Name: measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes
Uploaded: 2021-08-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochon

Dit werk werd financieel ondersteund door de intramurale beurs van de Kansas City University voor Abdulbaki Agbas en de Summer Research Fellowship voor Daniel Barrera. De auteurs zijn dankbaar voor het redactionele werk van Dr. Jan Talley.

Bevroren hartweefsels van nakomelingen werden ontvangen van Dr. Sean Newcomer samen met de institutionele IACUC-goedkeuringsbrief. De hartweefsels werden verkregen uit een longitudinaal onderzoek, flash-bevroren in vloeibare stikstof, en opgeslagen bij -80 °C voor toekomstig gebruik. Alle protocollen met betrekking tot de verwerking van het hartweefsel van nakomelingen volgden de richtlijnen van de IBC- en IACUC-commissies van de Kansas City University.
1. Bereiding van buffers en reagentia...

<ol>
	<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).</li><li>Osto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+previously+frozen+biological+samples.">Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples.</a> Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).</li><li>Agbas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transfer+cascade+enzyme+activity+assessment+in+cultured+neurons+and+select+brain+regions.">Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions.</a> Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).</li><li>Hathaway, Q. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal-engineered+nanomaterial+exposure+disrupts+progeny+cardiac+function+and+bioenergetics.">Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).</li><li>May, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+maternal+aerobic+exercise+during+pregnancy+on+fetal+cardiac+function+and+outflow.">Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).</li><li>Ehler, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+of+malignant+hyperthermia+in+a+porcine+model+for+experimental+open+heart+surgery.">Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery.</a> Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).</li><li>Panov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bovine+serum+albumin+on+mitochondrial+respiration+in+the+brain+and+liver+of+mice+and+rats.">Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).</li><li>Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+using+blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).</li><li>Pressure Biosciences Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , (2010).</li><li>McLaughlin, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+to+quantify+mitochondrial+content+and+intrinsic+bioenergetic+efficiency+across+organs.">Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).</li><li>Hom, J., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+dynamics+of+mitochondria--a+special+emphasis+on+cardiac+muscle+cells.">Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+respiratory+chain+supercomplex+formation+in+response+to+exercise+in+human+skeletal+muscle.">Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle.</a> Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).</li></ol>

De kritieke stappen voor dit protocol worden hier aangegeven. Ten eerste moet weefselhomogenisatie zorgvuldig worden behandeld, zodat overmatige pure effecten niet worden toegepast tijdens het weefselhomogenisatieproces. Er moet een weefselversnipperaar worden gebruikt, die deel uitmaakt van de drukcyclustechnologie (PCT) voor initiële weefselhomogenisatie9. Deze stap zal de overmatige slagcyclus van glas-op-glas homogenisator verminderen (figuur 1B) die de toch al f...

Het doel van dit protocol was om gedetailleerde stappen te bieden om mitochondria-verrijkte preparaten te verkrijgen uit eerder bevroren hartweefsel met een nieuwe technologie van lage energie mechanische verstoring van weefsel die weefsellysis en extractie van mitochondriën verbetert. Met deze methode wordt een verbeterde extractie-efficiëntie zonder hoge schuifspanning of hoge temperatuur en een korte homogenisatietijd (10-12 s) haalbaar1.
Het verkrijgen van mitochondriën uit gearchiveerd bevroren weefsel is een waardevolle aanwinst om zowel functionele2 - als biochemische studies uit te voeren3 anders niet gemakkelijk herhaalbaar onder de exacte experimentele omstandigheden. Een klassieke Potter-Elvehjem Teflon stamperglashomogenisator of Dounce-homogenisator is gebruikt en wordt nog steeds gebruikt in onderzoekslaboratoria om zachte weefsels zoals lever, nieren en hersenen te homogeniseren. Het homogeniseren van harde weefsels zoals spieren en hart vereist echter meer homogenisatietijd, enzymbehandeling, snelle homogenisatie en uitgebreide gebruikerservaring. Dit is nadelig voor het extraheren van intacte organellen zoals mitochondriën uit hard weefsel zoals spieren en hart. De methode die in dit protocol wordt beschreven, wordt gebruikt om mitochondriaal verrijkt preparaat met hoge opbrengst te verkrijgen om mitochondriale elektronentransportketen (ETC) eiwitcomplexen en hun supercomplexe vorming te analyseren in hartweefsels geoogst van nakomelingen geboren uit geoefende en sedentaire zeug, flash-bevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. Met deze methode kan de gebruiker mitochondriaal verrijkt preparaat isoleren uit eerder bevroren gearchiveerde weefsels.
Blootstelling aan externe nanomaterialen aan zwangere knaagdieren kan de hartfunctie en mitochondriale ademhaling en bio-energetica op nakomelingen tijdens de zwangerschap negatief beïnvloeden4. Niettemin moeten aërobe door inspanning geïnduceerde positieve veranderingen in foetale myocytenbio-energetica tijdens de zwangerschap nog worden gedocumenteerd. Opkomende studies leveren echter bewijs dat maternale aerobe oefening tijdens de zwangerschap een positieve invloed heeft op de foetale hartfunctie5. Om verder bewijs te leveren, werd een analyse uitgevoerd van de longitudinale effecten van maternale oefening op de cardiale mitochondriale respiratoire ketencomplexen van nakomelingen (d.w.z. Complex I tot en met Complex V) tijdens de zwangerschap.
Deze studie heeft een aanzienlijke gezondheidsrelevantie omdat de resultaten kunnen suggereren dat maternale oefening de efficiëntie van de energieproductie in de hartochondriën van het nageslacht verbetert. In deze studie werden zeugen (vrouwelijk varken) om twee redenen als diermodel gebruikt: (i) hartfysiologie is vergelijkbaar met die van de mens6, en (ii) hartweefseloogst van nakomelingen uit verschillende tijdspunten is haalbaar onder een institutionele IACUC-goedkeuring. De voorgestelde studie is bedoeld om veel van de fundamentele vragen te beantwoorden die moederlijke oefening en de potentiële positieve effecten ervan op de cellulaire en biochemische samenstelling van het hartweefsel van de nakomelingen verbinden. Deze aanpak vereist zachte maar effectieve mitochondriale isolatietechnieken van eerder bevroren hartweefsel verkregen uit de langdurige en kostbare longitudinale studies die de problemen van de bio-energetische veranderingen in foetale hartmyocyten tijdens de zwangerschap aanpakten. De methode die in deze studie wordt beschreven, maakt het mogelijk om grote sommen eerder bevroren gearchiveerd weefsel te gebruiken voor mitochondria-verrijkte voorbereiding voor zowel analytische als functionele studies. De studie zal ook helpen de kenniskloof op dit gebied te dichten door voorlopige gegevens te verstrekken, wat zou kunnen leiden tot toekomstige studies die de effecten van maternale lichaamsbeweging op de gezondheid van het hart in de baarmoeder en daarbuiten bepalen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino caproic acid</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hu Total OxPhos complex kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>458199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VDAC antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>use 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250</td>
			<td>ThermoSientific</td>
			<td>20279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie GelCode Blue</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>24592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Cabiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-Glass pestle homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885451-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>LC0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native molecular weight marker</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh monofilament</td>
			<td>Small Part Inc</td>
			<td>CMN-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>ThermoScientfic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCT Shredder</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEA BLOCK Blocking buffer</td>
			<td>ThermoScienctific</td>
			<td>37527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shredder PULSE Tube</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td>FT500-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M150-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M191-1G</td>
			<td>Requires fresh preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes

Het mitochondriale elektronenoverdrachtscomplex (ETC) -profiel wordt gewijzigd in het hartweefsel van de nakomelingen die zijn geboren uit een geoefende zeug. De hypothese die werd voorgesteld en getest was dat een regelmatige maternale oefening van een zeug tijdens de zwangerschap de mitochondriale efficiëntie van de hart-energetica van het nageslacht zou verhogen. Deze hypothese werd getest door mitochondriën te isoleren met behulp van een milde isolatieprocedure om mitochondriale ETC en supercomplexprofielen te beoordelen. De hier beschreven procedure maakte de verwerking van eerder bevroren gearchiveerde hartweefsels mogelijk en elimineerde de noodzaak van verse mitochondriale voorbereiding voor de beoordeling van mitochondriale ETC-complexcomplexen, supercomplexen en ETC-complexe activiteitsprofielen. Dit protocol beschrijft de optimale ETC-eiwitcomplexmeting in multiplexed antilichaamgebaseerde immunoblotting en supercomplexe beoordeling met behulp van blue-native gel-elektroforese.

Volgens het protocol werd een goede opbrengst van mitochondriën-verrijkt eiwitmengsel uit hartweefsel bereid. Ongeveer 15 mg /ml mitochondriaal verrijkt eiwitmengsel werd verkregen uit gemiddeld 1,2 g bevroren hartweefsel geoogst van de nakomelingen van de zeug. Observaties gaven aan dat minder dan 0,5 g bevroren hartweefsel niet voldoende mitochondriaal verrijkt eiwitmengsel opleverde om een BN-PAGE-test uit te voeren. De hoeveelheid mitochondriaal preparaat was voldoende om (i) een standaard immunoblotanalyse uit te v...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochon

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

Bereiding van mitochondriën-verrijkte monsters van eerder bevroren gearchiveerde vaste weefsels stelde de onderzoekers in staat om zowel functionele als analytische beoordelingen van mitochondriën uit te voeren in verschillende experimentele modaliteiten. Deze studie toont aan hoe mitochondria-verrijkte preparaten kunnen worden bereid uit bevroren hartweefsel en analytische beoordelingen van mitochondriën kunnen worden uitgevoerd.

Het meten van mitochondriale elektronenoverdrachtscomplexen in eerder bevroren hartweefsel van de nakomelingen van zeug: een model om door inspanning geïnduceerde mitochondriale bio-energetische veranderingen te beoordelen

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

Dit protocol is belangrijk omdat het gebruikers in staat stelt om mitochondriënmonsters te bereiden van bevroren weefsels die uit eerdere studies zijn verzameld en gearchiveerd. Dit protocol vermindert ook het gebruik van levende dieren voor weefseloogst. Met deze techniek kunnen gebruikers eerder ingevroren archiefweefsels gebruiken om mitochondriën verrijkte monsters te bereiden door een zachte weefselvernietigingsmethode te gebruiken.Deze bereidingswijze maximaliseert de opbrengst van mitochondriaal preparaat. Door het lezen van het protocol is het raadzaam om de beschikbaarheid van alle componenten en hulpmiddelen te garanderen, vooral de volledig opgeladen shredderaandrijving en oefen ook met enkele ongewenste weefsels om vertrouwd te raken met de stappen. Edina Kosa, een research associate van mijn laboratorium, demonstreert de procedure.Noteer om te beginnen het gewicht van de buis met het hartweefsel. Weeg nu de lege buis en trek deze af van het eerder geregistreerde gewicht om een nettogewicht van het hartweefsel te verkrijgen. Doe het bevroren hartweefsel direct in het bekerglas van ijskoude oplossing.Roer het vijf minuten door. Oefen tegelijkertijd met een pincet lichte druk uit op het weefsel om zoveel mogelijk bloed eruit te krijgen. Haal het zakdoekje eruit met een tang en knijp in het hart met een schone filterpapieren handdoek om bloed te verwijderen.Plaats het weefsel vervolgens in een ander bekerglas met ijskoude oplossing. Na het roeren van het weefsel gedurende vijf minuten, droogt u het weefsel voorzichtig op een papieren handdoek en verwijdert u het vet, het geklonterde bloed, de oorschelpen en de fasciae. Pool het ventriculaire weefsel.Om de weefselmonsters te versnipperen, plaatst u 50 tot 300 milligram hartweefsel in de weefselversnipperaarkamer vanaf de ramzijde en sluit u de ramzijde. Voeg vervolgens ongeveer 0,2 tot 0,8 milliliter wasbuffer toe aan de dopzijde van de buis. Gebruik het buisgereedschap om de shredderkamer met de shredderdop goed af te sluiten zonder deze te strak aan te spannen.Plaats de shredderkamer in de shredderhouder met de ramzijde naar beneden voor ingeschakelde montage. Plaats en schakel het bit van de volledig opgeladen shredderdriver in met de shredderdop, zodat het bit goed op zijn plaats wordt vergrendeld en oefen vervolgens druk uit op de shredderdriver in de shredderkamer totdat de drukindicator op de shredderhouder een instelling van ongeveer twee bereikt. Druk op de trekker en laat de shredderdriver ongeveer 10 tot 12 seconden draaien terwijl de instelling op twee blijft staan.Observeer de buis om ervoor te zorgen dat alle of het grootste deel van de weefselmassa door de lysisschijf in de bovenste shredderkamer wordt versnipperd en breng de buis indien nodig terug naar de shredderhouder om door te gaan met versnipperen. Na het versnipperen van het monster tilt u de shredderkamer uit de houdereenheid en gebruikt u het buisgereedschap om de shredderdop te verwijderen en op een schoon oppervlak te plaatsen voor later gebruik dat alleen binnen hetzelfde monster wordt aanbevolen om kruisbesmetting door andere weefselmonsters te voorkomen. Breng het versnipperde hartweefsel met een roerstaaf met 40 milliliter wasbuffer over in het derde bekerglas en roer het weefsel gedurende vijf minuten met een gemiddelde snelheid op de roerplaat.Filter de suspensie door een voorbevochtigd nylon mesh monofilament. Na het weggooien van het filtraat was je het versnipperde weefsel drie keer op het filter met 10 milliliter wasbuffer. Breng het gewassen weefsel over in een bekerglas van 50 milliliter met 20 milliliter wasbuffer in het ijsbad op de magneetroer.Voeg 0,5 milliliter trypsine-oplossing toe terwijl u gedurende 15 minuten constant roert. Ongeveer halverwege het roeren wordt de weefselsuspensie overgebracht in een losjes gemonteerde handheld glas-op-glas homogenisator die 15 milliliter volume kan bevatten. Homogeniseer de suspensie met vier tot vijf zachte slagen zonder schuim te produceren.Plaats vervolgens het homogenaat in een bekerglas van 50 milliliter en meng op een roerplaat. Voeg vervolgens 10 milliliter van de isolatiebuffer met trypsineremmer toe aan het homogenaat en incubeer onder voorzichtig roeren. Na het opnieuw filteren van de suspensie door een nylon filter, slaat u het filter op in een conische buis van 50 milliliter en brengt u de deeltjesfractie die achterblijft op het filter over naar de glas-op-glas homogenisator.Op 15 tot 20 milliliter van de wasbuffer en homogeniseer voorzichtig met de hand gedurende 25 tot 30 seconden. Na het combineren van het homogenaat met het filtraat en het balanceren van de buizen, centrifuge en vervolgens met behulp van een plastic pipet verwijdert u het supernatant waardoor 0,2 milliliter overblijft van de bovenkant van de donzige pellet. Filtreer het resulterende supernatant in een nieuwe conische buis met behulp van een nylon filter om verontreiniging te voorkomen en centrifugeer nog een keer.Na het weggooien van het supernatant wast u de pellet twee tot drie keer door de isolatiebuffer aan de zijkant van de buis toe te voegen om te voorkomen dat de pellet breekt of verontreinigt. Gooi de donzige witte buitenste randlaag elke keer weg. Voeg vijf milliliter van de isolatiebuffer toe aan elke buis en breek de pellet met een pipet met een tip van één milliliter of een nieuwe transferpipet Verdun vervolgens de suspensie met 20 milliliter extra isolatiebuffer en centrifugeer de suspensie bij 8.500 X g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.Na het weggooien van het supernatant resuspendeert u de pellet eerst in vijf milliliter en vervolgens in nog eens 15 milliliter van de resuspendatiebuffer en centrifugeer deze gedurende 15 minuten bij 8.500 X g bij vier graden Celsius. Gooi nu het supernatant weg en bewaar de bruine pellet met gewassen intacte mitochondriën. Resuspend de mitochondriën verrijkte pellet in 250 microliter van de resuspenderende buffer inclusief proteaseremmers.Aliquot de suspensie in 25 microliter volume, snel invriezen in vloeibare stikstof en bewaren in een 80 graden Celsius diepvriezer voor meerdere jaren. Volgens het protocol werd het met mitochondriën verrijkte eiwit bereid uit het hart van nakomelingen geboren uit twee groepen zeugen. De ene werd tijdens de zwangerschap geoefend en de andere was sedentair.Uit de analyse van het ETC-eiwitprofiel bleek dat de nakomelingen van geoefende zeugen relatief lagere niveaus vertoonden in sommige van de ETC-complexen. Mitochondriale eiwitten werden opgelost in een 3 tot 8% gradiënt BN-PAGE en immunoprobed met antilichaamcocktails. Zowel geoefende als sedentaire groepen vertonen meerdere supercomplexen.De prominente supercomplexe toename die werd waargenomen was na negen maanden in de geoefende groep in vergelijking met de sedentaire groep. Mitochondria-verrijkte eiwitten verkregen uit verschillende leeftijdsgroepen van 48 uur drie maanden, zes maanden en negen maanden werden geanalyseerd voor de Complex I-II-activiteit met behulp van een kinetische test. De geoefende groep vertoonde een Complex I-II-activiteit in vergelijking met die van de sedentaire groep.Haalbaarheid van functionele studies op mitochondriën verkregen uit bevroren weefsels en cellen wordt aangetoond door andere onderzoekers. De bereiding van mitochondriën verkregen uit bevroren weefsel kan worden toegepast voor een breed scala aan weefsels met minimale schade.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analyse van supercomplexen van de Mitochondrial Electron Transport Chain met Native Electrophoresis, In-gel Assays, en Electroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyses van mitochondriale Calcium toestroom in geïsoleerde Mitochondria en gekweekte cellen

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Meten lever mitochondriale zuurstofverbruik en Proton lek kinetiek te schatten van mitochondriale ademhaling in Holstein melkvee

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Een modelmembraanplatform voor het reconstrueren van mitochondriale membraandynamica

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Etikettering en visualisatie van Mitochondriale genoomexpressieproducten in Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Beoordeling van mitochondriale functie in heupzenuw door middel van hoge resolutie respirometrie

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...