Name: measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes
Uploaded: 2021-08-16T14:30:00
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Diese Arbeit wurde durch das intramurale Stipendium der Kansas City University für Abdulbaki Agbas und das Summer Research Fellowship für Daniel Barrera finanziell unterstützt. Die Autoren sind dankbar für die redaktionelle Arbeit von Dr. Jan Talley.

Gefrorenes Herzgewebe der Nachkommen wurde von Dr. Sean Newcomer zusammen mit dem institutionellen IACUC-Genehmigungsschreiben erhalten. Das Herzgewebe wurde aus einer Langzeit-Längsschnittstudie gewonnen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C für die zukünftige Verwendung gelagert. Alle Protokolle bezüglich der Verarbeitung von Herzgewebe der Nachkommen folgten den Richtlinien der IBC- und IACUC-Komitees der Kansas City University.
1. Herstellung von Puffern und Reagenzien...

<ol>
	<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).</li><li>Osto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+previously+frozen+biological+samples.">Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples.</a> Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).</li><li>Agbas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transfer+cascade+enzyme+activity+assessment+in+cultured+neurons+and+select+brain+regions.">Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions.</a> Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).</li><li>Hathaway, Q. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal-engineered+nanomaterial+exposure+disrupts+progeny+cardiac+function+and+bioenergetics.">Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).</li><li>May, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+maternal+aerobic+exercise+during+pregnancy+on+fetal+cardiac+function+and+outflow.">Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).</li><li>Ehler, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+of+malignant+hyperthermia+in+a+porcine+model+for+experimental+open+heart+surgery.">Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery.</a> Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).</li><li>Panov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bovine+serum+albumin+on+mitochondrial+respiration+in+the+brain+and+liver+of+mice+and+rats.">Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).</li><li>Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+using+blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).</li><li>Pressure Biosciences Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , (2010).</li><li>McLaughlin, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+to+quantify+mitochondrial+content+and+intrinsic+bioenergetic+efficiency+across+organs.">Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).</li><li>Hom, J., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+dynamics+of+mitochondria--a+special+emphasis+on+cardiac+muscle+cells.">Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+respiratory+chain+supercomplex+formation+in+response+to+exercise+in+human+skeletal+muscle.">Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle.</a> Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).</li></ol>

Die kritischen Schritte für dieses Protokoll sind hier angegeben. Erstens sollte die Gewebehomogenisierung sorgfältig gehandhabt werden, damit während des Gewebehomogenisierungsprozesses keine übermäßigen reinen Effekte angewendet werden. Es sollte ein Gewebezerkleinerer verwendet werden, der Teil der Druckzyklustechnologie (PCT) für die anfängliche Gewebehomogenisierung ist9. Dieser Schritt reduziert den übermäßigen Schlaganfallzyklus eines Glas-auf-Glas-Homogenisators (<strong class="...

Das Ziel dieses Protokolls war es, detaillierte Schritte zur Gewinnung eines mit Mitochondrien angereicherten Präparats aus zuvor gefrorenem Herzgewebe mit einer neuen Technologie der niederenergetischen mechanischen Störung von Gewebe bereitzustellen, die die Gewebelyse und die Extraktion von Mitochondrien verbessert. Mit diesem Verfahren wird eine verbesserte Extraktionseffizienz ohne erzeugung hoher Scherspannung oder hoher Temperatur und kurze Homogenisierungszeit (10-12 s) erreicht1.
Mitochondrien aus archiviertem gefrorenem Gewebe zu gewinnen, ist ein wertvolles Gut, um sowohl funktionelle2 als auch biochemische Studien3 durchzuführen, die sonst unter den genauen experimentellen Bedingungen nicht leicht wiederholbar sind. Ein klassischer Potter-Elvehjem Teflon Stößelglas-Homogenisator oder Dounce-Homogenisator wurde verwendet und wird immer noch in Forschungslabors verwendet, um Weichteile wie Leber, Niere und Gehirn zu homogenisieren. Die Homogenisierung von Hartgeweben wie Muskeln und Herz erfordert jedoch mehr Homogenisierungszeit, Enzymbehandlung, Hochgeschwindigkeitshomogenisierung und umfangreiche Benutzererfahrung. Dies ist nachteilig für die Extraktion intakter Organellen wie Mitochondrien aus hartem Gewebe wie Muskel und Herz. Die in diesem Protokoll beschriebene Methode wird verwendet, um ein mit Mitochondrien angereichertes Präparat mit hoher Ausbeute zu erhalten, um mitochondriale Elektronentransportketten (ETC) Proteinkomplexe und ihre superkomplexe Bildung in Herzgeweben zu analysieren, die von Nachkommen geerntet werden, die von trainierten und sitzenden Sauen geboren, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung gelagert werden. Diese Methode ermöglicht es dem Benutzer, mit Mitochondrien angereicherte Zubereitung aus zuvor gefrorenem archiviertem Gewebe zu isolieren.
Externe Nanomaterialexposition gegenüber schwangeren Nagetieren kann die Herzfunktion und die mitochondriale Atmung und Bioenergetik von Nachkommen während der Schwangerschaft negativ beeinflussen4. Dennoch müssen aerobe, durch Bewegung induzierte positive Veränderungen der fetalen Myozyten-Bioenergetik während der Schwangerschaft noch dokumentiert werden. Neuere Studien belegen jedoch, dass mütterliche Aerobic-Übungen während der Schwangerschaft einen positiven Einfluss auf die fetale Herzfunktion haben5. Um weitere Beweise zu liefern, wurde eine Analyse der longitudinalen Auswirkungen von mütterlicher Bewegung auf kardiale mitochondriale Atmungskettenkomplexe der Nachkommen (d.h. Komplex I bis Komplex V) während der Schwangerschaft durchgeführt.
Diese Studie hat eine signifikante gesundheitliche Relevanz, da die Ergebnisse darauf hindeuten könnten, dass mütterliche Bewegung die Effizienz der Energieproduktion in den Herzmitochondrien der Nachkommen verbessert. In dieser Studie wurden Sauen (weibliches Schwein) aus zwei Gründen als Tiermodell verwendet: (i) Die Herzphysiologie ähnelt der des Menschen6 und (ii) die Herzgewebeentnahme von Nachkommen aus verschiedenen Zeitpunkten ist im Rahmen einer institutionellen IACUC-Zulassung möglich. Die vorgeschlagene Studie zielt darauf ab, viele der grundlegenden Fragen zu beantworten, die mütterliche Bewegung und ihre potenziellen positiven Auswirkungen auf die zelluläre und biochemische Zusammensetzung des Herzgewebes der Nachkommen miteinander verbinden. Dieser Ansatz erfordert sanfte, aber effektive Mitochondrien-Isolationstechniken aus zuvor gefrorenem Herzgewebe, die aus den langwierigen und kostspieligen Längsschnittstudien gewonnen wurden, die sich mit den Problemen der bioenergetischen Veränderungen in fetalen Herzmyozyten während der Schwangerschaft befassten. Die in dieser Studie beschriebene Methode ermöglicht es, große Mengen zuvor gefrorenen archivierten Gewebes für die mit Mitochondrien angereicherte Vorbereitung sowohl für analytische als auch für funktionelle Studien zu verwenden. Die Studie wird auch dazu beitragen, die Wissenslücke in diesem Bereich zu schließen, indem sie vorläufige Daten liefert, die zu zukünftigen Studien führen könnten, die die Auswirkungen von mütterlicher Bewegung auf die Herzgesundheit in utero und darüber hinaus bestimmen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino caproic acid</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hu Total OxPhos complex kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>458199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VDAC antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>use 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250</td>
			<td>ThermoSientific</td>
			<td>20279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie GelCode Blue</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>24592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Cabiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-Glass pestle homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885451-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>LC0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native molecular weight marker</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh monofilament</td>
			<td>Small Part Inc</td>
			<td>CMN-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>ThermoScientfic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCT Shredder</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEA BLOCK Blocking buffer</td>
			<td>ThermoScienctific</td>
			<td>37527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shredder PULSE Tube</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td>FT500-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M150-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M191-1G</td>
			<td>Requires fresh preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes

Das mitochondriale Elektronentransferkomplexprofil (ETC) ist im Herzgewebe der Nachkommen, die von einer trainierten Sau geboren wurden, modifiziert. Die Hypothese, die vorgeschlagen und getestet wurde, war, dass eine regelmäßige mütterliche Übung einer Sau während der Schwangerschaft die mitochondriale Effizienz der Herzbioenergetik der Nachkommen erhöhen würde. Diese Hypothese wurde getestet, indem Mitochondrien mit einem milden Isolationsverfahren isoliert wurden, um mitochondriale ETC und superkomplexe Profile zu bewerten. Das hier beschriebene Verfahren ermöglichte die Verarbeitung von zuvor gefrorenem archiviertem Herzgewebe und eliminierte die Notwendigkeit einer frischen Mitochondrienvorbereitung für die Beurteilung von mitochondrialen ETC-Komplexen, Superkomplexen und ETC-Komplex-Aktivitätsprofilen. Dieses Protokoll beschreibt die optimale ETC-Proteinkomplexmessung beim multiplexierten Antikörper-basierten Immunoblotting und der superkomplexen Bewertung mittels Blau-nativer Gelelektrophorese.

Nach dem Protokoll wurde eine gute Ausbeute an mit Mitochondrien angereicherter Proteinmischung aus Herzgewebe hergestellt. Etwa 15 mg/ml mit Mitochondrien angereicherte Proteinmischung wurden aus durchschnittlich 1,2 g gefrorenem Herzgewebe gewonnen, das von den Nachkommen der Sau geerntet wurde. Beobachtungen zeigten, dass weniger als 0,5 g gefrorenes Herzgewebe keine ausreichende Menge an mitochondrial angereicherter Proteinmischung ergaben, um einen BN-PAGE-Assay durchzuführen. Die Menge des mitochondrialen Präpara...

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Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

Die Aufbereitung von mit Mitochondrien angereicherten Proben aus zuvor gefrorenem archiviertem festem Gewebe ermöglichte es den Forschern, sowohl funktionelle als auch analytische Bewertungen von Mitochondrien in verschiedenen experimentellen Modalitäten durchzuführen. Diese Studie zeigt, wie man mit Mitochondrien angereicherte Präparate aus gefrorenem Herzgewebe herstellt und analytische Bewertungen von Mitochondrien durchführt.

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es Benutzern ermöglicht, Mitochondrienproben aus gefrorenem Gewebe vorzubereiten, die aus früheren Studien gesammelt und archiviert wurden. Dieses Protokoll reduziert auch die Verwendung von lebenden Tieren für die Gewebeentnahme. Diese Technik ermöglicht es Benutzern, zuvor gefrorenes Archivgewebe zu verwenden, um mit Mitochondrien angereicherte Proben durch eine sanfte Gewebezerkleinerungsmethode vorzubereiten.Diese Zubereitungsmethode maximiert die Ausbeute der Mitochondrienpräparation. Durch das Lesen des Protokolls ist es ratsam, die Verfügbarkeit aller Komponenten und Werkzeuge, insbesondere des voll aufgeladenen Aktenvernichterantriebs, sicherzustellen und auch mit einigen unerwünschten Taschentüchern zu trainieren, um sich mit den Schritten vertraut zu machen. Das Verfahren wird Edina Kosa, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstrieren.Notieren Sie zunächst das Gewicht der Röhre, die das Herzgewebe enthält. Wiegen Sie nun den leeren Schlauch und subtrahieren Sie ihn vom zuvor aufgezeichneten Gewicht, um ein Nettogewicht des Herzgewebes zu erhalten. Geben Sie das gefrorene Herzgewebe direkt in das Becherglas der eiskalten Lösung.Rühren Sie es für fünf Minuten. Gleichzeitig wird mit einer Pinzette ein leichter Druck auf das Gewebe ausgeübt, um so viel Blut wie möglich herauszuholen. Nehmen Sie das Gewebe mit einer Pinzette heraus und drücken Sie das Herz mit einem sauberen Filterpapiertuch zusammen, um Blut zu entfernen.Dann legen Sie das Gewebe in einen anderen Becher mit eiskalter Lösung. Nachdem Sie das Gewebe fünf Minuten lang umgerührt haben, trocknen Sie das Gewebe vorsichtig auf einem Papiertuch und entfernen Sie das Fett, geronnene Blut, Ohrmuscheln und Faszien. Poolen Sie das ventrikuläre Gewebe.Um die Gewebeproben zu zerkleinern, legen Sie 50 bis 300 Milligramm Herzgewebe von der Widderseite in die Gewebezerkleinerkammer und schließen Sie die Widderseite. Dann etwa 0,2 bis 0,8 Milliliter Waschpuffer auf die Kappenseite des Röhrchens geben. Verwenden Sie das Rohrwerkzeug, um die Shredderkammer mit der Shredderkappe fest zu verschließen, ohne sie zu fest anzuziehen.Legen Sie die Zerkleinererkammer mit der Stößelseite nach unten in die Zerkleinerereinheit, um die Montage zu aktivieren. Setzen Sie das Bit des voll aufgeladenen Aktenvernichterfahrers ein und aktivieren Sie es mit der Zerkleinererkappe, um sicherzustellen, dass das Bit fest eingerastet ist, und üben Sie dann Druck auf den Zerkleinerertreiber in der Zerkleinererkammer aus, bis die Druckanzeige am Aktenvernichterhalter eine Einstellung von ungefähr zwei erreicht. Drücken Sie den Auslöser und lassen Sie den Aktenvernichtertreiber etwa 10 bis 12 Sekunden lang laufen, während Sie die Einstellung bei zwei halten.Beobachten Sie das Röhrchen, um das Zerkleinern sicherzustellen und die gesamte oder den größten Teil der Gewebemasse durch die Lysescheibe in die obere Shredderkammer zu leiten, und geben Sie das Röhrchen gegebenenfalls zum Zerkleinererhalter zurück, um das Zerkleinern fortzusetzen. Heben Sie nach dem Zerkleinern der Probe die Zerkleinerungskammer aus der Haltereinheit heraus und verwenden Sie das Röhrchenwerkzeug, um die Zerkleinererkappe zu entfernen und auf eine saubere Oberfläche für die spätere Verwendung zu legen, die nur innerhalb derselben Probe empfohlen wird, um eine Kreuzkontamination durch andere Gewebeproben zu vermeiden. Das zerkleinerte Herzgewebe mit 40 Millilitern Waschpuffer mit einem Rührstab in das dritte Becherglas geben und das Gewebe fünf Minuten lang mit mittlerer Geschwindigkeit auf der Rührplatte umrühren.Filtern Sie die Suspension durch ein vorbenetztes Nylon-Mesh-Monofilament. Nach dem Entsorgen des Filtrats waschen Sie das zerkleinerte Gewebe auf dem Filter dreimal mit 10 Millilitern Waschpuffer. Das gewaschene Gewebe in ein 50 MilliliterBecherglas mit 20 Milliliter Waschpuffer geben, der im Eisbad auf der Magnetwühlung platziert wird.Fügen Sie 0,5 Milliliter Trypsinlösung hinzu, während Sie 15 Minuten lang ständig umrühren. Etwa nach der Hälfte des Rührens wird die Gewebesuspension in einen locker sitzenden Hand-Glas-auf-Glas-Homogenisator überführt, der 15 Milliliter Volumen aufnehmen kann. Homogenisieren Sie die Suspension mit vier bis fünf sanften Schlägen, ohne Schaum zu erzeugen.Dann das Homogenat in ein 50 Milliliter Becherglas geben und auf einer Rührplatte mischen. Als nächstes werden 10 Milliliter des Trypsinininhibitors enthaltenden Isolationspuffers in das Homogenat gegeben und unter vorsichtigem Rühren inkubiert. Nach dem erneuten Filtern der Suspension durch einen Nylonfilter bewahren Sie den Filter in einem 50 Milliliter konischen Rohr auf und übertragen die auf dem Filter verbleibende Partikelfraktion auf den Glas-auf-Glas-Homogenisator.Bei 15 bis 20 Millilitern des Waschpuffers und vorsichtig mit der Hand für 25 bis 30 Sekunden homogenisieren. Nachdem Sie das Homogenat mit dem Filtrat kombiniert und die Röhrchen ausbalanciert haben, zentrifugieren und dann mit einer Kunststoffpipette den Überstand entfernen und 0,2 Milliliter von der Oberseite des flauschigen Pellets zurücklassen. Filtern Sie den resultierenden Überstand mit einem Nylonfilter in ein neues konisches Rohr, um eine Kontamination zu vermeiden, und zentrifugieren Sie ihn noch einmal.Nach dem Entsorgen des Überstands waschen Sie das Pellet zwei- bis dreimal, indem Sie den Isolationspuffer an der Seite des Rohres hinzufügen, um ein Brechen oder Kontaminieren des Pellets zu verhindern. Verwerfen Sie die flauschige weiße äußere Randschicht jedes Mal. Fügen Sie fünf Milliliter des Isolationspuffers zu jedem Rohr hinzu und brechen Sie das Pellet mit einer Pipette mit einer Ein-Milliliter-Spitze oder einer neuen Transferpipette auf Dann verdünnen Sie die Suspension mit 20 Millilitern zusätzlichem Isolationspuffer und zentrifugieren Sie die Suspension bei 8.500 X g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.Nach dem Verwerfen des Überstandes resuspenieren Sie das Pellet zunächst in fünf Milliliter und dann in weiteren 15 Millilitern des Wiederverwendungspuffers und der Zentrifuge bei 8.500 X g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie nun den Überstand und bewahren Sie das braune Pellet auf, das gewaschene intakte Mitochondrien enthält. Resuspend das mit Mitochondrien angereicherte Pellet in 250 Mikroliter des resuspending Puffers einschließlich Proteasehemmer.Aliquot die Suspension in 25 Mikroliter Volumen, schnell in flüssigem Stickstoff einfrieren und in einem 80 Grad Celsius Tiefkühlschrank für mehrere Jahre lagern. Nach dem Protokoll wurde das mit Mitochondrien angereicherte Protein aus dem Herzen der Nachkommen hergestellt, die von zwei Gruppen von Sauen geboren wurden. Einer wurde während der Schwangerschaft trainiert und der andere war sesshaft.Die ETC-Proteinprofilanalyse ergab, dass die Nachkommen von trainierten Sauen in einigen der ETC-Komplexe relativ reduzierte Werte aufwiesen. Mitochondriale Proteine wurden in einem 3 bis 8%igen Gradienten BN-PAGE aufgelöst und mit Antikörpercocktails immungesondert. Sowohl trainierte als auch sitzende Gruppen weisen mehrere Superkomplexe auf.Der beobachtete prominente Anstieg des Superkomplexes lag in der trainierten Gruppe bei neun Monaten im Vergleich zur sitzenden Gruppe. Mitochondrien angereicherte Proteine, die aus verschiedenen Altersgruppen von 48 Stunden, drei Monaten, sechs Monaten und neun Monaten gewonnen wurden, wurden mit einem kinetischen Assay auf die Complex I-II-Aktivität analysiert. Die trainierte Gruppe zeigte eine komplexe I-II-Aktivität im Vergleich zu der der sitzenden Gruppe.Die Machbarkeit funktioneller Studien an Mitochondrien, die aus gefrorenen Geweben und Zellen gewonnen werden, wird von anderen Forschern gezeigt. Die Herstellung von Mitochondrien, die aus gefrorenem Gewebe gewonnen werden, kann für eine Vielzahl von Geweben mit minimaler Schädigung angewendet werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analysieren von Supercomplexen der mitochondrialen Elektronentransportkette mit Native Elektrophorese, In-Gel-Assays und Elektrolyse

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Optimiertes Protokoll zur Extraktion von Proteinen aus dem menschlichen Mitralventil

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analysen der mitochondrialen Calcium Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Messung der Leber mitochondriale Sauerstoffverbrauch und Proton Leck Kinetik zur Abschätzung der mitochondrialen Atmung in Holstein Milchvieh

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Eine Modellmembranplattform zur Rekonstituierung der mitochondrialen Membrandynamik

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Kennzeichnung und Visualisierung von mitochondrialen Genomexpressionsprodukten in Baker es Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...