Name: measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes
Uploaded: 2021-08-16T14:30:00
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这项工作得到了堪萨斯城大学对Abdulbaki Agbas的校内资助和Daniel Barrera的暑期研究奖学金的财政支持。作者感谢Jan Talley博士的编辑工作。

冷冻的后代心脏组织从Sean Newcomer博士那里收到了机构IACUC的批准函。心脏组织来自长期纵向研究，在液氮中快速冷冻，并储存在-80°C以备将来使用。所有关于后代心脏组织处理的协议都遵循堪萨斯城大学IBC和IACUC委员会的指导方针。
1. 缓冲液和试剂的制备
注：按照制造商的指南准备所有样品。在所有配方和实验步骤中使用超纯水或等效水。在此过程中，请...

<ol>
	<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).</li><li>Osto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+previously+frozen+biological+samples.">Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples.</a> Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).</li><li>Agbas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transfer+cascade+enzyme+activity+assessment+in+cultured+neurons+and+select+brain+regions.">Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions.</a> Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).</li><li>Hathaway, Q. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal-engineered+nanomaterial+exposure+disrupts+progeny+cardiac+function+and+bioenergetics.">Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).</li><li>May, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+maternal+aerobic+exercise+during+pregnancy+on+fetal+cardiac+function+and+outflow.">Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).</li><li>Ehler, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+of+malignant+hyperthermia+in+a+porcine+model+for+experimental+open+heart+surgery.">Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery.</a> Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).</li><li>Panov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bovine+serum+albumin+on+mitochondrial+respiration+in+the+brain+and+liver+of+mice+and+rats.">Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).</li><li>Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+using+blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).</li><li>Pressure Biosciences Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , (2010).</li><li>McLaughlin, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+to+quantify+mitochondrial+content+and+intrinsic+bioenergetic+efficiency+across+organs.">Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).</li><li>Hom, J., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+dynamics+of+mitochondria--a+special+emphasis+on+cardiac+muscle+cells.">Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+respiratory+chain+supercomplex+formation+in+response+to+exercise+in+human+skeletal+muscle.">Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle.</a> Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).</li></ol>

此处指明了此协议的关键步骤。首先，应仔细处理组织均质化，以便在组织均质过程中不会施加过多的纯粹效应。应使用组织粉碎机，这是用于初始组织均质的压力循环技术（PCT）的一部分9。该步骤将减少玻璃对玻璃均质机的过度中风周期（图1B），由于冷冻组织条件，可能会进一步破坏已经脆弱的线粒体。其次，冷冻组织重量对于获得足够量的富含线粒?...

该协议的目标是提供详细的步骤，通过一种低能机械破坏组织的新技术从先前冷冻的心脏组织中获得富含线粒体的制剂，从而改善组织裂解和线粒体的提取。通过这种方法，可以在不产生高剪切应力或高温的情况下提高提取效率，并且均质时间短（10-12秒）可实现1。
从存档的冷冻组织中获得线粒体是进行功能2 和生化研究3的宝贵资产， 否则在确切的实验条件下不容易重复。经典的Potter-Elvehjem特氟龙杵玻璃均质机或Dounce均质机已被使用，并且仍在研究实验室中使用，以均质化肝脏，肾脏和大脑等软组织。然而，肌肉和心脏等硬组织均质化需要更多的均质时间，酶处理，高速均质和丰富的用户体验。这对于从肌肉和心脏等硬组织中提取完整的细胞器（如线粒体）是不利的。该方案中描述的方法用于获得高产量的富含线粒体的制剂，以分析线粒体电子传递链（ETC）蛋白质复合物及其在从运动和久坐不动的母猪出生的后代收获的心脏组织中的超复合物形成，在液氮中快速冷冻，并储存在-80°C以备将来使用。该方法允许用户从先前冷冻的存档组织中分离出富含线粒体的制剂。
外界纳米材料暴露于妊娠期啮齿动物会对后代的心脏功能、线粒体呼吸和生物能量产生负面影响4。然而，有氧运动诱导的妊娠期胎儿肌细胞生物能量的积极变化尚未得到证实。然而，新兴研究提供证据表明，孕产妇在怀孕期间进行有氧运动对胎儿心脏功能有积极影响5。为了提供进一步的证据，分析了妊娠期间母体运动对后代心脏线粒体呼吸链复合物（即复合物I至复合物V）的纵向影响。
这项研究具有重要的健康相关性，因为结果可能表明母亲的运动可以提高后代心脏线粒体的能量产生效率。在这项研究中，母猪（母猪）被用作动物模型有两个原因：（i）心脏生理学与人类相似6，以及（ii）根据机构IACUC批准，从不同时间点的后代收获心脏组织是可行的。拟议的研究旨在回答许多基本问题，这些问题与母亲的运动及其对后代心脏组织的细胞和生化组成的潜在积极影响有关。这种方法需要温和而有效的线粒体分离技术，这些技术来自先前冷冻的心脏组织，这些研究来自冗长且昂贵的纵向研究，这些研究解决了怀孕期间胎儿心肌细胞内生物能量变化的问题。本研究中描述的方法允许利用大量先前冷冻的存档组织进行富含线粒体的制备，以进行分析和功能研究。该研究还将通过提供初步数据来帮助填补该领域的知识空白，这可能导致未来的研究确定孕产妇运动对子宫内外心脏健康的影响。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino caproic acid</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hu Total OxPhos complex kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>458199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VDAC antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>use 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250</td>
			<td>ThermoSientific</td>
			<td>20279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie GelCode Blue</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>24592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Cabiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-Glass pestle homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885451-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>LC0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native molecular weight marker</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh monofilament</td>
			<td>Small Part Inc</td>
			<td>CMN-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>ThermoScientfic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCT Shredder</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEA BLOCK Blocking buffer</td>
			<td>ThermoScienctific</td>
			<td>37527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shredder PULSE Tube</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td>FT500-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M150-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M191-1G</td>
			<td>Requires fresh preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes

线粒体电子转移复合物（ETC）谱在运动母猪所生后代的心脏组织中被修改。提出并测试的假设是，在怀孕期间母猪的定期母体运动将增加后代心脏生物能量的线粒体效率。通过使用轻度分离程序分离线粒体来评估线粒体ETC和超复合物谱，以测试该假设。这里描述的程序允许处理先前冷冻的存档心脏组织，并消除了新鲜线粒体制备评估线粒体ETC复合物，超复合物和ETC复合物活性谱的必要性。该协议描述了使用蓝天然凝胶电泳进行基于多重抗体的免疫印迹和超复杂评估中的最佳ETC蛋白复合物测量。

按照方案，从心脏组织制备了富含线粒体的蛋白质混合物的良好产量。从母猪后代收获的平均1.2g冷冻心脏组织中获得约15mg / mL富含线粒体的蛋白质混合物。观察表明，少于0.5g的冷冻心脏组织没有产生足够量的富含线粒体的蛋白质混合物以进行BN-PAGE测定。线粒体制剂的量足以进行（i）用于评估单个电子转移复合物（ETC）（即复合物-I，II，III，IV和复合物-V）的标准免疫印迹分析，（ii）通过BN-PAGE?...

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Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

从先前冷冻的存档固体组织中制备富含线粒体的样品，使研究人员能够以各种实验方式对线粒体进行功能和分析评估。这项研究展示了如何从冷冻的心脏组织制备富含线粒体的制剂，并对线粒体进行分析评估。

测量来自母猪后代的先前冷冻心脏组织中的线粒体电子转移复合物：评估运动诱导的线粒体生物能量变化的模型

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

该协议具有重要意义，因为它允许用户从从先前研究收集并存档的冷冻组织中制备线粒体样本。该协议还减少了使用活体动物进行组织收获。该技术允许用户使用先前冷冻的存档组织，通过采用温和的组织切碎方法制备富含线粒体的样品。这种制备方法最大限度地提高了线粒体制备的产量。建议通过阅读协议来确保所有组件和工具的可用性，尤其是充满电的碎纸机驱动器，并且还使用一些不需要的组织进行锻炼以熟悉步骤。演示该过程的将是我实验室的研究助理Edina Kosa。首先，记录含有心脏组织的管子的重量。现在称量空管并从先前记录的重量中减去它，以获得心脏组织的净重。将冷冻的心脏组织直接放入冰冷溶液的烧杯中。搅拌五分钟。同时使用镊子对组织施加轻微的压力，以尽可能多地排出血液。用镊子取出纸巾，用干净的滤纸巾挤压心脏以去除血液。然后将纸巾放入另一个冰冷溶液烧杯中。搅拌纸巾五分钟后，用纸巾轻轻擦干纸巾，除去脂肪、凝血、耳廓和筋膜。池化心室组织。要切碎组织样品，请从冲压侧将50至300毫克的心脏组织放入组织粉碎室中，并关闭冲压侧。然后将约0.2至0.8毫升的洗涤缓冲液加入到管的盖子侧。使用管状工具用碎纸机盖紧紧地盖住碎纸机室，不要过度拧紧。将碎纸机室放入碎纸机支架单元中，冲压板侧面朝下以进行啮合安装。用碎纸机盖插入并接合充满电的碎纸机驱动器的钻头，确保刀头紧贴到位，然后向下施加压力到碎纸机室中的碎纸机驱动器，直到碎纸机支架上的压力指示器达到大约两个的设置。按下扳机并运行碎纸机驱动程序约 10 到 12 秒，同时保持设置为 2 秒。观察管以确保粉碎并确保全部或大部分组织团块通过裂解盘进入上部碎纸机室，并在必要时将管子返回到碎纸机支架以继续切碎。粉碎后，样品将碎纸机室从支架单元中取出，并使用管工具取下碎纸机盖并将其放在干净的表面上，以便以后仅在同一样品中使用，以避免其他组织样品的交叉污染。将切碎的心脏组织转移到第三个烧杯中，用40毫升的洗涤缓冲液搅拌，并在搅拌板上以中等速度搅拌组织五分钟。通过预润湿的尼龙网单丝过滤悬浮液。丢弃滤液后，用10毫升洗涤缓冲液将切碎的组织放在过滤器上三次。将洗涤的组织转移到50毫升的烧杯中，将20毫升的洗涤缓冲液置于磁搅拌的冰浴中。加入0.5毫升胰蛋白酶溶液，同时不断搅拌15分钟。搅拌大约一半时，将组织悬浮液转移到一个松散安装的手持式玻璃对玻璃均质机中，该均质机可以容纳15毫升的体积。通过四到五次轻柔的冲程使悬浮液均质化，而不会产生泡沫。然后，将匀浆放入50毫升烧杯中，在搅拌板上混合。接下来，向匀浆中加入10毫升含有胰蛋白酶抑制剂的分离缓冲液，并在轻轻搅拌的同时孵育。通过尼龙过滤器再次过滤悬浮液后，将过滤器保存在50毫升的锥形管中，并将过滤器上剩余的颗粒部分转移到玻璃对玻璃均质机中。在15至20毫升的洗涤缓冲液中，用手轻轻匀浆25至30秒。将匀浆与滤液结合并平衡管后，离心，然后使用塑料移液管从蓬松的沉淀顶部除去留下0.2毫升的上清液。使用尼龙过滤器将得到的上清液过滤到新的锥形管中，以避免污染并再次离心。丢弃上清液后，通过向管的侧面添加隔离缓冲液来洗涤沉淀两到三次，以防止破裂或污染沉淀。每次都丢弃蓬松的白色外缘层。向每个管中加入5毫升分离缓冲液，并使用带有1毫升尖端的移液器或新的转移移液器分解沉淀，然后用20毫升额外的分离缓冲液稀释悬浮液，并在4摄氏度下以8， 500 X g离心悬浮液15分钟。弃去上清液后，首先将沉淀重悬于5毫升中，然后再悬浮在另外15毫升的重悬缓冲液中，并在4摄氏度下以8， 500 X g离心15分钟。现在丢弃上清液并保存含有洗涤完好线粒体的棕色沉淀。将线粒体富集的沉淀重悬于250微升的重悬缓冲液（包括蛋白酶抑制剂）中。以25微升体积等分悬浮液，在液氮中快速冷冻，并在80摄氏度深的冰箱中储存数年。按照协议，从两组母猪所生后代的心脏中制备富含线粒体的蛋白质。一个在怀孕期间锻炼，另一个久坐不动。ETC蛋白谱分析显示，在一些ETC复合物中，运动母猪的后代水平相对较低。线粒体蛋白在3%至8%梯度BN-PAGE中分辨，并用抗体混合物进行免疫探针。运动组和久坐不动组都表现出多种超级复合体。与久坐不动的组相比，运动组观察到的显着超复合物增加在九个月时。使用动力学测定法分析了从48小时3个月，6个月和9个月的不同年龄组获得的富含线粒体的蛋白质的复合物I-II活性。与久坐组相比，锻炼组表现出复杂的I-II活性。其他研究人员展示了从冷冻组织和细胞中获得的线粒体功能研究的可行性。从冷冻组织获得的线粒体的制备可以应用于各种具有最小损伤的组织。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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使用脚手架脂质体重构脂质近端蛋白质 - 蛋白质相互作用<em&gt;体外</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

科研

生物化学

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用天然电泳，凝胶电泳和电解法分析线粒体电子传递链的超复合物

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

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