+toning+for+preembedding+immunolocalization+in+osmium-fixed,+Epon-embedded+tissues.">Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freeze+substitution+fixation-based+gold+enlarging+technique+for+EM+studies+of+endocytosed+Nanogold-labeled+molecules.">A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).</li><li>Weipoltshammer, K., Sch&#233;fer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography.">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).</li></ol>

Метод, описанный здесь, имеет ряд преимуществ перед ранее опубликованными протоколами. Во-первых, использование Click-химии для маркировки реплицированной ДНК устраняет необходимость в предпосылке денатурации ДНК для обнаружения BrdU антителами, тем самым лучше сохраняя ультраструктуру ...

Репликация ДНК является основным биологическим процессом, необходимым для точного копирования и передачи генетической информации во время деления клеток. У высших эукариот репликация ДНК подвергается жесткой пространственно-временной регуляции, которая проявляется в последовательной активации истоков репликации1. Соседние источники репликации, запускающие синхронно, образуют кластеры репликонов2. На уровне оптической микроскопии участки продолжающейся репликации ДНК обнаруживаются как очаги репликации различного количества и размера. Репликационные очаги демонстрируют специфические закономерности пространственного распределения внутри ядра клетки в зависимости от сроков репликации меченой ДНК 3,4, что, в свою очередь, тесно коррелирует с ее генной активностью. Благодаря четко определенной последовательности репликации ДНК, строго упорядоченной в пространстве и времени, репликативная маркировка является мощным методом точной маркировки ДНК не только для изучения процесса репликации как такового, но и для различения конкретной субфракции ДНК с определенной транскрипционной активностью и уровнем уплотнения. Визуализация реплицирующегося хроматина обычно выполняется путем обнаружения основных белковых компонентов механизма репликации ДНК (либо путем иммуноокрашивания, либо путем экспрессии флуоресцентных белковых меток 5,6) или путем включения модифицированных предшественников синтеза ДНК 7,8,9,10 . Из них только методы, основанные на включении модифицированных нуклеотидов во вновь реплицированную ДНК, позволяют улавливать конформационные изменения хроматина во время репликации и отслеживать поведение репликативных доменов после завершения их репликации.
У высших эукариот упаковка ДНК в хроматин добавляет еще один уровень сложности к регуляции основных генетических функций (транскрипция, репликация, репарация и т. Д.). Складчатость хроматина влияет на доступность ДНК к регуляторным транс-факторам и конформационным изменениям ДНК (размотка двойной спирали), необходимым для синтеза шаблона. Поэтому принято считать, что ДНК-зависимые синтетические процессы в ядре клетки требуют структурного перехода хроматина из его конденсированного, репрессивного состояния в более доступную, открытую конформацию. Цитологически эти два состояния хроматина определяются как гетерохроматин и эухроматин. Тем не менее, до сих пор нет единого мнения относительно способа складывания ДНК в ядре. Гипотезы варьируются от модели11 «полимерного расплава», где нуклеосомное волокно ведет себя как случайный полимер, для которого плотность упаковки контролируется механизмами разделения фаз, до иерархических моделей складывания, постулирующих последовательное формирование хроматиновых волокнистых структур увеличивающейся толщины12,13. Иерархические модели складывания недавно получили поддержку молекулярных подходов, основанных на анализе контактов ДНК-ДНК in situ (захват конформации хромосом, 3C), демонстрируя существование иерархии структурных доменов хроматина14. Важно отметить, что единицы репликации очень хорошо коррелируют с этими хроматиновыми доменами15. Основная критика этих моделей основана на потенциальной искусственной агрегации хроматина, вызванной процедурами пробоподготовки, такими как пермеабилизация клеточных мембран и удаление нехроматиновых компонентов, чтобы улучшить контраст хроматина для ультраструктурных исследований при одновременном улучшении доступности хроматина для различных зондов (например, антител). Последние технические достижения в области селективного окрашивания ДНК для электронной микроскопии путем ДНК-связывающего флуорофоро-опосредованного фотоокисления диаминобензидина (ChromEMT6) позволили устранить это препятствие. Тем не менее, те же соображения справедливы для электронной микроскопии визуализации реплицирующей днк17,18. Здесь мы описываем технику, которая позволяет одновременно проводить ультраструктурное картирование с высоким разрешением вновь синтезированной ДНК и общего хроматина в интактных альдегидно-сшитых клетках. Метод сочетает в себе обнаружение меченой EdU ДНК с помощью Click-химии с биотинилированными зондами и стрептавидином-нанозолотом, а также ChromEMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555-azide</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>A20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>C3730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Boval</td>
			<td>LY-0080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>26544-38-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90-72-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin monomer</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90529-77-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25%, EM Grade)</td>
			<td>TED PELLA, INC</td>
			<td>18426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>258850010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141396.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>213462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>25134-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver lactate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>359750-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>S11223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Nanogold conjugate</td>
			<td>Nanoprobes</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrachloroauric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>HT1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L</td>
			<td>298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka Chemica</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper single slot grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Cy5 HQ</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife Ultra Wet 45o</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DU</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-tilt sample holder</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Multi Bio RS-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer</td>
			<td>Jeol</td>
			<td>JEM-2100</td>
			<td>Alternatives: FEI, Hitachi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UltraCut-E</td>
			<td>Alternatives: RMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography

Принципы сворачивания ДНК в ядре клетки и ее динамических превращений, происходящих при выполнении основных генетических функций (транскрипция, репликация, сегрегация и др.), остаются малоизученными, отчасти из-за отсутствия экспериментальных подходов к визуализации высокого разрешения специфических локусов хроматина в структурно сохранившихся ядрах. Здесь представлен протокол визуализации репликативных доменов в монослойной клеточной культуре in situ, путем объединения маркировки EdU вновь синтезированной ДНК с последующим обнаружением меток с Ag-амплификацией частиц Nanogold и окрашиванием ChromEM хроматина. Этот протокол обеспечивает высококонтрастную, высокоэффективную маркировку предварительного встраивания, совместимую с традиционной фиксацией глутаральдегида, которая обеспечивает наилучшую структурную сохранность хроматина для обработки образцов при комнатной температуре. Еще одним преимуществом маркировки предварительного встраивания является возможность предварительного выбора интересующих клеток для секционирования. Это особенно важно для анализа гетерогенных клеточных популяций, а также совместимости с электронно-томографическими подходами к 3D-анализу организации хроматина высокого разрешения в местах репликации и анализу пострепликативной перестройки хроматина и сестринского хроматидного разделения в интерфазе.

Очаги репликации в ядрах клеток млекопитающих демонстрируют отчетливые закономерности распределения внутри ядра в зависимости от прогрессирования S-фазы. Эти паттерны коррелируют с транскрипционной активностью реплицируемых локусов. Поскольку метод, представленный здесь, использу?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography at JoVE.com

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Этот протокол представляет собой метод картирования участков репликации с высоким разрешением в структурно сохраненном хроматине in situ , который использует комбинацию предварительного встраивания маркировки EdU-стрептавидин-Nanogold и ChromEMT.

Визуализация репликативных доменов в ультраструктурно сохраненном хроматине с помощью электронной томографии

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Представлен протокол электронно-микроскопической визуализации репликативных доменов в клетке путем маркировки EdU вновь синтезированной ДНК и обнаружения меток с серебристым усилением частиц Nanogold и окрашиванием хроматина ChromEM. Этот протокол обеспечивает высококонтрастную маркировку предварительного встраивания с традиционной фиксацией глутаральдегида, которая обеспечивает наилучшую структурную сохранность хроматина для обработки образцов комнатной температуры. Этот протокол оптимизирован для клетки адгезии, растущей на покровах в чашке Петри.Добавьте EdU до конечной концентрации 10 микромолей и поместите клетки в инкубатор на желаемое время маркировки. Зафиксируйте меченые клетки 2,5%-ным глуарадегидратом в 100-миллиметровом растворе какодилата натрия в течение одного часа. Более длительное время фиксации может негативно повлиять на маркировку EdU.Удалите глутаровый альдегид, промыв образцы PBS, дополненным пятью миллимолями хлорида магния, который также считается звездой PBS. Вымойте три раза в течение 10 минут. Пермеабилизируйте плазматические мембраны 1% раствором Trione X-100 в звезде PBS, внесите два изменения в течение пяти минут каждое.Это решение далее называют звездой PBS T.Широко промывайте образец звездой PBS. Пять изменений за пять минут каждое. Гасите остаточные альдегидные группы 20 миллимолями глицина в звезде PBS два раза в течение 10 минут.Поместите образец в звезду PBS с 1% BSA на полчаса. Во время блокировки в BSA приготовьте реакционный коктейль для обнаружения EdU. Важен порядок добавления компонентов.Конъюгация биотин-азида EdU выполняется во влажной камере для минимизации испарения и сдвигов концентрации в реакционном коктейле. Подготовьте влажную камеру. Поместите крышку на парапленку с ячейками, обращенными вверх, и наложите от 50 до 100 микролитров реакционного коктейля на крышку.Реакция занимает 30 минут при комнатной температуре. Остановите реакцию, промыв образец в звезде PBS T, пять раз в течение пяти минут каждый. Снова блокируйте с 1% BSA в PBS star T еще на полчаса.Готовят раствор стрептавидина-нанозолоты в PBS star T с 1% BSA. Инкубируйте образец стрептавидином в течение ночи при плюс четырех градусах во вновь подготовленной влажной камере. Процедура такая же, как и при конъюгации биотин-азида EdU.Остановить реакцию и промыть образец, пять раз по 10 минут каждый со звездой PBS T. Стабилизировать комплекс стрептавидина биотина путем дополнительной фиксации будет 1%глутаральдегида PBS звезды в течение получаса. Удалите глутаровый альдегид путем интенсивного промывания деионизированной водой. Закалка остаточных альдегидных групп одним миллиграммом на миллилитр боргидрида натрия.Снова тщательно вымойте. Следующим шагом является увеличение размера частиц Nanogold путем осаждения серебра на золотом курсе. Подготовьте премиксы, чтобы свести к минимуму активность в темной комнате.Уравновесьте образцы с помощью промывочного буфера и перейдите в темную комнату. В темной комнате смешайте компоненты для приготовления моющего раствора и нанесите его на образцы. Раствор порошка акации имеет высокую вязкость.Поэтому во время смешивания компонентов медленно раскачивайте трубку, чтобы избежать образования пузырьков и пены. Реакция занимает от двух до пяти минут. Мы рекомендуем выполнить тестовый запуск, чтобы определить оптимальное время реакции.Более длительное время инкубации может привести к неспецифическому осаждению серебра. Чтобы остановить реакцию, быстро промойте образец с тремя-пятью изменениями деионизированной воды. Затем последовали еще три изменения по пять минут каждое.Чтобы защитить наночастицы серебра от растворения тетроксидом осмия, инкубируйте образцы в 0,05% тетрахлорауровой кислоты в течение двух минут в темноте. Тщательно промойте деионизированной водой. На этом этапе к МАТЕРИАЛУ, содержащему ДНК, добавляется дополнительный контраст.Насытите образец пятном ДНК DRAQ5. Добавьте к образцу раствор диамионобензидина и инкубируйте в течение одной минуты. Переместите крышку в стеклянную нижнюю чашку Петри, и поместите ее на сцену перевернутого микроскопа.Облучите несколько полей зрения 640-нанометровым красным светом. Левая панель показывает полную фотографию отбеливания DRAQ5. На правой панели то же поле зрения изображено в проходящем свете, показывающем осадок DAB.Промывайте образцы деионизированной водой. Следующий этап следует выполнять под вытяжным капотом. Готовят частично восстановленный раствор тетроксида осмия.Будь осторожен. Это вещество является высоколетучим и токсичным. Нанесите приготовленный раствор на образец.На этой стадии восстановленные соединения осмия реагируют с отложениями диамионобензидина и повышают контраст ДНК. Утилизируйте раствор, содержащий осмий, в соответствии с местными правилами и промывайте образцы три раза в течение пяти минут каждый. Образец дополнительно обезвоживается в серии увеличивающихся концентраций этанола с последующей инфильтрацией клеток смесями этаноловой смолы.Замените смесь спиртовой смолы свежеприготовленной чистой смолой. Наполните форму для встраивания подходящего размера свежеприготовленной смолой. Поместите крышку с ячейками, обращенными вниз над заполненной смолой полостью.Отверждайте смолу в течение 24 часов при 37 градусах. Затем при 60 градусах не менее двух дней. Удалите смолу с нижней поверхности крышки.Опустите плиту в жидкий азот, а затем переложите в кипящую воду. Стекло должно отсоединиться. При необходимости повторите.Облученные поля зрения должны быть хорошо видны благодаря осаждению диамионобензидина и окрашиванию DAB. Вырежьте интересующую область из плиты с помощью ножовки или любого другого подходящего инструмента. Поместите вырез в ультрамикротомный простой держатель.Настройте ультрамикротом для окончательной обрезки блоков. Используя лезвие бритвы, приготовьте пиллет в форме пирамиды. Размер плоской площади на вершине пирамиды должен составлять около 400 на 200 мкм.Установите подготовленную пирамиду в ультрамикротомную руку и установите нож. Подготовьте разделы. Толщина секции может быть отрегулирована в соответствии с экспериментальными требованиями.Мы стремимся к ЭМ-томографии. Поэтому мы подготовили секции толщиной 250 нанометров, также называемые полутонкими секциями. Отсоедините секции от края ножа и установите их на щелевую сетку.Мы использовали щелевую сетку, они были круглыми на один миллиметр, чтобы быть вокруг, один миллиметр боковым отверстием. Небольшой размер отверстия обеспечивает лучшую устойчивость секций. Дайте образцам высохнуть на сетке.На данный момент участки готовы к наблюдению. Поместите сетку в держатель образца электронного микроскопа. Загрузите образец в электронный микроскоп.Приобретайте наклонные серии. Очаги репликации в ядрах клеток млекопитающих демонстрируют отчетливые закономерности распределения в зависимости от прогрессирования S-фазы. Успешная маркировка EdU, подтвержденная реакцией щелчка с флуоресцентно меченым азидом, демонстрирует типичную картину репликации в гетерогенной клеточной популяции после фиксации глутаральдегида сверху.На маркировку стрептавидина может влиять глутаровый альдегид. Поэтому сначала проверьте флуоресцентное окрашивание стрептавидином в том же состоянии, что и нанозолото стрептавидина на дне. Хорошим результатом процедуры увеличения серебра является темно-коричневое окрашивание некоторых ядер и очень слабое желтое пятно цитопласта, показанное на дне.Преимуществом предвстраиваемой маркировки является возможность выбора ячеек для секционирования. Это возможно на этом этапе, потому что паттерны маркировки становятся видимыми под ярким полевым микроскопом. Соответствующая маркировка приводит к хорошо разграниченным участкам репликации.Наконечник стрелы показывает окрашенные DAB волокна хроматина. Фоновая маркировка справа ограничена несколькими наночастицами на квадратный микрон. Полутонкие срезы готовы к томографии и не требуют добавления наночастиц золота.Описанный подход используется для исследований организации хроматина на участках с включенной репликацией. Для анализа пострепликативной перестройки хроматина, включая визуализацию сегрегации хроматина с высоким разрешением. Он также используется для реплицированной маркировки крупных хромосомных доменов и исследований складчатости хроматина высшего порядка и гетерохроматина.Этот метод визуализации также важен в качестве ориентира для данных, генерируемых другими немикроскопическими подходами. Метод также может быть включен в коррелированные микроскопические исследования, включая методы сверхвысокого разрешения. Это открывает новые горизонты в исследованиях структуры хроматина высшего порядка и его динамики в различных физиологических состояниях клетки.

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Хроматина Изоляция очистки РНК (чирпа)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Визуализация АТФ-синтазы димеров в митохондриях с помощью электронной Cryo-томографии

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Выделение конкретных областей генома и идентификации Associated молекул enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Подготовка и наблюдение Толстые биологических образцов с помощью сканирующего трансмиссионной электронной томографии

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Подготовка образцов и изображений Exosomes, просвечивающей электронной микроскопии

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D митохондриальной Ультраструктура дрозофилы косвенные полет мышцы показали серийный Секция электрон томография

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Визуализация ДНК уплотнения в цианобактерий, томография высокого напряжения крио электрон

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Подготовка биологический образец высокого давления замораживания, при содействии Микроволновая печь контрастности и минимальным смолы, встраивание образов тома

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Метод CryoAPEX для анализа электронной микроскопии мембранного белка в ультраструктурно-заповедных клетках

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...