Name: imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av RSF (bidrag #17-15-01290) och RFBR (bidrag #19-015-00273). Författarna tackar Lomonosov Moscow State University utvecklingsprogram (PNR 5.13) och Nikon Center of Excellence i korrelativ avbildning vid Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology för tillgång till bildinstrumentering.

Protokollet är optimerat för vidhäftande celler och testades på HeLa-, HT1080- och CHO-cellinjer.
1. Cellmärkning och fixering
<ol><li>Tallriksceller på syrarenade täckglas i en 3 cm petriskål. Odla cellerna i mediet som rekommenderas för cellinjen som används till 70% sammanflöde.</li>
	<li>Tillsätt EdU (5-etynyl-2'-deoxiuridin) från 10 mM-beståndet till 10 μM slutlig koncentration och placera cellerna i inkubatorn i 10 minuter eller längre (beroende på exp...

<ol>
	<li>Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicating+large+genomes:+divide+and+conquer.">Replicating large genomes: divide and conquer.</a> Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).</li><li>M&#233;chali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+DNA+replication+origins:+Many+choices+for+appropriate+answers.">Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers.</a> Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).</li><li>Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+DNA+replication.">Organization of DNA replication.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).</li><li>Su, Q. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+reveals+spatiotemporal+propagation+of+human+replication+foci+mediated+by+CTCF-organized+chromatin+structures.">Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).</li><li>Leonhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+factories+in+living+cells.">Dynamics of DNA replication factories in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).</li><li>Philimonenko, A. A., Hodn&#253;, Z., Jackson, D. A., Hoz&#225;k, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microarchitecture+of+DNA+replication+domains.">The microarchitecture of DNA replication domains.</a> Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).</li><li>Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organizations+of+replicon+domains+during+DNA+synthetic+phase+in+the+mammalian+nucleus.">Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus.</a> Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+DNA+replication+sites+in+mammalian+cells.">Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).</li><li>Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+early+and+late+replicating+DNA+in+human+chromosome+territories.">Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories.</a> Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).</li><li>Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+three-dimensional+replication+patterns+during+the+S-phase,+analysed+by+double+labelling+of+DNA+and+confocal+microscopy.">Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy.</a> Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).</li><li>Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-like+chromatin:+Toward+understanding+the+real+chromatin+organization+present+in+the+cell.">Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell.</a> Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).</li><li>Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+early+chromosome+condensation:+A+hierarchical+folding,+axial+glue+model+of+chromosome+structure.">Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure.</a> Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).</li><li>Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+interphase+large-scale+chromatin+structure+from+analysis+of+engineered+chromosome+regions.">Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions.</a> Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 236 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation.">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li><li>Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChromEMT:+Visualizing+3D+chromatin+structure+and+compaction+in+interphase+and+mitotic+cells.">ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells.</a> Science. 357 (6349), (2017).</li><li>Hoz&#225;k, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+factories+and+nuclear+bodies:+the+ultrastructural+characterization+of+replication+sites+during+the+cell+cycle.">Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle.</a> Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).</li><li>Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+of+DNA+replication+reveals+dynamic+plasticity+of+large-scale+chromatin+fibers.">Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers.</a> Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+electron+microscopic+immunocytochemistry+with+silver-enhanced+1.4-nm+gold+particles+to+localize+GAD+in+the+cerebellar+nuclei.">The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).</li><li>Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+immunogold+labeling+confirms+large-scale+chromatin+folding+motifs.">In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs.</a> Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).</li><li>Sawada, H., Esaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nanogold+followed+by+silver+enhancement+and+gold+toning+for+preembedding+immunolocalization+in+osmium-fixed,+Epon-embedded+tissues.">Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freeze+substitution+fixation-based+gold+enlarging+technique+for+EM+studies+of+endocytosed+Nanogold-labeled+molecules.">A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).</li><li>Weipoltshammer, K., Sch&#233;fer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography.">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).</li></ol>

Metoden som beskrivs här har flera fördelar jämfört med tidigare publicerade protokoll. För det första eliminerar användningen av klickkemi för märkning av replikerat DNA nödvändigheten av DNA-denatureringsförutsättningsförutsättning för BrdU-detektion med antikroppar, vilket bättre bevarar kromatin ultrastruktur. 
För det andra minimerar användningen av biotin som en sekundär ligand som genereras efter glutaraldehydfixering och korrekt släckning av obundna aldehydgrupper ...

DNA-replikation är en grundläggande biologisk process som krävs för trogen kopiering och överföring av den genetiska informationen under celldelning. I högre eukaryoter utsätts DNA-replikation för tät spatio-temporal reglering, vilket manifesteras i sekventiell aktivering av replikationens ursprung1. Angränsande replikeringsursprung som avfyras synkront bildar kluster av replikationskoner2. På nivån av optisk mikroskopi detekteras platser för pågående DNA-replikation som replikationsfoci av olika antal och storlek. Replikationsfoci visar specifika mönster för rumslig fördelning inom cellkärnan beroende på replikationstiden för det märkta DNA 3,4, vilket i sin tur är tätt korrelerat med dess genaktivitet. Tack vare väldefinierad sekvens av DNA-replikation, strikt ordnad i rum och tid, är replikativ märkning en kraftfull metod för exakt DNA-märkning, inte bara för studier av replikationsprocessen i sig, utan också för att diskriminera en specifik DNA-subfraktion med definierad transkriptionsaktivitet och komprimeringsnivå. Visualisering av replikerande kromatin utförs vanligtvis genom detektion av huvudproteinkomponenter i DNA-replikationsmaskiner (antingen genom immunfärgning eller genom uttryck av fluorescerande proteintaggar 5,6) eller genom införlivande av modifierade DNA-syntesprekursorer 7,8,9,10 . Av dessa möjliggör endast metoder baserade på införlivandet av modifierade nukleotider i nyligen replikerat DNA att fånga konformationsförändringar i kromatin under replikation och spåra beteendet hos replikativa domäner efter att deras replikation är klar.
I högre eukaryoter lägger DNA-förpackning i kromatin till en annan nivå av komplexitet till regleringen av grundläggande genetiska funktioner (transkription, replikation, reparation etc.). Kromatinveckning påverkar DNA: s tillgänglighet till regulatoriska transfaktorer och DNA-konformationsförändringar (dubbelhelixavlindning) som krävs för mallsyntesen. Därför är det allmänt accepterat att DNA-beroende syntetiska processer i cellkärnan kräver en strukturell övergång av kromatin från dess kondenserade, repressiva tillstånd till en mer tillgänglig, öppen konformation. Cytologiskt definieras dessa två kromatintillstånd som heterokromatin och eukromatin. Det finns emellertid fortfarande ingen enighet om sättet att DNA-vikas i kärnan. Hypoteserna sträcker sig från en "polymersmältningsmodell" 11, där nukleosomal fiber beter sig som en slumpmässig polymer för vilken förpackningsdensiteten styrs av fasseparationsmekanismer, till hierarkiska vikningsmodeller som postulerar sekventiell bildning av kromatinfiberliknande strukturer med ökande tjocklek12,13. Hierarkiska vikningsmodeller fick nyligen stöd från molekylära tillvägagångssätt baserade på analys av in situ DNA-DNA-kontakter (kromosomkonformationsfångst, 3C), vilket visar förekomsten av hierarkin för kromatinstrukturella domäner14. Det är viktigt att notera att replikationsenheter korrelerar mycket bra med dessa kromatindomäner15. Den största kritiken mot dessa modeller är baserad på potentiell artificiell kromatinaggregering orsakad av provberedningsförfaranden, såsom permeabilisering av cellmembran och avlägsnande av icke-kromatinkomponenter, för att förbättra kromatinkontrasten för ultrastrukturella studier samtidigt som kromatintillgängligheten för olika sonder förbättras (t.ex. antikroppar). De senaste tekniska framstegen inom selektiv DNA-färgning för elektronmikroskopi genom DNA-bindande fluoroformedierad fotooxidation av diaminobenzidin (ChromEMT6) har gjort det möjligt att eliminera detta hinder. Samma överväganden gäller emellertid för elektronmikroskopivisualisering av replikering av DNA17,18. Här beskriver vi en teknik som möjliggör samtidig högupplöst ultrastrukturell kartläggning av nysyntetiserat DNA och totalt kromatin i intakta aldehyd-tvärbundna celler. Tekniken kombinerar detektion av EdU-märkt DNA genom klickkemi med biotinylerade sonder och streptavidin-nanoguld och ChromEMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555-azide</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>A20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>C3730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Boval</td>
			<td>LY-0080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>26544-38-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90-72-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin monomer</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>90529-77-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25%, EM Grade)</td>
			<td>TED PELLA, INC</td>
			<td>18426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>258850010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141396.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>213462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMA</td>
			<td>SPI-CHEM</td>
			<td>25134-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver lactate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>359750-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate</td>
			<td>Termo Fisher</td>
			<td>S11223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Nanogold conjugate</td>
			<td>Nanoprobes</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrachloroauric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>HT1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L</td>
			<td>298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka Chemica</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper single slot grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Cy5 HQ</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife Ultra Wet 45o</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DU</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-tilt sample holder</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>Multi Bio RS-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer</td>
			<td>Jeol</td>
			<td>JEM-2100</td>
			<td>Alternatives: FEI, Hitachi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>UltraCut-E</td>
			<td>Alternatives: RMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging replicative domains in ultrastructurally preserved chromatin by electron tomography

Principer för DNA-vikning i cellkärnan och dess dynamiska omvandlingar som uppstår under uppfyllandet av grundläggande genetiska funktioner (transkription, replikation, segregering etc.) förblir dåligt förstådda, delvis på grund av bristen på experimentella metoder för högupplöst visualisering av specifika kromatinlokier i strukturellt bevarade kärnor. Här presenterar vi ett protokoll för visualisering av replikativa domäner i monolagercellodling in situ, genom att kombinera EdU-märkning av nyligen syntetiserat DNA med efterföljande etikettdetektion med Ag-amplifiering av Nanogold-partiklar och ChromEM-färgning av kromatin. Detta protokoll möjliggör högkontrast, högeffektiv förinbäddningsmärkning, kompatibel med traditionell glutaraldehydfixering som ger den bästa strukturella bevarandet av kromatin för rumstemperaturprovbehandling. En annan fördel med förinbäddning av märkning är möjligheten att förvälla celler av intresse för sektionering. Detta är särskilt viktigt för analys av heterogena cellpopulationer, liksom kompatibilitet med elektrontomografimetoder för högupplöst 3D-analys av kromatinorganisation vid replikationsställen och analys av postreplikativ kromatinomläggning och systerkromatidsegregering i interfasen.

Replikationsfoci i däggdjurscellkärnor visar distinkta distributionsmönster inom kärnan beroende på S-fasprogression. Dessa mönster korrelerar med transkriptionsaktiviteten för de loci som replikeras. Eftersom metoden som presenteras här använder ett ganska starkt fixeringsförfarande är det ganska enkelt att använda replikativ pulsmärkning för specifik detektion av kromatinloki i olika transkriptionstillstånd, även under förhållanden som erbjuder bästa strukturella bevarande av kromatin erhållet genom...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography at JoVE.com

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Detta protokoll presenterar en teknik för högupplöst kartläggning av replikationsställen i strukturellt bevarat kromatin in situ som använder en kombination av förinbäddning av EdU-streptavidin-Nanogold-märkning och ChromEMT.

Imaging Replicative Domains i ultrastrukturellt bevarat kromatin genom elektrontomografi

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Vi presenterar ett protokoll för elektronmikroskopisk visualisering av de replikativa domänerna i cellen genom EdU-märkning av det nyligen syntetiserade DNA och etikettdetektering med silverförbättring av Nanogold-partiklar och ChromEM-färgning av kromatinet. Detta protokoll ger högkontrast förinbäddningsmärkning med traditionell glutaraldehydfixering som ger den bästa strukturella bevarandet av kromatinet för rumstemperaturprovbehandlingen. Detta protokoll är optimerat för vidhäftningscellen som växer på täckglasen i petriskålen.Tillsätt EdU till 10 mikro mol slutlig koncentration och placera cellerna i inkubatorn under önskad märkningstid. Fixa de märkta cellerna med 2,5% gluaradehydrat i en 100 millimol natriumkakodylatlösning i en timme. Längre fixeringstid kan påverka EdU-märkningen negativt.Avlägsna glutaraldehyd genom att skölja proverna med PBS kompletterat med fem millimol magnesiumklorid, vidare betraktad som PBS-stjärna. Tvätta tre gånger i 10 minuter. Permeabilisera plasmamembran med 1% lösning av Trione X-100 i PBS-stjärnan, gör två förändringar i fem minuter vardera.Denna lösning kallas vidare PBS-stjärnan T.Tvätta provet i stor utsträckning med PBS-stjärna. Fem byten i fem minuter vardera. Släck restaldehydgrupperna med 20 millimol glycin i PBS-stjärnan, två gånger i 10 minuter.Placera provet i PBS-stjärna med 1% BSA i en halvtimme. Medan du blockerar i BSA, förbered reaktionscocktailen för EdU-detektion. Ordningen på komponenttillägget är viktigt.EdU biotin-azidkonjugering utförs i den fuktiga kammaren för att minimera avdunstning och koncentrationsförskjutningar i reaktionscocktailen. Förbered den fuktiga kammaren. Placera täckglaset på parafilmen med en cell vänd uppåt och skikt 50 till 100 mikroliter av reaktionscocktailen på täckglaset.Reaktionen tar 30 minuter vid rumstemperatur. Stoppa reaktionen genom att tvätta provet i PBS-stjärna T, fem gånger i fem minuter vardera. Blockera igen med 1% BSA i PBS-stjärnan T i ytterligare en halvtimme.Förbered streptavidin-Nanogold-lösning i PBS-stjärna T med 1% BSA. Inkubera provet med streptavidin över natten vid plus fyra grader i en nyberedd fuktig kammare. Förfarandet är detsamma som med EdU biotin-azidkonjugering.Stoppa reaktionen och tvätta provet, fem gånger i 10 minuter vardera med PBS-stjärnan T.Stabilisera biotin streptavidinkomplexet genom ytterligare fixering kommer 1% glutaraldehyd PBS stjärna i en halvtimme. Ta bort glutaraldehyd genom intensiv tvättning med avjoniserat vatten. Släck restaldehydgrupper med ett milligram per milliliter natriumborhydrid.Tvätta igen noggrant. Nästa steg är att öka storleken på Nanogold-partiklar med hjälp av silveravsättning på den gyllene banan. Förbered förblandningar för att minimera mörkrumsaktiviteten.Balansera proverna med tvättbuffert och fortsätt till ett mörkrum. Blanda komponenterna i mörkrummet för att förbereda tvättlösningen och applicera den på proverna. Acacia pulverlösning är mycket visiklar.Så under blandning av komponenterna, gunga röret långsamt för att undvika bubbel- och skumbildning. Reaktionen tar från två till fem minuter. Vi rekommenderar att du utför en testkörning för att bestämma den optimala reaktionstiden.Längre inkubationstid kan resultera i en ospecifik silverdeponering. För att stoppa reaktionen, skölj snabbt provet med tre till fem förändringar av det avjoniserade vattnet. Följt av ytterligare tre byten i fem minuter vardera.För att skydda silvernanopartiklarna från upplösning av osmiumtetroxiden, inkubera proverna i 0,05% tetrakloraursyra i två minuter i mörkret. Tvätta noggrant med avjoniserat vatten. I detta skede tillsätts ytterligare kontrast till det DNA-innehållande materialet.Mätta provet med DRAQ5 DNA-fläck. Tillsätt diamionobensidinlösning till provet och inkubera i en minut. Flytta täckglaset i glasbotten Petriskålen och placera den på scenen i det inverterade mikroskopet.Bestråla flera synfält med 640 nanometer rött ljus. Vänster panel visar fullständig fotoblekning av DRAQ5. På den högra panelen avbildas samma synfält i det överförda ljuset som visar DAB-fällning.Tvätta prover med avjoniserat vatten. Nästa steg bör utföras under draghuven. Framställd delvis reducerad osmiumtetroxidlösning.Var försiktig. Detta ämne är mycket flyktigt och giftigt. Applicera den beredda lösningen på provet.I detta skede reagerar de reducerade osmiumföreningarna med diamionobensidinavlagringar och ökar DNA: s kontrast. Kassera osmiuminnehållande lösning enligt din lokala föreskrift och tvätta prover tre gånger i fem minuter vardera. Provet dehydreras ytterligare i en serie ökande etanolkoncentrationer följt av infiltration av cellerna med etanolhartsblandningar.Byt ut alkoholhartsblandning med nyberedd ren harts. Fyll den korrekta inbäddningsformen med ett nyberedt harts. Placera täckglaset med en cell som vetter ner över det hartsfyllda hålrummet.Bota hartset i 24 timmar vid 37 grader. Sedan vid 60 grader i minst två dagar. Ta bort harts från en bottenyta på ett lock.Släpp plattan i ett flytande kväve och överför sedan till kokande vatten. Glaset ska lossna. Upprepa vid behov.Bestrålade synfält bör vara tydligt synliga på grund av diamionobensidindeponering och DAB-färgning. Klipp ut intresseområdet från plattan med hjälp av bågfil eller något annat lämpligt instrument. Placera utskärningen i den enkla hållaren ultramikrotom.Ställ in ultramikrotomet för slutlig blocktrimning. Förbered den pyramidformade pilletten med rakbladet. Storleken på ett plant område ovanpå pyramiden bör vara cirka 400 med 200 mikron.Montera den förberedda pyramiden i ultramikroromen och installera kniven. Förbered avsnitten. Sektionstjockleken kan justeras för att passa de experimentella kraven.Vi strävar efter EM-tomografi. Så vi förberedde sektioner med en tjocklek av 250 nanometer, även kallade halvtunna sektioner. Lossa sektionerna från knivens kant och montera dem på ett slitsgaller.Vi använde ett slitsgaller, de var runda en millimeter för att vara runt, en millimeter sidoöppning. Den lilla öppningsstorleken ger bättre stabilitet i sektionerna. Låt proverna torka på gallret.För närvarande är sektionerna redo för observation. Placera gallret i elektronmikroskopprovhållaren. Ladda provet i elektronmikroskopet.Skaffa tilt-serien. Replikationsfoci i däggdjurscellkärnor visar distinkta distributionsmönster beroende på S-fasprogressionen. Framgångsrik EdU-märkning bekräftad av klickreaktionen med fluorescerande märkt azid visar typiskt replikationsmönster i den heterogena cellpopulationen efter glutaraldehydfixering ovanpå.Streptavidin märkning kan påverkas av glutaraldehyd. Så kontrollera först fluorescensstreptavidinfärgningen under samma tillstånd som streptavidin nanogold på botten. Bra resultat av silverförbättringsförfarandet är en mörkbrun färgning av vissa kärnor och mycket svag gul cytoplastfläck, som visas på botten.Fördelen med en förinbäddningsmärkning är möjligheten att välja celler för sektionsdelen. Det är möjligt i detta skede eftersom märkningsmönstren blir synliga under ett ljust fältmikroskop. Lämplig etikettering resulterar i de väl avgränsade replikeringsplatserna.Pilspetsen visar de DAB-färgade kromatinfibrerna. Bakgrundsmärkningen till höger är begränsad till några nanopartiklar per kvadratmikron. Halvtunna sektioner är redo för tomografi och kräver inte tillsats av guldnanopartiklar.Den beskrivna metoden som används för studier av kromatinorganisation på platser med aktiverad replikation. För analys av postreplikativ omläggning av kromatin inklusive högupplöst avbildning av kromatinsegregering. Det används också för replikerad märkning av stora kromosomala domäner och studier av kromatinveckning av högre ordning och heterokromatin.Denna avbildningsteknik är också viktig som referenspunkt för de data som genereras av andra icke-mikroskopiska metoder. Metoden kan också rymmas i korrelerade mikroskopiska studier inklusive superupplösningstekniker. Detta öppnar nya horisonter i studier av kromatin högre ordningsstruktur och dess dynamik i cellens olika fysiologiska tillstånd.

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Rening (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Visualisering av ATP-syntas dimerer i Mitokondrier från Electron Cryo-tomografi

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Isolering av specifika genomregioner och Identifiering av associerade molekyler av enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Beredning och övervakning av Thick Biologiska Prover av Scanning transmissionselektronmikroskopi Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Provberedning och avbildning av Exosomes av transmissionselektronmikroskopi

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D mitokondriell ultrastruktur Drosophila indirekta flyg muskel avslöjades av Serial-avsnitt Electron tomografi

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisering av DNA packning i cyanobakterier av högspännings-Cryo-elektron tomografi

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiska provberedning genom högtrycks frysning, mikrovågsugn-assisted kontrastförbättring, och Minimal harts inbäddning för volym Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

CryoAPEX-metoden för elektronmikroskopi analys av membranproteinlokalisering inom ultrastrukturellt bevarade celler

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...