Name: measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes
Uploaded: 2021-08-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochon

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי המענק הפנים-ארצי של אוניברסיטת קנזס סיטי עבור עבדולבקי אגבאס ומלגת מחקר קיץ עבור דניאל בררה. המחברים אסירי תודה על עבודת העריכה של ד"ר יאן טאלי.

רקמות לב קפואות התקבלו מד"ר שון ניו-עולה יחד עם מכתב האישור המוסדי של IACUC. רקמות הלב התקבלו ממחקר אורך לטווח ארוך, פלאש קפוא בחנקן נוזלי, ואוחסנו ב -80 °C (80 °F) לשימוש עתידי. כל הפרוטוקולים הנוגעים לעיבוד רקמת לב של צאצאים פעלו בהתאם להנחיות של אוניברסיטת קנזס סיטי IBC וועדות IACUC.
1. ?...

<ol>
	<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).</li><li>Osto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+previously+frozen+biological+samples.">Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples.</a> Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).</li><li>Agbas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transfer+cascade+enzyme+activity+assessment+in+cultured+neurons+and+select+brain+regions.">Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions.</a> Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).</li><li>Hathaway, Q. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal-engineered+nanomaterial+exposure+disrupts+progeny+cardiac+function+and+bioenergetics.">Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).</li><li>May, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+maternal+aerobic+exercise+during+pregnancy+on+fetal+cardiac+function+and+outflow.">Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).</li><li>Ehler, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+of+malignant+hyperthermia+in+a+porcine+model+for+experimental+open+heart+surgery.">Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery.</a> Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).</li><li>Panov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bovine+serum+albumin+on+mitochondrial+respiration+in+the+brain+and+liver+of+mice+and+rats.">Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).</li><li>Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+using+blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).</li><li>Pressure Biosciences Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , (2010).</li><li>McLaughlin, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+to+quantify+mitochondrial+content+and+intrinsic+bioenergetic+efficiency+across+organs.">Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).</li><li>Hom, J., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+dynamics+of+mitochondria--a+special+emphasis+on+cardiac+muscle+cells.">Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+respiratory+chain+supercomplex+formation+in+response+to+exercise+in+human+skeletal+muscle.">Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle.</a> Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).</li></ol>

השלבים הקריטיים עבור פרוטוקול זה מצוינים כאן. ראשית, הומוגניזציה רקמות צריך להיות מטופל בקפידה, כך השפעות מוחלטות לא ייושמו במהלך תהליך הומוגניזציה רקמות. יש להשתמש במגרסת רקמות, המהווה חלק מטכנולוגיית רכיבה על אופניים בלחץ (PCT) להומוגניזציה ראשונית של רקמות9. צעד זה יפחית את ?...

מטרת פרוטוקול זה הייתה לספק צעדים מפורטים כדי להשיג הכנה מועשרת במיטוכונדריה מרקמת לב קפואה בעבר עם טכנולוגיה חדשה של הפרעה מכנית באנרגיה נמוכה של רקמות המשפרת תמה רקמה ומיצוי של מיטוכונדריה. בשיטה זו, יעילות מיצוי משופרת מבלי ליצור מתח גיסת גבוה או טמפרטורה גבוהה וזמן הומוגניזציה קצר (10-12 s) הופכים בר השגה1.
כדי להשיג מיטוכונדריה מרקמה קפואה בארכיון הוא נכס בעל ערך לביצוע הן מחקרים פונקציונליים2 והן ביוכימיים3 אחרת לא ניתן לחזור בקלות בתנאי הניסוי המדויקים. נעשה שימוש בהומוגניזר זכוכית קדר-אלווהג'ם טפלון קלאסי או הומוגניזר דונסה ועדיין נמצא בשימוש במעבדות מחקר להומוגניזציה של רקמות רכות כגון כבד, כליות ומוח. עם זאת, הומוגניזציה של רקמות קשות כגון שריר ולב דורשת יותר זמן הומוגניזציה, טיפול באנזים, הומוגניזציה במהירות גבוהה וחוויית משתמש נרחבת. זה חסרון לחילוץ אברונים שלמים כגון מיטוכונדריה מרקמה קשה כגון שריר ולב. השיטה המתוארת בפרוטוקול זה משמשת להשגת הכנה מועשרת במיטוכונדריה בתפוקה גבוהה לניתוח מתחמי חלבון של שרשרת הובלת אלקטרונים מיטוכונדריאליים (ETC) ויצירת מחשב העל שלהם ברקמות הלב שנקצרו צאצאים שנולדו לזרועה מאומתנת בישיבה, קפואה בחנקן נוזלי, ומאוחסנת ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. שיטה זו מאפשרת למשתמש לבודד את ההכנה המועשרת במיטוכונדריה מרקמות ארכיון שהוקפאו בעבר.
חשיפה ננו-חומרית חיצונית מכרסמים בהריון יכולה להשפיע לרעה על תפקוד הלב ועל הנשימה המיטוכונדריאלית ועל הביו-אנרגטיקה על צאצאים במהלך ההריון4. עם זאת, שינויים חיוביים הנגרמים על ידי פעילות אירובית ביו-אנרגטית מיוציטית עוברית במהלך ההריון טרם תועדו. עם זאת, מחקרים מתעוררים מספקים ראיות כי פעילות אירובית אימהית במהלך ההריון יש השפעה חיובית על תפקוד הלב העובר5. על מנת לספק ראיות נוספות, בוצע ניתוח ההשפעות האורך של פעילות גופנית אימהית על מתחמי שרשרת הנשימה המיטוכונדריאליים של הצאצאים (כלומר, קומפלקס I באמצעות Complex V) במהלך ההריון.
מחקר זה יש רלוונטיות בריאותית משמעותית מאז התוצאות עשויות להציע כי פעילות גופנית אימהית משפרת את היעילות של ייצור אנרגיה במיטוכונדריה הלבבית של הצאצאים. במחקר זה, חזירות (חזירה נקבה) שימשו כמודל לבעלי חיים משתי סיבות: (i) פיזיולוגיה לבבית דומה לאדם6, ו -(ii) קציר רקמת לב צאצאים מנקודות זמן שונות אפשרי תחת אישור IACUC מוסדי. המחקר המוצע נועד לענות על רבות מהשאלות הבסיסיות המקשרות בין פעילות אימהית לבין השפעותיה החיוביות הפוטנציאליות על ההרכב התאי והביוכימי של רקמת הלב של הצאצא. גישה זו דורשת טכניקות בידוד מיטוכונדריה עדינות אך יעילות מרקמת לב קפואה בעבר שהתקבלו ממחקרי אורך ארוכים ויקרים שהתייחסו לבעיות השינויים הביו-אנרגטיים בתוך מיוציטים לב עובריים במהלך ההריון. השיטה המתוארת במחקר זה מאפשרת ניצול סכומים גדולים של רקמה ארכיונית שהוקפאה בעבר להכנת מיטוכונדריה מועשרת הן במחקרים אנליטיים והן במחקרים פונקציונליים. המחקר גם יסייע למלא את פער הידע בתחום זה על ידי מתן נתונים ראשוניים, אשר יכול להוביל מחקרים עתידיים הקובעים את ההשפעות של פעילות גופנית אימהית על בריאות הלב ברחם ומעבר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino caproic acid</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hu Total OxPhos complex kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>458199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VDAC antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>use 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250</td>
			<td>ThermoSientific</td>
			<td>20279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie GelCode Blue</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>24592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Cabiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-Glass pestle homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885451-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>LC0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native molecular weight marker</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh monofilament</td>
			<td>Small Part Inc</td>
			<td>CMN-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>ThermoScientfic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCT Shredder</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEA BLOCK Blocking buffer</td>
			<td>ThermoScienctific</td>
			<td>37527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shredder PULSE Tube</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td>FT500-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M150-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M191-1G</td>
			<td>Requires fresh preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes

פרופיל קומפלקס העברת האלקטרונים המיטוכונדריאלי (ETC) משתנה ברקמת הלב של הצאצא שנולד לזרועה מאומתנת. ההשערה שהוצעה ונבדקה הייתה שתרגיל אימהי קבוע של זריעה במהלך ההריון יגביר את היעילות המיטוכונדריאלית של ביו-אנרגטיקה של לב צאצאים. השערה זו נבדקה על ידי בידוד המיטוכונדריה באמצעות הליך בידוד מתון להערכת פרופילים מיטוכונדריאלי ETC וסופר-קומפלקס. ההליך המתואר כאן אפשר עיבוד של רקמות לב שהוקפאו בעבר בארכיון וביטל את הצורך בהכנת מיטוכונדריה טרייה להערכת מתחמי מיטוכונדריאלי ETC, מחשבי על ופרופילי פעילות מורכבים ETC. פרוטוקול זה מתאר את המדידה האופטימלית של קומפלקס חלבון ETC בחיסון מבוסס נוגדנים מרובי מולטיפלקסים והערכה סופר מורכבת באמצעות אלקטרופורזה ג'ל כחול-ילידי.

בעקבות הפרוטוקול, תשואה טובה של תערובת חלבון מועשר מיטוכונדריה מרקמת הלב הוכן. כ-15 מ"ג/מ"ל של תערובת חלבונים מועשרים במיטוכונדריה התקבלו מ-1.2 גרם רקמת לב קפואה בממוצע שנקצרה מצאצאי השזרה. תצפיות הצביעו על כך שפחות מ-0.5 גרם של רקמת לב קפואה לא הניבו כמות מספקת של תערובת חלבונים מועשרת במיטוכו?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochon

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

הכנת דגימות מועשרות במיטוכונדריה מרקמות מוצקות שהוקפאו בעבר בארכיון אפשרה לחוקרים לבצע הערכות פונקציונליות ואנליטיות של המיטוכונדריה במודלים ניסיוניים שונים. מחקר זה מדגים כיצד להכין תכשירים מועשרים במיטוכונדריה מרקמת לב קפואה ולבצע הערכות אנליטיות של המיטוכונדריה.

מדידת מתחמי העברת אלקטרונים מיטוכונדריאליים ברקמת לב קפואה בעבר מצאצאי החזירה: מודל להערכת שינויים ביו-אנרגטית מיטוכונדריאליים הנגרמים על ידי פעילות גופנית

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זה מאפשר למשתמשים להכין דגימות מיטוכונדריה מרקמות קפואות שנאספו ממחקרים קודמים בארכיון. פרוטוקול זה גם מפחית את השימוש בבעלי חיים לקציר רקמות. טכניקה זו מאפשרת למשתמשים להשתמש ברקמות ארכיון שהוקפאו בעבר כדי להכין דגימות מועשרות במיטוכונדריה על ידי שימוש בשיטת גריסת רקמות עדינה.שיטה זו של הכנה ממקסמת את התשואה של הכנת המיטוכונדריה. באמצעות קריאת הפרוטוקול מומלץ להבטיח את הזמינות של כל הרכיבים והכלים במיוחד את כונן מגרסה טעון במלואו וגם לממש עם כמה רקמות לא רצויות כדי להכיר את השלבים. מדגימה את ההליך תהיה אדינה Kosa, עמית מחקר מהמעבדה שלי.ראשית, להקליט את המשקל של הצינור המכיל את רקמת הלב. עכשיו לשקול את הצינור הריק ולהחסיר אותו מהמשקל שנרשם בעבר כדי לקבל משקל נטו של רקמת הלב. שים את רקמת הלב הקפואה ישירות לתוך של תמיסה קרה כקרח.מערבבים אותו במשך חמש דקות. בו זמנית באמצעות פינצטה להחיל לחץ קל על הרקמה כדי לצאת דם רב ככל האפשר. מוציאים את הרקמה עם מלקחיים וסוחטים את הלב עם מגבת נייר סינון נקייה כדי להסיר דם.ואז למקם את הרקמה לתוך אחרת של פתרון קר כקרח. לאחר ערבוב הרקמה במשך חמש דקות, לייבש בעדינות את הרקמה על מגבת נייר ולהסיר את השומן, דם קרישה, auricles ו fasciae. תאחדו את רקמת החדר.כדי לגרוס את דגימות הרקמה, מניחים 50 עד 300 מיליגרם של רקמת לב לתוך תא מגרסת הרקמות מצד האייל וסוגרים את צד האיל. לאחר מכן להוסיף על 0.2 כדי 0.8 מיליליטר של חוצץ כביסה לצד הכובע של הצינור. השתמש בכלי הצינור כדי לכסות את תא המגרסה עם מכסה המגרסה בצורה נוחה מבלי להדק אותו יתר על המידה.מניחים את תא המגרסה לתוך יחידת מחזיק המגרסה עם צד האיל כלפי מטה להתאמה מעורבת. הכנס ועסוק את החלק של נהג המגרסה הטעון במלואו עם מכסה המגרסה המבטיח את הסיבית נעולה בצורה נוחה למקומו ואז להפעיל לחץ כלפי מטה על נהג מגרסה בתא מגרסה עד מחוון הלחץ על מחזיק המגרסה מגיע להגדרה של כשנים בקירוב. לחץ על ההדק והפעל את מנהל ההתקן של המגרסה במשך כ-10 עד 12 שניות תוך שמירה על ההגדרה בשתיים.שים לב לצינור כדי להבטיח גריסה והעברת כל או רוב מסת הרקמה דרך דיסק תמיסת לתוך תא המגרסה העליונה ובמידת הצורך להחזיר את הצינור למחזיק המגרסה כדי להמשיך לגרוס. לאחר גריסת הדגימה להרים את תא המגרסה מתוך יחידת המחזיק ולהשתמש בכלי הצינור כדי להסיר את מכסה המגרסה ולהניח אותו על משטח נקי לשימוש מאוחר יותר מומלץ רק בתוך אותה מדגם כדי למנוע זיהום צולב מדגימות רקמה אחרות. מעבירים את רקמת הלב הגרוסה לתוך הכיס השלישי עם 40 מיליליטר של חוצץ כביסה עם מוט ערבוב וערבבו את הרקמה במשך חמש דקות במהירות בינונית בזמן על צלחת ערבוב.סנן את המתלים באמצעות מונפילמנט רשת ניילון רטוב מראש. לאחר השלכת הסינון לשטוף את הרקמה מגוררת על המסנן שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של חוצץ כביסה. מעבירים את הרקמה השטופה לתוך 50 מיליליטר עם 20 מיליליטר של חוצץ כביסה להציב באמבט הקרח על מערבוב מגנטי.מוסיפים 0.5 מיליליטר של פתרון טריפסין תוך ערבוב מתמיד במשך 15 דקות. בערך באמצע ערבוב להעביר את ההשעיה רקמה לתוך homogenizer זכוכית על זכוכית מצויד באופן רופף שיכול להכיל 15 מיליליטר של נפח. הומוגניזציה ההשעיה עם ארבע עד חמש משיכות עדינות מבלי לייצר קצף.לאחר מכן, מניחים את homogenate לתוך כף 50 מיליליטר ומערבבים על צלחת ערבוב. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של חוצץ בידוד המכיל מעכב טריפסין הומוגני ודגורה תוך ערבוב עדין. לאחר סינון המתלה שוב באמצעות מסנן ניילון לשמור את המסנן בצינור חרוטי 50 מיליליטר ולהעביר את שבר החלקיקים שנותר על המסנן הומוגניזר זכוכית על זכוכית.ב 15 עד 20 מיליליטר של חוצץ הכביסה בעדינות הומוגני עם היד במשך 25 עד 30 שניות. לאחר שילוב הומוגנט עם סינון ואיזון הצינורות, צנטריפוגה ולאחר מכן באמצעות pipette פלסטיק להסיר את supernatant משאיר 0.2 מיליליטרים מראש הכדור רך. סנן את supernatant וכתוצאה מכך לתוך צינור חרוט חדש באמצעות מסנן ניילון כדי למנוע זיהום צנטריפוגה פעם נוספת.לאחר השלכת supernatant לשטוף את הכדור פעמיים עד שלוש פעמים על ידי הוספת חוצץ בידוד לצד הצינור כדי למנוע שבירה או זיהום של הכדור. יש להשליך את שכבת השוליים החיצונית הלבנה הרכה בכל פעם. הוסף חמישה מיליליטר של חוצץ הבידוד לכל צינור ולשבור את הכדור באמצעות pipette עם קצה מיליליטר אחד או pipette העברה חדש ואז לדלל את המתלה עם 20 מיליליטר של חוצץ בידוד נוסף צנטריפוגה המתלה ב 8, 500 X g במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר השלכת supernatant respend הכדור הראשון בחמישה מיליליטר ולאחר מכן ב 15 מיליליטר נוסף של חוצץ resuspending וצנטריפוגה ב 8, 500 X g במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. עכשיו להשליך את supernatant ולשמור את הכדור החום המכיל מיטוכונדריה שלמה שטף. resuspend הכדור המועשר המיטוכונדריה ב 250 microliters של חוצץ resuspending כולל מעכבי פרוטאז.Aliquot המתלים בנפח 25 מיקרוליטרים, הקפאה מהירה בחנקן נוזלי ולאחסן במקפיא עמוק 80 מעלות צלזיוס במשך כמה שנים. בעקבות הפרוטוקול החלבון המועשר במיטוכונדריה הוכן מלב הצאצאים שנולדו לשתי קבוצות של זריעה. אחד מהם אומת במהלך ההריון והשני היה בישיבה.ניתוח פרופיל חלבון ETC גילה כי צאצאי זריעה מאומנים הציגו רמות מופחתות יחסית בחלק מתחמי ETC. חלבונים מיטוכונדריאליים נפתרו ב-BN-PAGE הדרגתי של 3 עד 8% ואימונופרו עם קוקטיילים נוגדנים. הן קבוצות פעילות גופנית והן קבוצות בישיבה מציגות מחשבי-על מרובים.העלייה הבולטת של מחשבי העל שנצפתה הייתה בתשעה חודשים בקבוצה המתורגלת בהשוואה לקבוצה בישיבה. חלבונים מועשרים במיטוכונדריה שהתקבלו מקבוצות גיל שונות של 48 שעות שלושה חודשים, שישה חודשים ותשעה חודשים נותחו עבור פעילות I-II המורכבת באמצעות מטען קינטי. הקבוצה המתורגלת הראתה פעילות I-II מורכבת בהשוואה לפעילות של הקבוצה בישיבה.היתכנות של מחקרים פונקציונליים על המיטוכונדריה המתקבלת מרקמות ותאים קפואים מוצגת על ידי חוקרים אחרים. הכנת המיטוכונדריה המתקבלת מרקמה קפואה עשויה להיות מיושמת על מגוון רחב של רקמות עם נזק מינימלי.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

ניתוח Supercomplexes של Mitochondrial אלקטרונים שרשרת התחבורה עם אלקטרופורזה הילידים, ב-מבחני ג&#39;ל, ו Electroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

פרוטוקול אופטימיזציה עבור הפקת חלבונים מן שסתום מיטרלי האדם

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

מדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי הכבד ואת פרוטון הדליפה קינטיקה להעריך נשימה מיטוכונדריאלי ב בקר לחלב הולשטיין

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

פלטפורמת ממברנה לדוגמה לשיכור דינמיקת קרום מיטוכונדריאלי

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצב הסיאטי על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...