Name: measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes
Uploaded: 2021-08-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochon

وقد تم دعم هذا العمل ماليا من خلال منحة جامعة كانساس سيتي الداخلية لعبد الباقي أغباس وزمالة أبحاث الصيف لدانيال باريرا. المؤلفون ممتنون لعمل الدكتور جان تالي التحريري.

تم تلقي أنسجة القلب الذرية المجمدة من الدكتور شون الوافد الجديد جنبا إلى جنب مع رسالة موافقة IACUC المؤسسية. تم الحصول على أنسجة القلب من دراسة طولية طويلة الأجل، مجمدة فلاش في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. اتبعت جميع البروتوكولات المتعلقة بمعالجة أنسج?...

<ol>
	<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).</li><li>Osto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+previously+frozen+biological+samples.">Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples.</a> Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).</li><li>Agbas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transfer+cascade+enzyme+activity+assessment+in+cultured+neurons+and+select+brain+regions.">Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions.</a> Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).</li><li>Hathaway, Q. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal-engineered+nanomaterial+exposure+disrupts+progeny+cardiac+function+and+bioenergetics.">Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).</li><li>May, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+maternal+aerobic+exercise+during+pregnancy+on+fetal+cardiac+function+and+outflow.">Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).</li><li>Ehler, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+of+malignant+hyperthermia+in+a+porcine+model+for+experimental+open+heart+surgery.">Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery.</a> Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).</li><li>Panov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bovine+serum+albumin+on+mitochondrial+respiration+in+the+brain+and+liver+of+mice+and+rats.">Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).</li><li>Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+using+blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).</li><li>Pressure Biosciences Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , (2010).</li><li>McLaughlin, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+to+quantify+mitochondrial+content+and+intrinsic+bioenergetic+efficiency+across+organs.">Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).</li><li>Hom, J., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+dynamics+of+mitochondria--a+special+emphasis+on+cardiac+muscle+cells.">Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+respiratory+chain+supercomplex+formation+in+response+to+exercise+in+human+skeletal+muscle.">Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle.</a> Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).</li></ol>

تتم الإشارة إلى الخطوات الهامة لهذا البروتوكول هنا. أولا، ينبغي التعامل مع تجانس الأنسجة بعناية بحيث لا يتم تطبيق الآثار المفرطة خلال عملية تجانس الأنسجة. وينبغي استخدام التقطيع الأنسجة، وهو جزء من تكنولوجيا ركوب الدراجات الضغط (PCT) لتجانس الأنسجة الأولي9. هذه الخطوة سوف تقلل...

كان الهدف من هذا البروتوكول هو توفير خطوات مفصلة للحصول على إعداد غني بالميتوكوندريا من أنسجة القلب المجمدة سابقا مع تقنية جديدة من الاضطراب الميكانيكي منخفض الطاقة للأنسجة التي تحسن تحلل الأنسجة واستخراج الميتوكوندريا. مع هذه الطريقة، وتحسين كفاءة استخراج دون توليد إجهاد القص عالية أو ارتفاع درجة الحرارة ووقت التجانس قصيرة (10-12 ق) تصبح قابلة للتحقيق1.
للحصول على الميتوكوندريا من الأنسجة المجمدة المؤرشفة هو رصيدا قيما لإجراء كل من functional2 والدراسات الكيميائية الحيوية3 خلاف ذلك لا يمكن تكرارها بسهولة في ظل الظروف التجريبية الدقيقة. وقد استخدمت الكلاسيكية بوتر-Elvehjem تفلون حشرات الزجاج المتجانس أو Dounce المتجانس ولا يزال يستخدم في مختبرات البحوث لتجانس الأنسجة الرخوة مثل الكبد والكلى والدماغ. ومع ذلك، يتطلب تجانس الأنسجة الصلبة مثل العضلات والقلب المزيد من الوقت للتجانس، وعلاج الإنزيم، والتجانس عالي السرعة، وخبرة واسعة للمستخدم. هذا غير مؤات لاستخراج العضيات سليمة مثل الميتوكوندريا من الأنسجة الصلبة مثل العضلات والقلب. تستخدم الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول للحصول على إعداد عالي الغلة غني بالميتوكوندريا لتحليل مجمعات البروتين في سلسلة نقل الإلكترونات الميتوكوندريا (ETC) وتكوينها الفائق في أنسجة القلب التي يتم حصادها من النسل المولود لزرع التمارين الرياضية والمستقرة ، والمجمدة فلاش في النيتروجين السائل ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. تسمح هذه الطريقة للمستخدم بعزل إعداد الميتوكوندريا المخصب عن الأنسجة المؤرشفة المجمدة سابقا.
يمكن أن يؤثر التعرض الخارجي للمواد النانوية للقوارض الحامل سلبا على وظيفة القلب والتنفس الميتوكوندريا والجيوجيات الحيوية على السلف أثناء الحمل4. ومع ذلك، لم يتم بعد توثيق التغيرات الإيجابية الناجمة عن التمارين الهوائية في الجيوجيات الحيوية للخلايا العضلية الجنينية أثناء الحمل. ومع ذلك، تقدم الدراسات الناشئة أدلة على أن التمارين الهوائية الأمومية أثناء الحمل لها تأثير إيجابي على وظيفة قلب الجنين5. ومن أجل تقديم المزيد من الأدلة، تم إجراء تحليل للآثار الطولية لممارسة الأمهات على مجمعات سلسلة الميتوكوندريا القلبية للنسل (أي المجمع 1 من خلال المجمع الخامس) أثناء الحمل.
هذه الدراسة لها أهمية صحية كبيرة لأن النتائج قد تشير إلى أن ممارسة الأم يحسن كفاءة إنتاج الطاقة في الميتوكوندريا القلبية للذرية. في هذه الدراسة، تم استخدام البذرات (أنثى الخنزير) كنموذج حيواني لسببين: (1) فسيولوجيا القلب مشابهة ل human6، و (2) حصاد أنسجة القلب من النسل من نقاط زمنية مختلفة ممكن بموجب موافقة IACUC المؤسسية. تهدف الدراسة المقترحة إلى الإجابة على العديد من الأسئلة الأساسية التي تربط بين ممارسة الأم وآثارها الإيجابية المحتملة على التركيب الخلوي والكيميائي الحيوي لأنسجة قلب النسل. يتطلب هذا النهج تقنيات عزل الميتوكوندريا اللطيفة والفعالة من أنسجة القلب المجمدة سابقا التي تم الحصول عليها من الدراسات الطولية الطويلة والمكلفة التي تناولت قضايا التغيرات الحيوية داخل خلايا قلب الجنين أثناء الحمل. تسمح الطريقة الموصوفة في هذه الدراسة باستخدام مبالغ كبيرة من الأنسجة المؤرشفة المجمدة سابقا لإعداد الميتوكوندريا المخصب لكل من الدراسات التحليلية والوظيفية. وستساعد الدراسة أيضا على سد الفجوة المعرفية في هذا المجال من خلال توفير بيانات أولية، مما قد يؤدي إلى دراسات مستقبلية تحدد آثار ممارسة الأمهات على صحة القلب في الرحم وخارجه.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino caproic acid</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hu Total OxPhos complex kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>458199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VDAC antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>use 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250</td>
			<td>ThermoSientific</td>
			<td>20279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie GelCode Blue</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>24592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Cabiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-Glass pestle homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885451-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>LC0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native molecular weight marker</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh monofilament</td>
			<td>Small Part Inc</td>
			<td>CMN-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>ThermoScientfic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCT Shredder</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEA BLOCK Blocking buffer</td>
			<td>ThermoScienctific</td>
			<td>37527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shredder PULSE Tube</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td>FT500-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M150-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M191-1G</td>
			<td>Requires fresh preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes

يتم تعديل ملف تعريف مجمع نقل الإلكترونات الميتوكوندريا (ETC) في أنسجة القلب للنسل المولود لبذر ممارس. كانت الفرضية المقترحة والمختبرة هي أن ممارسة الأمومة المنتظمة للبذر أثناء الحمل من شأنها أن تزيد من كفاءة الميتوكوندريا للذرية الحيوية للقلب. تم اختبار هذه الفرضية عن طريق عزل الميتوكوندريا باستخدام إجراء عزل خفيف لتقييم الميتوكوندريا ETC وملامح supercomplex. سمح الإجراء الموصوف هنا بمعالجة أنسجة القلب المحفوظة المجمدة سابقا وقضى على ضرورة إعداد الميتوكوندريا الطازج لتقييم مجمعات الميتوكوندريا ETC ، والتكتل الفائق ، وملامح النشاط المعقدة ETC. يصف هذا البروتوكول القياس الأمثل لمجمع بروتين ETC في الانتفاخ المناعي متعدد الأجسام المضادة والتقييم المعقد للغاية باستخدام الكهربائي الهلامي الأزرق الأصلي.

بعد البروتوكول، تم إعداد غلة جيدة من خليط البروتين المخصب بالميتوكوندريا من أنسجة القلب. تم الحصول على ما يقرب من 15 ملغم / مل من خليط البروتين المخصب بالميتوكوندريا من متوسط 1.2 غرام من أنسجة القلب المجمدة التي تم حصادها من ذرية البذر. كانت كمية إعداد الميتوكوندريا كافية لإجراء (1) تحليل مناع...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochon

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

وسمح إعداد عينات غنية بالميتوكوندريا من الأنسجة الصلبة المحفوظة المجمدة سابقا للمحققين بإجراء تقييمات وظيفية وتحليلية على حد سواء للميتوكوندريا في مختلف الطرائق التجريبية. توضح هذه الدراسة كيفية إعداد الاستعدادات المخصبة بالميتوكوندريا من أنسجة القلب المجمدة وإجراء تقييمات تحليلية للميتوكوندريا.

قياس مجمعات نقل الإلكترونات الميتوكوندريا في الأنسجة القلبية المجمدة سابقا من ذرية سو: نموذج لتقييم التغيرات في الجيوجيات الحيوية الميتوكوندريا الناجمة عن ممارسة الرياضة

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح للمستخدمين بإعداد عينات الميتوكوندريا من الأنسجة المجمدة التي تم جمعها من الدراسات السابقة وأرشيفها. كما يقلل هذا البروتوكول من استخدام الحيوانات الحية لحصاد الأنسجة. تسمح هذه التقنية للمستخدمين باستخدام أنسجة الأرشيف المجمدة سابقا لإعداد عينات الميتوكوندريا المخصبة من خلال استخدام طريقة لطيفة لتمزيق الأنسجة.هذه الطريقة في التحضير يزيد من غلة إعداد الميتوكوندريا. من خلال قراءة البروتوكول من المستحسن لضمان توافر جميع المكونات والأدوات وخاصة محرك التقطيع مشحونة بالكامل وأيضا ممارسة مع بعض الأنسجة غير المرغوب فيها للتعرف على الخطوات. إثبات الإجراء سيكون إدينا كوسا، باحث مشارك من مختبري.في البداية، سجل وزن الأنبوب الذي يحتوي على أنسجة القلب. الآن وزن أنبوب فارغ وطرحه من الوزن المسجل سابقا للحصول على وزن صافي من أنسجة القلب. وضع أنسجة القلب المجمدة مباشرة في كوب من محلول الجليد البارد.يحرك لمدة خمس دقائق. في وقت واحد باستخدام ملاقط تطبيق ضغط طفيف على الأنسجة للخروج من الدم قدر الإمكان. أخرج الأنسجة باستخدام ملقط واعصر القلب بمنشفة ورقية نظيفة لإزالة الدم.ثم ضع الأنسجة في كوب آخر من محلول البرد الجليدي. بعد تحريك الأنسجة لمدة خمس دقائق، قم بتجفيف الأنسجة برفق على منشفة ورقية وأزل الدهون والدم المتخثر والأوريسيل واللفافة. تجمع الأنسجة البطينية.لتمزيق عينات الأنسجة، ضع 50 إلى 300 ملليغرام من أنسجة القلب في غرفة تقطيع الأنسجة من جانب الكبش وإغلاق جانب الكبش. ثم أضف حوالي 0.2 إلى 0.8 ملليلتر من عازلة الغسيل إلى جانب الغطاء من الأنبوب. استخدام أداة أنبوب لسقف غرفة التقطيع مع غطاء التقطيع بشكل مريح دون أكثر من تشديد عليه.ضع غرفة التقطيع في وحدة حامل التقطيع مع جانب الكبش لأسفل لتركيبها. إدراج وإشراك بت من سائق التقطيع مشحونة بالكامل مع غطاء التقطيع ضمان يتم تأمين بت بشكل مريح في مكان ثم تطبيق الضغط وصولا الى سائق التقطيع في غرفة التقطيع حتى مؤشر الضغط على حامل التقطيع تصل إلى إعداد ما يقرب من اثنين. اضغط على المشغل وتشغيل برنامج تشغيل التقطيع لمدة 10 إلى 12 ثانية مع الحفاظ على الإعداد عند اثنين.مراقبة أنبوب لضمان تمزيق وتمرير كل أو معظم كتلة الأنسجة من خلال قرص التحلل في غرفة التقطيع العلوي وإذا لزم الأمر العودة أنبوب إلى حامل التقطيع لمواصلة تمزيق. بعد تمزيق العينة رفع غرفة التقطيع من وحدة حامل واستخدام أداة أنبوب لإزالة غطاء التقطيع ووضعه على سطح نظيف للاستخدام في وقت لاحق أوصى فقط داخل نفس العينة لتجنب التلوث عبر من عينات الأنسجة الأخرى. نقل أنسجة القلب الممزقة إلى الكأس الثالث مع 40 ملليلتر من العازلة الغسيل مع شريط ضجة وأثار الأنسجة لمدة خمس دقائق بسرعة متوسطة بينما على لوحة اثارة.تصفية التعليق من خلال شبكة النايلون المبتلة مسبقا monofilament. بعد التخلص من الشعيرات غسل الأنسجة الممزقة على مرشح ثلاث مرات مع 10 ملليلتر من العازلة الغسيل. نقل الأنسجة المغسولة إلى كوب 50 ملليلتر مع 20 ملليلتر من العازلة الغسيل وضعت في حمام الجليد على ضجة المغناطيسي.إضافة 0.5 ملليلتر من محلول تريبسين في حين اثارة باستمرار لمدة 15 دقيقة. في منتصف الطريق تقريبا من خلال اثارة نقل تعليق الأنسجة في التجانس الزجاج على الزجاج المحمولة فضفاضة التي يمكن أن تعقد 15 ملليلتر من حجم. تجانس التعليق مع أربع إلى خمس ضربات لطيف دون إنتاج زبد.ثم، ضع المتجانسة في كوب 50 ملليلتر واخلطها على طبق إثارة. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلترات من العازلة العزلة التي تحتوي على مثبط التربسين إلى المتجانسة واحتضانها أثناء التحريك بلطف. بعد تصفية التعليق مرة أخرى من خلال مرشح النايلون حفظ مرشح في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر ونقل جزء الجسيمات اليسار على مرشح إلى التجانس الزجاج على الزجاج.في 15 إلى 20 ملليلتر من العازلة الغسيل وتجانس بلطف مع اليد لمدة 25 إلى 30 ثانية. بعد الجمع بين المتجانسة مع الخيوط وتحقيق التوازن بين الأنابيب، والطرد المركزي ومن ثم استخدام ماصة بلاستيكية إزالة supernatant ترك 0.2 ملليلتر من الجزء العلوي من بيليه رقيق. تصفية supernatant الناتجة في أنبوب مخروطي جديد باستخدام مرشح النايلون لتجنب التلوث والطرد المركزي مرة أخرى.بعد التخلص من الناسخة العملاقة غسل بيليه مرتين إلى ثلاث مرات عن طريق إضافة العازلة العزل إلى جانب الأنبوب لمنع كسر أو تلويث بيليه. تجاهل طبقة الحافة الخارجية البيضاء المنفوشة في كل مرة. إضافة خمسة ملليلتر من العازلة العزلة إلى كل أنبوب وتفتيت بيليه باستخدام ماصة مع طرف ملليلتر واحد أو ماصة نقل جديدة ثم تمييع التعليق مع 20 ملليلتر من العازلة العزل إضافية والطرد المركزي تعليق في 8, 500 X ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية.بعد التخلص من resuspend supernatant بيليه أولا في خمسة ملليلتر ثم في 15 ملليلتر إضافية من العازلة وإعادة تعليق والطرد المركزي في 8، 500 X غرام لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. الآن تجاهل supernatant وحفظ بيليه البني التي تحتوي على الميتوكوندريا سليمة غسلها. إعادة إنفاق بيليه الميتوكوندريا المخصب في 250 ميكرولتر من العازلة إعادة تعليق بما في ذلك مثبطات البروتيز.Aliquot تعليق في حجم 25 ميكرولتر، وتجميد سريع في النيتروجين السائل وتخزينها في ثلاجة عميقة 80 درجة مئوية لعدة سنوات. بعد البروتوكول تم إعداد البروتين المخصب بالميتوكوندريا من قلب النسل المولود لمجموعتين من البذرات. ومارست إحداها أثناء الحمل والأخرى كانت مستقرة.وكشف تحليل الملف الشخصي للبروتين ETC أن ذرية البذرات التي تمارس قدمت مستويات منخفضة نسبيا في بعض مجمعات ETC. تم حل البروتينات الميتوكوندريا في 3 إلى 8٪ التدرج BN-PAGE والمناعة مع كوكتيلات الأجسام المضادة. كل من الجماعات التي تمارس والمستقرة تظهر supercomplexes متعددة.وكانت الزيادة البارزة في الاتصال الفائق التي لوحظت في تسعة أشهر في المجموعة التي تمارس مقارنة بالمجموعة المستقرة. تم تحليل البروتينات المخصبة بالميتوكوندريا التي تم الحصول عليها من فئات عمرية مختلفة من 48 ساعة ثلاثة أشهر وستة أشهر وتسعة أشهر لنشاط I-II المعقد باستخدام الفحص الحركي. وأظهرت المجموعة التي تمارس نشاط معقد من الفئة الأولى إلى الثانية مقارنة بنشاط المجموعة المستقرة.وتظهر جدوى الدراسات الوظيفية على الميتوكوندريا التي تم الحصول عليها من الأنسجة والخلايا المجمدة من قبل محققين آخرين. يمكن تطبيق إعداد الميتوكوندريا التي تم الحصول عليها من الأنسجة المجمدة لمجموعة واسعة من الأنسجة مع الحد الأدنى من الضرر.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

تحليل سوبيركومبلكسس من سلسلة النقل الإلكترون الميتوكوندريا مع الكهربائي الأصلي، في هلام فحوصات، والكهرباء

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

بروتوكول محسن لاستخراج البروتينات من صمام ميترال الإنسان

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

تحليلات لتدفق الكالسيوم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المستزرعة

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في ألياف بيرميبيليزيد من المورفولوجية استخدام كميات ضئيلة من الأنسجة

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية الكبد وحركية تسرب بروتون لتقدير التنفس المتقدرية في الأبقار الحلوب هولشتاين

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

منصة غشاء نموذج لإعادة تشكيل ديناميات غشاء الميتوكوندريا

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

وضع العلامات والتصور لمنتجات التعبير الجينوم الميتوكوندريا في خميرة بيكر Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

تقييم وظيفة الميتوكوندريا في العصب الوركي عن طريق قياس التنفس عالي الدقة

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...