Name: measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes
Uploaded: 2021-08-16T14:30:00
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Ce travail a été soutenu financièrement par la subvention intra-muros de l’Université de Kansas City pour Abdulbaki Agbas et la bourse de recherche d’été pour Daniel Barrera. Les auteurs sont reconnaissants pour le travail éditorial du Dr Jan Talley.

Les tissus cardiaques congelés de la progéniture ont été reçus du Dr Sean Newcomer avec la lettre d’approbation de l’IACUC de l’établissement. Les tissus cardiaques ont été obtenus à partir d’une étude longitudinale à long terme, congelés dans de l’azote liquide et stockés à -80 °C pour une utilisation future. Tous les protocoles concernant le traitement du tissu cardiaque de la progéniture suivaient les directives des comités IBC et IACUC de l’Université de Kansas City.
<p class="jove_t...

<ol>
	<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).</li><li>Osto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+previously+frozen+biological+samples.">Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples.</a> Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).</li><li>Agbas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transfer+cascade+enzyme+activity+assessment+in+cultured+neurons+and+select+brain+regions.">Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions.</a> Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).</li><li>Hathaway, Q. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+to+quantify+mitochondrial+content+and+intrinsic+bioenergetic+efficiency+across+organs.">Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).</li><li>Hom, J., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+dynamics+of+mitochondria--a+special+emphasis+on+cardiac+muscle+cells.">Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+respiratory+chain+supercomplex+formation+in+response+to+exercise+in+human+skeletal+muscle.">Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle.</a> Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).</li></ol>

Les étapes critiques de ce protocole sont indiquées ici. Tout d’abord, l’homogénéisation des tissus doit être manipulée avec soin afin que des effets excessifs ne soient pas appliqués pendant le processus d’homogénéisation des tissus. Il faut utiliser un broyeur de tissus, qui fait partie de la technologie de cycle de pression (PCT) pour l’homogénéisation initiale des tissus9. Cette étape réduira le cycle excessif d’AVC de l’homogénéisateur verre sur verre (<strong class...

L’objectif de ce protocole était de fournir des étapes détaillées pour obtenir une préparation enrichie en mitochondries à partir de tissus cardiaques précédemment congelés avec une nouvelle technologie de perturbation mécanique à faible énergie des tissus qui améliore la lyse tissulaire et l’extraction des mitochondries. Avec cette méthode, une efficacité d’extraction améliorée sans générer de contrainte de cisaillement élevée ou de température élevée et un temps d’homogénéisation court (10-12 s) deviennent réalisables1.
Obtenir des mitochondries à partir de tissus congelés archivés est un atout précieux pour effectuer des études fonctionnelles2 et biochimiques3 autrement difficilement reproductibles dans les conditions expérimentales exactes. Un homogénéisateur classique en verre de pilon Potter-Elvehjem ou homogénéisateur Dounce a été utilisé et est toujours utilisé dans les laboratoires de recherche pour homogénéiser les tissus mous tels que le foie, les reins et le cerveau. Cependant, l’homogénéisation des tissus durs tels que les muscles et le cœur nécessite plus de temps d’homogénéisation, un traitement enzymatique, une homogénéisation à grande vitesse et une expérience utilisateur étendue. Ceci est désavantageux pour l’extraction d’organites intacts tels que les mitochondries des tissus durs tels que les muscles et le cœur. La méthode décrite dans ce protocole est utilisée pour obtenir une préparation enrichie en mitochondries à haut rendement pour analyser les complexes protéiques de la chaîne de transport d’électrons mitochondriaux (ETC) et leur formation supercomplexe dans les tissus cardiaques prélevés sur une progéniture née à une truie exercée et sédentaire, congelée dans de l’azote liquide et stockée à -80 ° C pour une utilisation future. Cette méthode permet à l’utilisateur d’isoler la préparation enrichie en mitochondries à partir de tissus archivés précédemment congelés.
L’exposition externe aux nanomatériaux aux rongeurs gravides peut affecter négativement la fonction cardiaque, la respiration mitochondriale et la bioénergétique sur la progéniture pendant la gestation4. Néanmoins, les changements positifs induits par l’exercice aérobie dans la bioénergétique des myocytes fœtaux pendant la grossesse n’ont pas encore été documentés. Cependant, de nouvelles études fournissent des preuves que l’exercice aérobique maternel pendant la grossesse a une influence positive sur la fonction cardiaque fœtale5. Afin de fournir des preuves supplémentaires, une analyse des effets longitudinaux de l’exercice maternel sur les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale cardiaque de la progéniture (c.-à-d. du complexe I au complexe V) pendant la grossesse a été effectuée.
Cette étude a une pertinence significative pour la santé puisque les résultats peuvent suggérer que l’exercice maternel améliore l’efficacité de la production d’énergie dans les mitochondries cardiaques de la progéniture. Dans cette étude, les truies (femelles porcines) ont été utilisées comme modèle animal pour deux raisons : (i) la physiologie cardiaque est similaire à celle de l’homme6, et (ii) la récolte de tissus cardiaques sur la progéniture à différents moments est réalisable sous une approbation institutionnelle de l’IACUC. L’étude proposée vise à répondre à de nombreuses questions fondamentales liant l’exercice maternel et ses effets positifs potentiels sur la composition cellulaire et biochimique du tissu cardiaque de la progéniture. Cette approche nécessite des techniques d’isolement des mitochondries douces mais efficaces à partir de tissus cardiaques précédemment congelés obtenus à partir d’études longitudinales longues et coûteuses qui ont abordé les problèmes des changements bioénergétiques dans les myocytes cardiaques fœtaux pendant la grossesse. La méthode décrite dans cette étude permet d’utiliser de grandes quantités de tissus archivés précédemment congelés pour une préparation enrichie en mitochondries pour des études analytiques et fonctionnelles. L’étude aidera également à combler le manque de connaissances dans ce domaine en fournissant des données préliminaires, ce qui pourrait conduire à de futures études déterminant les effets de l’exercice maternel sur la santé cardiaque in utero et au-delà.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino caproic acid</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hu Total OxPhos complex kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>458199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VDAC antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>use 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250</td>
			<td>ThermoSientific</td>
			<td>20279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie GelCode Blue</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>24592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Cabiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-Glass pestle homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885451-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>LC0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native molecular weight marker</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh monofilament</td>
			<td>Small Part Inc</td>
			<td>CMN-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>ThermoScientfic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCT Shredder</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEA BLOCK Blocking buffer</td>
			<td>ThermoScienctific</td>
			<td>37527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shredder PULSE Tube</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td>FT500-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M150-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M191-1G</td>
			<td>Requires fresh preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes

Le profil du complexe de transfert d’électrons mitochondrial (ETC) est modifié dans le tissu cardiaque de la progéniture née d’une truie exerçante. L’hypothèse proposée et testée était qu’un exercice maternel régulier d’une truie pendant la grossesse augmenterait l’efficacité mitochondriale de la bioénergétique cardiaque de la progéniture. Cette hypothèse a été testée en isolant les mitochondries à l’aide d’une procédure d’isolement léger pour évaluer les profils ETC et supercomplexes mitochondriaux. La procédure décrite ici a permis le traitement de tissus cardiaques archivés précédemment congelés et a éliminé la nécessité d’une préparation fraîche des mitochondries pour l’évaluation des complexes ETC mitochondriaux, des supercomplexes et des profils d’activité complexes ETC. Ce protocole décrit la mesure optimale du complexe protéique ETC dans l’immunoblotting multiplexé à base d’anticorps et l’évaluation super complexe à l’aide de l’électrophorèse sur gel bleu-natif.

En suivant le protocole, un bon rendement de mélange de protéines enrichi en mitochondries à partir de tissu cardiaque a été préparé. Environ 15 mg/mL de mélange de protéines enrichies en mitochondries ont été obtenus à partir d’une moyenne de 1,2 g de tissu cardiaque congelé prélevé sur la progéniture de la truie. Les observations ont indiqué que moins de 0,5 g de tissu cardiaque congelé ne produisait pas une quantité suffisante de mélange de protéines enrichies en mitochondries pour effectuer un ...

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Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

La préparation d’échantillons enrichis en mitochondries à partir de tissus solides archivés précédemment congelés a permis aux chercheurs d’effectuer des évaluations fonctionnelles et analytiques des mitochondries dans diverses modalités expérimentales. Cette étude montre comment préparer des préparations enrichies en mitochondries à partir de tissus cardiaques congelés et effectuer des évaluations analytiques des mitochondries.

Mesure des complexes de transfert d’électrons mitochondriaux dans le tissu cardiaque précédemment congelé de la progéniture de la truie: un modèle pour évaluer les changements bioénergétiques mitochondriaux induits par l’exercice

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

Ce protocole est important car il permet aux utilisateurs de préparer des échantillons de mitochondries à partir de tissus congelés prélevés lors d’études antérieures et archivés. Ce protocole réduit également l’utilisation d’animaux vivants pour la récolte des tissus. Cette technique permet aux utilisateurs d’utiliser des tissus d’archives précédemment congelés pour préparer des échantillons enrichis en mitochondries en utilisant une méthode de déchiquetage des tissus en douceur.Cette méthode de préparation maximise le rendement de la préparation des mitochondries. Grâce à la lecture du protocole, il est conseillé de s’assurer de la disponibilité de tous les composants et outils, en particulier le lecteur de broyeur entièrement chargé, et de faire de l’exercice avec certains tissus indésirables pour se familiariser avec les étapes. La démonstration de la procédure sera faite par Edina Kosa, une associée de recherche de mon laboratoire.Pour commencer, notez le poids du tube contenant le tissu cardiaque. Maintenant, pesez le tube vide et soustrayez-le du poids précédemment enregistré pour obtenir un poids net du tissu cardiaque. Mettez le tissu cardiaque congelé directement dans le bécher de la solution glacée.Remuez pendant cinq minutes. Simultanément, à l’aide d’une pince à épiler, appliquez une légère pression sur le tissu pour faire sortir autant de sang que possible. Retirez le mouchoir avec une pince et pressez le cœur avec une serviette en papier filtre propre pour enlever le sang.Ensuite, placez le tissu dans un autre bécher de solution glacée. Après avoir remué le tissu pendant cinq minutes, séchez doucement le mouchoir sur une serviette en papier et retirez la graisse, le sang coagulé, les oreillettes et les fascias. Mettre en commun le tissu ventriculaire.Pour déchiqueter les échantillons de tissus, placez 50 à 300 milligrammes de tissu cardiaque dans la chambre de broyage des tissus du côté du bélier et fermez le côté du bélier. Ajoutez ensuite environ 0,2 à 0,8 millilitre de tampon de lavage du côté du bouchon du tube. Utilisez l’outil à tube pour boucher la chambre de broyage avec le bouchon de broyeur bien serré sans trop le serrer.Placez la chambre de broyage dans l’unité de support du broyeur avec le côté du bélier vers le bas pour un montage engagé. Insérez et engagez le mors du conducteur de broyeur complètement chargé avec le capuchon du broyeur en veillant à ce que le mors soit bien verrouillé en place, puis appliquez une pression sur le conducteur du broyeur dans la chambre de broyage jusqu’à ce que l’indicateur de pression sur le support du broyeur atteigne un réglage d’environ deux. Appuyez sur la gâchette et exécutez le pilote du broyeur pendant environ 10 à 12 secondes tout en maintenant le réglage à deux.Observez le tube pour assurer le déchiquetage et le passage de la totalité ou de la majeure partie de la masse tissulaire à travers le disque de lyse dans la chambre supérieure de broyage et, si nécessaire, retournez le tube dans le porte-broyeur pour continuer le broyage. Après le déchiquetage de l’échantillon, soulevez la chambre de broyage hors de l’unité de support et utilisez l’outil de tube pour retirer le bouchon du broyeur et le placer sur une surface propre pour une utilisation ultérieure recommandée uniquement dans le même échantillon afin d’éviter la contamination croisée d’autres échantillons de tissus. Transférer le tissu cardiaque déchiqueté dans le troisième bécher avec 40 millilitres de tampon de lavage avec une barre d’agitation et remuer le tissu pendant cinq minutes à une vitesse moyenne sur la plaque de remuage.Filtrer la suspension à travers un monofilament en maille de nylon pré-mouillé. Après avoir jeté le filtrat, lavez le tissu déchiqueté sur le filtre trois fois avec 10 millilitres de tampon de lavage. Transférer le tissu lavé dans un bécher de 50 millilitres avec 20 millilitres de tampon de lavage placé dans le bain de glace sur l’agitation magnétique.Ajouter 0,5 millilitre de solution de trypsine en remuant constamment pendant 15 minutes. Environ à mi-chemin de l’agitation, transférez la suspension tissulaire dans un homogénéisateur portatif verre sur verre mal ajusté qui peut contenir 15 millilitres de volume. Homogénéiser la suspension avec quatre à cinq coups doux sans produire de mousse.Ensuite, placez l’homogénat dans un bécher de 50 millilitres et mélangez sur une plaque à remuer. Ensuite, ajoutez 10 millilitres du tampon d’isolement contenant un inhibiteur de la trypsine à l’homogénat et incubez en remuant doucement. Après avoir filtré à nouveau la suspension à travers un filtre en nylon, enregistrez le filtre dans un tube conique de 50 millilitres et transférez la fraction particulaire laissée sur le filtre à l’homogénéisateur verre sur verre.À 15 à 20 millilitres du tampon de lavage et homogénéiser doucement avec la main pendant 25 à 30 secondes. Après avoir combiné l’homogénat avec le filtrat et équilibré les tubes, centrifuger puis utiliser une pipette en plastique retirer le surnageant en laissant 0,2 millilitre du haut de la pastille moelleuse. Filtrer le surnageant résultant dans un nouveau tube conique à l’aide d’un filtre en nylon pour éviter la contamination et centrifuger une fois de plus.Après avoir jeté le surnageant, lavez la pastille deux à trois fois en ajoutant le tampon d’isolation sur le côté du tube pour éviter de casser ou de contaminer la pastille. Jetez la couche de bord extérieur blanc moelleux à chaque fois. Ajouter cinq millilitres de tampon d’isolation à chaque tube et briser la pastille à l’aide d’une pipette avec une pointe d’un millilitre ou une nouvelle pipette de transfert Puis diluer la suspension avec 20 millilitres de tampon d’isolation supplémentaire et centrifuger la suspension à 8 500 X g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Après avoir éliminé le surnageant, remettez en suspension la pastille d’abord dans cinq millilitres, puis dans 15 millilitres supplémentaires du tampon de remise en suspension et de la centrifugeuse à 8 500 X g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Maintenant, jetez le surnageant et conservez la pastille brune contenant des mitochondries intactes lavées. Remettre en suspension la pastille enrichie en mitochondries dans 250 microlitres du tampon de remise en suspension, y compris les inhibiteurs de la protéase.Aliquotez la suspension dans un volume de 25 microlitres, congelez rapidement dans de l’azote liquide et conservez-la dans un congélateur à 80 degrés Celsius pendant plusieurs années. En suivant le protocole, la protéine enrichie en mitochondries a été préparée à partir du cœur de la progéniture née de deux groupes de truies. L’un a été exercé pendant la grossesse et l’autre était sédentaire.L’analyse du profil protéique ETC a révélé que la progéniture des truies exerçantes présentait des niveaux relativement réduits dans certains des complexes ETC. Les protéines mitochondriales ont été résolues dans un gradient BN-PAGE de 3 à 8% et immunoprobed avec des cocktails d’anticorps. Les groupes exercés et sédentaires présentent de multiples supercomplexes.L’augmentation proéminente des supercomplexes observée était de neuf mois dans le groupe exercé par rapport au groupe sédentaire. Des protéines enrichies en mitochondries obtenues à partir de différents groupes d’âge de 48 heures trois mois, six mois et neuf mois ont été analysées pour l’activité du complexe I-II à l’aide d’un test cinétique. Le groupe exercé a montré une activité complexe I-II par rapport à celle du groupe sédentaire.La faisabilité d’études fonctionnelles sur les mitochondries obtenues à partir de tissus et de cellules congelés est démontrée par d’autres chercheurs. La préparation de mitochondries obtenues à partir de tissus congelés peut être appliquée à une grande variété de tissus avec un minimum de dommages.

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