Name: measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes
Uploaded: 2021-08-16T14:30:00
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Este trabalho foi apoiado financeiramente pela bolsa intramuros da Universidade de Kansas City para Abdulbaki Agbas e Summer Research Fellowship para Daniel Barrera. Os autores agradecem pelo trabalho editorial do Dr. Jan Talley.

Os tecidos cardíacos da prole congelada foram recebidos do Dr. Sean Newcomer juntamente com a carta de aprovação institucional da IACUC. Os tecidos cardíacos foram obtidos a partir de um estudo longitudinal de longo prazo, congelados em nitrogênio líquido, e armazenados a -80 °C para uso futuro. Todos os protocolos relativos ao processamento de tecido cardíaco da prole seguiram as diretrizes dos comitês da Universidade de Kansas City IBC e da IACUC.
1. Preparação de tampões e reagent...

<ol>
	<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).</li><li>Osto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+previously+frozen+biological+samples.">Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples.</a> Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).</li><li>Agbas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transfer+cascade+enzyme+activity+assessment+in+cultured+neurons+and+select+brain+regions.">Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions.</a> Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).</li><li>Hathaway, Q. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+of+malignant+hyperthermia+in+a+porcine+model+for+experimental+open+heart+surgery.">Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery.</a> Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).</li><li>Panov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bovine+serum+albumin+on+mitochondrial+respiration+in+the+brain+and+liver+of+mice+and+rats.">Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).</li><li>Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+using+blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).</li><li>Pressure Biosciences Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , (2010).</li><li>McLaughlin, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+to+quantify+mitochondrial+content+and+intrinsic+bioenergetic+efficiency+across+organs.">Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).</li><li>Hom, J., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+dynamics+of+mitochondria--a+special+emphasis+on+cardiac+muscle+cells.">Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+respiratory+chain+supercomplex+formation+in+response+to+exercise+in+human+skeletal+muscle.">Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle.</a> Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).</li></ol>

Os passos críticos para este protocolo estão indicados aqui. Em primeiro lugar, a homogeneização do tecido deve ser cuidadosamente tratada para que efeitos excessivos não sejam aplicados durante o processo de homogeneização do tecido. Deve-se utilizar um triturador de tecidos, que faz parte da tecnologia de ciclismo de pressão (PCT) para homogeneização inicial do tecido9. Esta etapa reduzirá o ciclo excessivo de avc do homogeneizador de vidro em vidro (Figura 1B</st...

O objetivo deste protocolo foi fornecer passos detalhados para obter a preparação enriquecida com mitocôndrias a partir de tecido cardíaco previamente congelado com uma nova tecnologia de interrupção mecânica de baixa energia do tecido que melhora a lise tecidual e a extração de mitocôndrias. Com este método, a melhoria da eficiência extração sem gerar alto estresse de tesoura ou alta temperatura e curto tempo de homogeneização (10-12 s) tornam-se alcançáveis1.
Obter mitocôndrias a partir de tecido congelado arquivado é um ativo valioso para realizar estudos funcionais2 e bioquímicos3, caso contrário, não facilmente repetível sob as condições experimentais exatas. Um clássico homogeneizador de vidro de pilão Potter-Elvehjem Teflon ou homogeneizador de dounce tem sido usado e ainda está sendo usado em laboratórios de pesquisa para homogeneizar tecidos moles como fígado, rim e cérebro. No entanto, homogeneizar tecidos duros como músculo e coração requer mais tempo de homogeneização, tratamento enzimático, homogeneização de alta velocidade e ampla experiência do usuário. Isso é desvantajoso para extrair organelas intactas, como mitocôndrias de tecido duro, como músculo e coração. O método descrito neste protocolo é usado para obter uma preparação enriquecida com mitocôndrias de alto rendimento para analisar complexos proteicos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) e sua formação supercomplexa em tecidos cardíacos colhidos de descendentes nascidos a porcas exercitadas e sedentárias, congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 °C para uso futuro. Este método permite que o usuário isole a preparação enriquecida de mitocôndrias de tecidos arquivados previamente congelados.
A exposição nanomaterial externa a roedores gestantes pode afetar negativamente a função cardíaca e a respiração mitocondrial e bioenergésicos na prole durante a gestação4. No entanto, as alterações positivas induzidas pelo exercício aeróbico nos bioenergésicos do miócito fetal durante a gravidez ainda não foram documentadas. No entanto, estudos emergentes fornecem evidências de que o exercício aeróbico materno durante a gravidez tem uma influência positiva na função cardíaca fetal5. Para fornecer mais evidências, foi realizada uma análise dos efeitos longitudinais do exercício materno nos complexos da cadeia respiratória mitocondrial cardíaca (ou seja, Complexo I através do Complexo V) durante a gravidez.
Este estudo tem relevância significativa para a saúde, uma vez que os resultados podem sugerir que o exercício materno melhora a eficiência da produção de energia nas mitocôndrias cardíacas da prole. Neste estudo, as porcas (porcas fêmeas) foram utilizadas como modelo animal por duas razões: (i) a fisiologia cardíaca é semelhante à humana6, e (ii) a colheita de tecido cardíaco de descendentes de diferentes pontos de tempo é viável sob aprovação institucional da IACUC. O estudo proposto tem como objetivo responder a muitas das questões fundamentais que ligam o exercício materno e seus potenciais efeitos positivos na composição celular e bioquímica do tecido cardíaco da prole. Esta abordagem requer técnicas suaves, mas eficazes de isolamento de mitocôndrias de tecido cardíaco previamente congelado obtido a partir dos longos e caros estudos longitudinais que abordaram as questões das alterações bioenergésticas dentro dos miócitos cardíacos fetais durante a gravidez. O método descrito neste estudo permite utilizar grandes somas de tecido arquivado previamente congelado para preparação enriquecida com mitocôndrias para estudos analíticos e funcionais. O estudo também ajudará a preencher a lacuna de conhecimento nesse campo, fornecendo dados preliminares, o que poderia levar a estudos futuros determinando os efeitos do exercício materno sobre a saúde do coração no útero e além.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino caproic acid</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hu Total OxPhos complex kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>458199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VDAC antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>use 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250</td>
			<td>ThermoSientific</td>
			<td>20279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie GelCode Blue</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>24592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Cabiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-Glass pestle homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885451-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>LC0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native molecular weight marker</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh monofilament</td>
			<td>Small Part Inc</td>
			<td>CMN-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>ThermoScientfic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCT Shredder</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEA BLOCK Blocking buffer</td>
			<td>ThermoScienctific</td>
			<td>37527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shredder PULSE Tube</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td>FT500-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M150-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M191-1G</td>
			<td>Requires fresh preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes

O perfil do complexo de transferência de elétrons mitocondrial (ETC) é modificado no tecido cardíaco da prole nascido em uma porca exercida. A hipótese proposta e testada foi que um exercício materno regular de uma porca durante a gravidez aumentaria a eficiência mitocondrial da bioenergetic do coração da prole. Essa hipótese foi testada por mitocôndrias isolando utilizando um procedimento de isolamento leve para avaliar perfis mitocondriais etc e supercomplexo. O procedimento aqui descrito permitiu o processamento de tecidos cardíacos arquivados previamente congelados e eliminou a necessidade de preparação de mitocôndrias frescas para a avaliação de complexos etc mitocondrial, supercomplexos e perfis de atividades complexas etc. Este protocolo descreve a medição ideal do complexo proteico ETC em imunoblotting baseado em anticorpos multiplexados e avaliação super complexa usando eletroforese de gel azul-nativa.

Seguindo o protocolo, foi preparado um bom rendimento da mistura de proteína enriquecida com mitocôndrias a partir do tecido cardíaco. Aproximadamente 15 mg/mL de mistura de proteína enriquecida com mitocôndrias foram obtidos a partir de uma média de 1,2 g de tecido cardíaco congelado colhido da prole da porca. Observações indicaram que menos de 0,5 g de tecido cardíaco congelado não produziu uma quantidade suficiente de mistura de proteína enriquecida mitocondrial para realizar um ensaio BN-PAGE. A quantidad...

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Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

A preparação de amostras enriquecidas com mitocôndrias de tecidos sólidos arquivados previamente congelados permitiu que os pesquisadores realizassem avaliações funcionais e analíticas de mitocôndrias em várias modalidades experimentais. Este estudo demonstra como preparar preparações enriquecidas com mitocôndrias a partir de tecido cardíaco congelado e realizar avaliações analíticas de mitocôndrias.

Medindo complexos de transferência de elétrons mitocondrial em tecido cardíaco previamente congelado da prole da porca: um modelo para avaliar alterações bioenergetics mitocondrial induzidas pelo exercício

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

Este protocolo é significativo porque permite que os usuários preparem amostras de mitocôndrias de tecidos congelados coletados de estudos anteriores e arquivados. Este protocolo também reduz o uso de animais vivos para a colheita de tecidos. Esta técnica permite que os usuários usem tecidos de arquivo previamente congelados para preparar amostras enriquecidas com mitocôndrias, empregando um método de trituração de tecido suave.Este método de preparação maximiza o rendimento da preparação das mitocôndrias. Através da leitura do protocolo é aconselhável garantir a disponibilidade de todos os componentes e ferramentas, especialmente a unidade de triturador totalmente carregada e também exercitar-se com alguns tecidos indesejados para se familiarizar com as etapas. Demonstrando o procedimento será Edina Kosa, uma pesquisadora associada do meu laboratório.Para começar, regisse o peso do tubo contendo o tecido cardíaco. Agora pese o tubo vazio e subtraia-o do peso previamente registrado para obter um peso líquido do tecido cardíaco. Coloque o tecido cardíaco congelado diretamente no béquer da solução gelada.Mexa por cinco minutos. Simultaneamente, o uso de pinças aplica uma leve pressão no tecido para sair o máximo de sangue possível. Retire o tecido com fórceps e aperte o coração com uma toalha de papel filtro limpa para remover o sangue.Em seguida, coloque o tecido em outro béquer de solução gelada. Depois de mexer o tecido por cinco minutos, seque suavemente o tecido em uma toalha de papel e remova a gordura, o sangue coagulado, as aurículas e a fáscia. Laça o tecido ventricular.Para triturar as amostras de tecido, coloque de 50 a 300 miligramas de tecido cardíaco na câmara de triturador de tecido do lado do carneiro e feche o lado da carneiro. Em seguida, adicione cerca de 0,2 a 0,8 mililitros de tampão de lavagem ao lado da tampa do tubo. Use a ferramenta do tubo para tampar a câmara de triturador com a tampa do triturador sem apertá-la.Coloque a câmara de triturador na unidade do suporte do triturador com o lado do carneiro para baixo para a encaixe. Insira e engaje o pouco do condutor de triturador totalmente carregado com a tampa do triturador, garantindo que a broca esteja presa no lugar e, em seguida, aplique pressão para baixo no condutor de triturador na câmara de triturador até que o indicador de pressão no suporte do triturador atinja uma configuração de aproximadamente dois. Pressione o gatilho e execute o condutor do triturador por cerca de 10 a 12 segundos, mantendo a configuração em dois.Observe o tubo para garantir a trituração e a passagem de toda ou a maior parte da massa tecidual através do disco de lise na câmara superior do triturador e, se necessário, devolva o tubo ao suporte do triturador para continuar triturando. Depois de triturar a amostra, retire a câmara de triturador da unidade do suporte e use a ferramenta do tubo para remover a tampa do triturador e colocá-la em uma superfície limpa para uso posterior recomendado apenas dentro da mesma amostra para evitar contaminação cruzada de outras amostras de tecido. Transfira o tecido cardíaco desfiado para o terceiro béquer com 40 mililitros de tampão de lavagem com uma barra de agitação e mexa o tecido por cinco minutos a uma velocidade média enquanto estiver na placa de mexida.Filtre a suspensão através de um monofilamento de malha de nylon pré-molhado. Depois de descartar o filtro, lave o tecido desfiado no filtro três vezes com 10 mililitros de tampão de lavagem. Transfira o tecido lavado em um béquer de 50 mililitros com 20 mililitros de tampão de lavagem colocados no banho de gelo na agitação magnética.Adicione 0,5 mililitro da solução trypsin enquanto mexe constantemente por 15 minutos. Aproximadamente na metade da agitação transfira a suspensão do tecido para um homogeneizador de vidro em vidro portátil que possa conter 15 mililitros de volume. Homogeneize a suspensão com quatro a cinco golpes suaves sem produzir espuma.Em seguida, coloque o homogeneizar em um béquer de 50 mililitros e misture em uma placa de agitação. Em seguida, adicione 10 mililitros do tampão de isolamento contendo inibidor de trypsina ao homogeneizar e incubar enquanto mexe suavemente. Depois de filtrar a suspensão novamente através de um filtro de nylon, salve o filtro em um tubo cônico de 50 mililitros e transfira a fração de partículas deixada no filtro para o homogeneizador de vidro em vidro.Em 15 a 20 mililitros do tampão de lavagem e homogeneize suavemente com a mão por 25 a 30 segundos. Depois de combinar o homogeneizar com o filtrado e equilibrar os tubos, centrífuga e, em seguida, usar uma pipeta de plástico remover o supernatante deixando 0,2 mililitros do topo da pelota macia. Filtre o supernatante resultante em um novo tubo cônico usando um filtro de nylon para evitar contaminação e centrífuga mais uma vez.Depois de descartar a lavagem supernasal da pelota duas a três vezes adicionando o tampão de isolamento ao lado do tubo para evitar quebrar ou contaminar a pelota. Descarte a camada de aro exterior branca fofa cada vez. Adicione cinco mililitros do tampão de isolamento a cada tubo e quebre a pelota usando uma pipeta com uma ponta de um mililitro ou uma nova pipeta de transferência Em seguida, dilua a suspensão com 20 mililitros de tampão de isolamento adicional e centrifugar a suspensão a 8,500 X g por 15 minutos a quatro graus Celsius.Depois de descartar o supernascimento da pelota primeiro em cinco mililitros e, em seguida, em um adicional de 15 mililitros do tampão de resus pendente e centrífuga a 8.500 X g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Agora descarte o supernatante e salve a pelota marrom contendo mitocôndrias intactas lavadas. Resuspend a mitocôndria enriqueceu a pelota em 250 microliters do buffer de resuspending, incluindo inibidores de protease.Aliquot a suspensão em 25 microliters volume, congelamento rápido em nitrogênio líquido e armazenar em um congelador profundo de 80 graus Celsius por vários anos. Seguindo o protocolo, a proteína enriquecida com mitocôndrias foi preparada a partir do coração da prole nascida a dois grupos de porcas. Um foi exercitado durante a gravidez e o outro foi sedentário.A análise do perfil de proteína etc revelou que a prole de porcas exercitadas apresentava níveis relativamente reduzidos em alguns dos complexos etc. As proteínas mitocondriais foram resolvidas em um BN-PAGE de 3 a 8% gradiente e imunoprobed com coquetéis de anticorpos. Ambos os grupos exercidos e sedentárias exibem múltiplos supercomplexos.O proeminente aumento do supercomplexo observado foi de nove meses no grupo exercido em comparação com o grupo sedentário. Proteínas enriquecidas com mitocôndrias obtidas de diferentes faixas etárias de 48 horas, três meses, seis meses e nove meses foram analisadas para a atividade complexa I-II utilizando um ensaio cinético. O grupo exercido apresentou atividade complexa I-II em relação à do grupo sedentário.A viabilidade de estudos funcionais sobre mitocôndrias obtidas a partir de tecidos e células congeladas é demonstrada por outros pesquisadores. A preparação de mitocôndrias obtidas a partir de tecido congelado pode ser aplicada para uma grande variedade de tecidos com dano mínimo.

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