Name: measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes
Uploaded: 2021-08-16T14:30:00
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この研究は、カンザスシティ大学のアブドゥルバキ・アグバスに対する壁内助成金とダニエル・バレラの夏の研究フェローシップによって財政的に支援されました。著者たちはヤン・タリー博士の編集作業に感謝しています。

凍結した子孫の心臓組織は、機関IACUC承認書と共にショーン・ニューカマー博士から受け取られました。心臓組織は、長期の縦断的研究から得られ、液体窒素中でフラッシュ凍結し、将来の使用のために−80°Cで保存した。子孫の心臓組織の処理に関するすべてのプロトコルは、カンザスシティ大学IBCとIACUC委員会のガイドラインに従いました。
1. バッファーおよび試薬の?...

<ol>
	<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).</li><li>Osto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+previously+frozen+biological+samples.">Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples.</a> Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).</li><li>Agbas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transfer+cascade+enzyme+activity+assessment+in+cultured+neurons+and+select+brain+regions.">Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions.</a> Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).</li><li>Hathaway, Q. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+to+quantify+mitochondrial+content+and+intrinsic+bioenergetic+efficiency+across+organs.">Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).</li><li>Hom, J., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+dynamics+of+mitochondria--a+special+emphasis+on+cardiac+muscle+cells.">Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+respiratory+chain+supercomplex+formation+in+response+to+exercise+in+human+skeletal+muscle.">Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle.</a> Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).</li></ol>

このプロトコルの重要な手順をここに示します。まず、組織均質化プロセス中に過剰な効果が適用されないように、組織均質化を慎重に行う必要があります。初期組織均質化のための圧力サイクリング技術(PCT)の一部であるティッシュシュレッダーを使用する必要があります9。このステップは、凍結組織状態のために既に脆弱なミトコンドリアをさらに破壊する可能性のあ?...

このプロトコルの目的は、以前に凍結した心臓組織からミトコンドリア濃縮製剤を得るための詳細なステップを提供し、組織のリシスとミトコンドリアの抽出を改善する組織の低エネルギー機械的破壊の新技術を提供することであった。この方法により、高い剪断応力や高温と短い均質化時間(10-12s)を発生させることなく抽出効率が向上する1。
アーカイブされた凍結組織からミトコンドリアを得ることは、機能的2 および生化学的研究の両方を行う貴重な資産である3 それ以外の場合は、正確な実験条件下で容易に再現できない。古典的なポッター・エルフェイェム・テフロン・ペスルガラスホモジナイザーまたはDounceホモジナイザーが使用されており、肝臓、腎臓、脳などの軟部組織を均質化するために研究ラボで使用されています。しかし、筋肉や心臓などの硬い組織を均質化するには、より均質化時間、酵素処理、高速均質化、および広範なユーザー体験が必要です。これは、筋肉や心臓などの硬い組織からミトコンドリアなどの無傷のオルガネラを抽出する場合には不利です。本プロトコルに記載されている方法は、ミトコンドリア電子輸送鎖(ETC)タンパク質複合体およびそれらの超錯体形成を、生まれた子孫から採取した心臓組織中の超錯体形成を分析するための高収量ミトコンドリア濃縮製剤を得るために使用され、運動および座りっぱなしの種まき、液体窒素中でフラッシュ凍結、および-80°Cで保存され、将来の使用のために保存される。この方法により、ユーザは、以前に凍結されたアーカイブ組織からミトコンドリア濃縮製剤を分離することができる。
妊娠中のげっ歯類への外部ナノ材料暴露は、妊娠4の間に心機能およびミトコンドリア呼吸および生物エネルギーに悪影響を及ぼす可能性がある。それにもかかわらず、妊娠中の胎児筋細胞生物エネルギーの有酸素運動誘発陽性変化はまだ文書化されていない。しかし、新たな研究は、妊娠中の母親の有酸素運動が胎児の心機能にプラスの影響を与える証拠を提供する5。さらなる証拠を提供するために、妊娠中の母体運動が胎児の心臓ミトコンドリア呼吸鎖複合体(すなわち、コンプレックスIからコンプレックスV)に及ぼす縦方向の影響の分析が行われた。
この研究は、母親の運動が子孫の心臓ミトコンドリアにおけるエネルギー産生の効率を向上させる可能性があるため、健康に有意な関連性を有する。本研究では、雌豚(雌豚)は、(i)心臓生理学はヒト6に類似しており、(ii)異なる時点から子孫からの心臓組織収穫が制度的なIACUC承認の下で実現可能である2つの理由で動物モデルとして使用された。提案された研究は、母親の運動とその潜在的な肯定的な効果が子孫の心臓組織の細胞および生化学的構成に及ぼす基本的な質問の多くを答えることを目的としています。このアプローチは、妊娠中の胎児心筋細胞内の生体エネルギー変化の問題に対処した長く高価な縦断研究から得られた以前に凍結した心臓組織からの穏やかで効果的なミトコンドリア分離技術を必要とする。本研究で説明された方法は、分析および機能研究の両方のためのミトコンドリア濃縮調製物のために、以前に凍結されたアーカイブされた組織の大量を利用することを可能にする。この研究はまた、予備的なデータを提供することによって、この分野の知識のギャップを埋めるのに役立ち、子宮内およびそれ以降の心臓の健康に対する母親の運動の影響を決定する将来の研究につながる可能性がある。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino caproic acid</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hu Total OxPhos complex kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>458199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VDAC antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>use 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250</td>
			<td>ThermoSientific</td>
			<td>20279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie GelCode Blue</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>24592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Cabiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-Glass pestle homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885451-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>LC0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native molecular weight marker</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh monofilament</td>
			<td>Small Part Inc</td>
			<td>CMN-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>ThermoScientfic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCT Shredder</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEA BLOCK Blocking buffer</td>
			<td>ThermoScienctific</td>
			<td>37527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shredder PULSE Tube</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td>FT500-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M150-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M191-1G</td>
			<td>Requires fresh preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes

ミトコンドリア電子移動複合体(ETC)プロファイルは、運動した種まきに生まれた子孫の心臓組織で修飾され、提案され、テストされた仮説は、妊娠中の種まきの定期的な母親の運動は、子孫の心臓の生体エネルギーのミトコンドリア効率を増加させるだろうという仮説でした。この仮説は、ミトコンドリアETCおよび超複合体プロファイルを評価するための軽度の分離手順を用いてミトコンドリアを単離することによって試験された。ここで説明した手順は、以前に凍結されたアーカイブされた心臓組織の処理を可能にし、ミトコンドリアETC複合体、超複合体、およびETC複合体の評価のための新鮮なミトコンドリア調製の必要性を排除した。このプロトコルは、青色天然ゲル電気泳動を用いた多重化抗体ベースの免疫ブロット法および超複合評価における最適なETCタンパク質複合体測定について説明する。

プロトコルに従って、心臓組織からのミトコンドリア濃縮タンパク質混合物の良好な収量を調製した。約15mg/mLのミトコンドリア濃縮タンパク質混合物は、種まきの子孫から採取された平均1.2gの凍結心臓組織から得られた。観察は、0.5g未満の凍結した心臓組織がBN-PAGEアッセイを行うのに十分な量のミトコンドリア濃縮タンパク質混合物を生じさせなかったことを示した。ミトコンドリア製剤...

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Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

以前に凍結したアーカイブされた固体組織からのミトコンドリア濃縮サンプルを調製し、研究者は様々な実験モダリティでミトコンドリアの機能的および分析的評価を行うことを可能にした。この研究は、凍結した心臓組織からミトコンドリア濃縮製剤を調製し、ミトコンドリアの分析評価を行う方法を示す。

ソウの子孫から以前に凍結した心臓組織におけるミトコンドリア電子伝達複合体の測定:運動誘発ミトコンドリアバイオエネルギーの変化を評価するモデル

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

このプロトコルは、ユーザーが以前の研究から収集し、アーカイブ凍結組織からミトコンドリアサンプルを調製することができるので、重要です.このプロトコルはまた、組織の収穫のための生きている動物の使用を減らす。この技術はユーザーが穏やかなティッシュの細断方法を採用することによってミトコンドリア濃縮サンプルを準備するために以前凍結されたアーカイブ組織を使用することを可能にする。この調製方法は、ミトコンドリア製剤の収量を最大化する。プロトコルの読み取りによって、すべてのコンポーネントとツール、特に完全に充電されたシュレッダードライブの可用性を確保し、また、手順に慣れるためにいくつかの不要な組織で練習することをお勧めします。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の研究員であるEdina Kosaです。まず、心臓組織を含む管の重量を記録する。空のチューブの重量を量り、以前に記録された重量から減算して、心臓組織の正味重量を得る。凍結した心臓組織を氷冷溶液のビーカーに直接入れます。5分間かき混ぜます。同時にピンセットを使用すると、できるだけ多くの血液を取り出すために組織にわずかな圧力を加えます。鉗子で組織を取り出し、血液を除去するためにきれいなフィルターペーパータオルで心臓を絞ります。その後、氷冷溶液の別のビーカーに組織を置きます。5分間組織をかき混ぜた後、ペーパータオルで組織を軽く乾かし、脂肪、凝固した血液、耳障り、筋膜を取り除きます。心室組織をプールします。組織サンプルを細断するには、50〜300ミリグラムの心臓組織をラム側から組織シュレッダーチャンバーに入れ、ラム側を閉じる。その後、チューブのキャップ側に約0.2〜0.8ミリリットルの洗浄バッファーを加えます。チューブツールを使用して、シュレッダーキャップを締め付けることなくぴったりとシュレッダーチャンバーをキャップします。シュレッダーチャンバーを、取り付けフィッティングのためにラム側を下にしてシュレッダーホルダーユニットに置きます。完全に充電されたシュレッダードライバーのビットをシュレッダーキャップに挿入して係合し、ビットがぴったりと所定の位置にロックされていることを確認し、シュレッダーホルダーの圧力インジケータが約2の設定に達するまでシュレッダーチャンバーのシュレッダードライバーに圧力を加えます。トリガーを押して、2で設定を維持しながら、シュレッダードライバを約10〜12秒間実行します。チューブを観察して、ライシスディスクを通して組織質量の全部または大部分を上部シュレッダーチャンバーに通過させ、必要に応じてチューブをシュレッダーホルダーに戻して細断を続けます。サンプルを細断した後、ホルダーユニットからシュレッダーチャンバーを持ち上げ、チューブツールを使用してシュレッダーキャップを取り外し、後で同じサンプル内でのみ使用することをお勧めしてクリーンな表面に置き、他の組織サンプルからのクロス汚染を避けてください。細断された心臓組織を3番目のビーカーに3番目のビーカーに移し、40ミリリットルの洗浄バッファーを攪拌バーで回し、攪拌プレート上で中速で5分間組織をかき混ぜる。あらかじめ濡れたナイロンメッシュモノフィラメントを通して懸濁液をフィルター処理します。濾液を廃棄した後、10ミリリットルの洗浄バッファーでフィルター上の細断された組織を3回洗浄する。洗浄した組織を50ミリリットルのビーカーに移し、20ミリリットルの洗浄バッファーを磁気攪拌機の氷浴に入れます。常に15分間攪拌しながら、トリプシン溶液の0.5ミリリットルを追加します。攪拌の途中で、組織の懸濁液を15ミリリットルの体積を保持できる緩やかに取り付けられたハンドヘルドガラスホモジナイザーに移します。泡を生成せずに4〜5緩やかなストロークでサスペンションを均質化します。その後、ホモジュネートを50ミリリットルのビーカーに入れ、攪拌板の上で混ぜます。次に、トリプシン阻害剤を含む分離バッファーを10ミリリットルをホモジネートに加え、穏やかに攪拌しながらインキュベートする。ナイロンフィルターを通して再び懸濁液を濾過した後、50ミリリットルの円錐管にフィルターを保存し、ガラスオンガラスホモジナイザーにフィルタに残された微粒子分を転送します。15~20ミリリットルの洗浄バッファーで、手で25~30秒間穏やかに均質化します。ホモジュネートと濾液を組み合わせてチューブのバランスを取った後、遠心分離機を使用し、プラスチックピペットを使用して、ふわふわペレットの上部から0.2ミリリットルの上清を除去します。ナイロンフィルターを使用して、新しい円錐形チューブに得られた上澄み物をフィルター処理し、汚染と遠心分離をもう一度避けます。上清を捨て、ペレットを破ったり汚染するのを防ぐために、チューブの側面に分離バッファーを加えてペレットを2〜3回洗浄します。ふわふわした白い外縁層を毎回捨てます。各チューブに5ミリリットルの分離バッファーを加え、1ミリリットルのチップまたは新しいトランスファーピペットを使用してペレットを分割し、20ミリリットルの追加分離バッファーで懸濁液を希釈し、懸濁液を摂氏4度で15分間15分間遠心分離します。上清を廃棄した後、ペレットを最初に5ミリリットルで再懸濁し、次に再懸濁バッファーと遠心分離機の15ミリリットルを8、500 X gで摂氏4度で15分間再懸濁させた。上清を捨てて、洗ったミトコンドリアを含む茶色のペレットを保存します。ミトコンドリア濃縮ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含む再懸濁バッファーの250マイクロリットルで再懸濁する。アリコート25マイクロリットルの容量の懸濁液、液体窒素での迅速な凍結および数年間の摂氏80度の深い冷凍庫に貯蔵する。プロトコルに従ってミトコンドリア濃縮タンパク質は、雌豚の2つのグループに生まれた子孫の心臓部から調製された。一人は妊娠中に運動され、もう一人は座っていた。ETCタンパク質プロファイル分析は、運動雌豚の子孫がいくつかのETC複合体で比較的減少したレベルを提示することを明らかにした。ミトコンドリアタンパク質を3~8%のグラジェントBN-PAGEで分解し、抗体カクテルで免疫プローブした。運動グループと座りっぱなし群の両方が複数の超複合体を示す。観察された顕著な超複合体の増加は、座りっぱなし群と比較して、運動群で9ヶ月であった。キネティックアッセイを用いて、48時間3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月の異なる年齢層から得られたミトコンドリア濃縮タンパク質を、複雑なI-II活性について分析した。運動したグループは、座りっぱなし群と比較して複雑なI-II活性を示した。凍結組織および細胞から得られたミトコンドリアに関する機能研究の実現可能性は、他の研究者によって示されている。凍結組織から得られたミトコンドリアの調製は、損傷を最小限に抑えて多種多様な組織に適用され得る。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

ネイティブ電気泳動、インゲルアッセイおよび電気溶出を用いたミトコンドリア電子輸送鎖のスーパーコンプレックスの解析

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

ヒト僧帽弁からのタンパク質抽出のための最適化プロトコル

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

ミトコンドリアの分離と培養細胞におけるミトコンドリアのカルシウム流入の解析

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

ショウジョウバエのティッシュの最小限の量を使用してのグリセリンの繊維でミトコンドリアの酸素消費量の測定

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

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ホルスタイン種乳牛におけるミトコンドリア呼吸を推定する肝ミトコンドリアの酸素消費量とプロトン リーク動態測定

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Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

ミトコンドリア膜動態を再構成するためのモデル膜プラットフォーム

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

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ベーカー酵母サッカロミセス・セレビシエにおけるミトコンドリアゲノム発現産物の表示と可視化

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高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...