Name: measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes
Uploaded: 2021-08-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochon

Bu çalışma, Kansas City Üniversitesi'nin Abdulbaki Agbas için intramural hibesi ve Daniel Barrera için Yaz Araştırma Bursu ile finansal olarak desteklendi. Yazarlar Dr. Jan Talley'nin editörlük çalışmaları için minnettarlar.

Dondurulmuş yavru kalp dokuları, kurumsal IACUC onay mektubu ile birlikte Dr. Sean Newcomer'dan alındı. Kalp dokuları uzun süreli uzunlamasına bir çalışmadan elde edildi, sıvı nitrojende flaş donduruldu ve ileride kullanılmak üzere -80 °C'de depolandı. Yavru kalp dokusunun işlenmesiyle ilgili tüm protokoller Kansas City Üniversitesi IBC ve IACUC komitelerinin yönergelerine uydu.
1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması
NOT: Tüm numuneleri ?...

<ol>
	<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).</li><li>Osto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+respiration+in+previously+frozen+biological+samples.">Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples.</a> Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).</li><li>Agbas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transfer+cascade+enzyme+activity+assessment+in+cultured+neurons+and+select+brain+regions.">Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions.</a> Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).</li><li>Hathaway, Q. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal-engineered+nanomaterial+exposure+disrupts+progeny+cardiac+function+and+bioenergetics.">Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).</li><li>May, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+maternal+aerobic+exercise+during+pregnancy+on+fetal+cardiac+function+and+outflow.">Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).</li><li>Ehler, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+of+malignant+hyperthermia+in+a+porcine+model+for+experimental+open+heart+surgery.">Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery.</a> Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).</li><li>Panov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bovine+serum+albumin+on+mitochondrial+respiration+in+the+brain+and+liver+of+mice+and+rats.">Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).</li><li>Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+using+blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).</li><li>Pressure Biosciences Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , (2010).</li><li>McLaughlin, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+to+quantify+mitochondrial+content+and+intrinsic+bioenergetic+efficiency+across+organs.">Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).</li><li>Hom, J., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+dynamics+of+mitochondria--a+special+emphasis+on+cardiac+muscle+cells.">Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+respiratory+chain+supercomplex+formation+in+response+to+exercise+in+human+skeletal+muscle.">Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle.</a> Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).</li></ol>

Bu protokol için kritik adımlar burada belirtilmiştir. İlk olarak, doku homojenizasyonu işlemi sırasında aşırı saf etkilerin uygulanmaması için doku homojenizasyonu dikkatlice ele alınmalıdır. İlk doku homojenizasyonu için basınç döngüsü teknolojisinin (PCT) bir parçası olan bir doku parçalayıcı kullanılmalıdır9. Bu adım, donmuş doku koşulları nedeniyle zaten kırılgan olan mitokondrileri daha da tahrip edebilecek cam üzerine cam homojenizatörün (<strong class...

Bu protokolün amacı, doku lizizini ve mitokondri ekstraksiyonunu iyileştiren düşük enerjili dokuların düşük enerjili mekanik bozulması teknolojisi ile daha önce dondurulmuş kalp dokusundan mitokondri ile zenginleştirilmiş preparat elde etmek için ayrıntılı adımlar sağlamaktı. Bu yöntemle, yüksek kesme stresi veya yüksek sıcaklık ve kısa homojenizasyon süresi (10-12 s) üretmeden ekstraksiyon verimliliğinin artırılması ulaşılabilir hale gelir1.
Arşivlenmiş donmuş dokudan mitokondri elde etmek, hem fonksiyonel2 hem de biyokimyasal çalışmaları gerçekleştirmek için değerli bir varlıktır3 aksi takdirde tam deneysel koşullar altında kolayca tekrarlanamaz. Klasik bir Potter-Elvehjem Teflon pestle cam homojenizatörü veya Dounce homojenizatörü kullanılmıştır ve hala karaciğer, böbrek ve beyin gibi yumuşak dokuları homojenize etmek için araştırma laboratuvarlarında kullanılmaktadır. Bununla birlikte, kas ve kalp gibi homojenizasyon sert dokuları daha fazla homojenizasyon süresi, enzim tedavisi, yüksek hızlı homojenizasyon ve kapsamlı kullanıcı deneyimi gerektirir. Bu, mitokondri gibi bozulmamış organelleri kas ve kalp gibi sert dokulardan çıkarmak için dezavantajlıdır. Bu protokolde açıklanan yöntem, mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC) protein komplekslerini ve bunların egzersiz ve sedanter ekime doğan yavrulardan hasat edilen, sıvı nitrojende flash dondurulan ve gelecekteki kullanım için -80 °C'de depolanan kalp dokularındaki süperkompleks oluşumunu analiz etmek için yüksek verimli mitokondri bakımından zenginleştirilmiş preparat elde etmek için kullanılır. Bu yöntem, kullanıcının daha önce dondurulmuş arşivlenmiş dokulardan mitokondri zenginleştirilmiş preparatını izole etmesini sağlar.
Hamile kemirgenlere dış nanomalzeme maruziyeti, gebelik sırasında kalp fonksiyonunu ve mitokondriyal solunumu ve biyoenergetikleri olumsuz yönde etkileyebilir4. Bununla birlikte, gebelikte fetal miyosit biyoenergetiklerinde aerobik egzersize bağlı olumlu değişiklikler henüz belgelenmiştir. Bununla birlikte, ortaya çıkan çalışmalar, hamilelik sırasında anne aerobik egzersizin fetal kardiyak fonksiyon üzerinde olumlu bir etkisi olduğuna dair kanıtlar samaktadır5. Daha fazla kanıt sağlamak için, gebelik sırasında anne egzersizinin yavru kardiyak mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri (yani Kompleks I'den Kompleks V'ye) üzerindeki uzunlamasına etkilerinin analizi yapıldı.
Sonuçlar, anne egzersizinin yavruların kardiyak mitokondrilerinde enerji üretiminin verimliliğini artırdığını düşündürebileceğinden, bu çalışmanın sağlıkla önemli bir ilgisi vardır. Bu çalışmada, ekmekler (dişi domuz) iki nedenden dolayı hayvan modeli olarak kullanılmıştır: (i) kardiyak fizyoloji insan6'ya benzer ve (ii) farklı zaman noktalarından yavrulardan kalp dokusu hasadı kurumsal bir IACUC onayı altında mümkündür. Önerilen çalışma, anne egzersizini ve yavruların kalp dokusunun hücresel ve biyokimyasal makyajı üzerindeki potansiyel olumlu etkilerini bağlayan temel soruların çoğunu yanıtlamayı amaçlamaktadır. Bu yaklaşım, gebelik sırasında fetal kardiyak miyositler içindeki biyoenergetik değişikliklerin sorunlarını ele alan uzun ve maliyetli boyuna çalışmalardan elde edilen daha önce dondurulmuş kardiyak dokudan nazik ama etkili mitokondri izolasyon teknikleri gerektirir. Bu çalışmada açıklanan yöntem, hem analitik hem de fonksiyonel çalışmalar için mitokondri ile zenginleştirilmiş hazırlık için daha önce dondurulmuş arşivlenmiş dokunun büyük miktarda kullanılmasını sağlar. Çalışma ayrıca, anne egzersizinin rahim ve ötesinde kalp sağlığı üzerindeki etkilerini belirleyen gelecekteki çalışmalara yol açabilecek ön veriler sağlayarak bu alandaki bilgi boşluğunun doldurulmasına yardımcı olacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino caproic acid</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hu Total OxPhos complex kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>458199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VDAC antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab15895</td>
			<td>use 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250</td>
			<td>ThermoSientific</td>
			<td>20279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie GelCode Blue</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>24592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Cabiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-Glass pestle homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885451-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>LC0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native molecular weight marker</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh monofilament</td>
			<td>Small Part Inc</td>
			<td>CMN-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>ThermoScientfic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCT Shredder</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEA BLOCK Blocking buffer</td>
			<td>ThermoScienctific</td>
			<td>37527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shredder PULSE Tube</td>
			<td>Pressure Bioscience Inc</td>
			<td>FT500-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M150-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M191-1G</td>
			<td>Requires fresh preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial electron transfer complexes in previously frozen cardiac tissue from the offspring of sow: a model to assess exercise-induced mitochondrial bioenergetics changes

Mitokondriyal elektron transfer kompleksi (ETC) profili, egzersiz yapılan bir ekimden doğan yavruların kalp dokusunda modifiye edilir. Önerilen ve test edilen hipotez, hamilelik sırasında bir ekimin düzenli bir anne egzersizinin yavru kalp biyoenergetiklerinin mitokondriyal verimliliğini artıracağıydı. Bu hipotez, mitokondriyal ETC ve süperkompleks profillerini değerlendirmek için hafif izolasyon prosedürü kullanılarak mitokondri izole edilmesiyle test edildi. Burada açıklanan prosedür, daha önce dondurulmuş arşivlenmiş kalp dokularının işlenmesine izin verdi ve mitokondriyal ETC komplekslerinin, süperkomplekslerin ve ETC karmaşık aktivite profillerinin değerlendirilmesi için taze mitokondri hazırlığının gerekliliğini ortadan kaldırdı. Bu protokol, çok katlı antikor bazlı immünoblojlamada optimal ETC protein kompleksi ölçümünü ve mavi-yerli jel elektroforezi kullanılarak süper karmaşık değerlendirmeyi açıklar.

Protokolün ardından kalp dokusundan mitokondri ile zenginleştirilmiş iyi bir protein karışımı verimi hazırlandı. Ekimin yavrularından hasat edilen ortalama 1,2 g dondurulmuş kalp dokusundan yaklaşık 15 mg/mL mitokondri ile zenginleştirilmiş protein karışımı elde edildi. Gözlemler, 0,5 g'dan az dondurulmuş kalp dokusunun BN-PAGE testini gerçekleştirmek için yeterli miktarda mitokondriyal zenginleştirilmiş protein karışımı vermediğini gösterdi. Mitokondriyal hazırlık miktarı,(i) bireysel...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochon

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

Daha önce dondurulmuş arşivlenmiş katı dokulardan mitokondri ile zenginleştirilmiş örneklerin hazırlanması, araştırmacıların çeşitli deneysel yöntemlerde mitokondrilerin hem fonksiyonel hem de analitik değerlendirmelerini yapmalarına izin verdi. Bu çalışma, donmuş kalp dokusundan mitokondri ile zenginleştirilmiş preparatların nasıl hazırlanacağını ve mitokondrilerin analitik değerlendirmelerinin nasıl yapıldığını göstermektedir.

Daha Önce Dondurulmuş Kardiyak Dokudaki Mitokondriyal Elektron Transfer Komplekslerinin Sow'un Yavrularından Ölçülmesi: Egzersize Bağlı Mitokondriyal Biyoenergetik Değişikliklerini Değerlendirmek için Bir Model

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

Bu protokol önemlidir, çünkü kullanıcıların önceki çalışmalardan toplanan ve arşivlenen donmuş dokulardan mitokondri örnekleri hazırlamalarına izin verir. Bu protokol aynı zamanda doku hasadı için canlı hayvan kullanımını da azaltır. Bu teknik, kullanıcıların yumuşak bir doku parçalama yöntemi kullanarak mitokondri zenginleştirilmiş örnekler hazırlamak için daha önce dondurulmuş arşiv dokularını kullanmalarını sağlar.Bu hazırlık yöntemi mitokondri preparatının verimini en üst düzeye çıkarır. Protokolün okunması yoluyla, tüm bileşenlerin ve araçların, özellikle de tam yüklü öğütücü sürücüsünün kullanılabilirliğini sağlamak ve ayrıca adımlara aşina olmak için bazı istenmeyen dokularla egzersiz yapmak tavsiye edilir. Prosedürü gösteren edina Kosa, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi.Başlangıç olarak, kalp dokusunu içeren tüpün ağırlığını kaydedin. Şimdi boş tüpü tartın ve kalp dokusunun net ağırlığını elde etmek için daha önce kaydedilmiş ağırlıktan çıkarın. Donmuş kalp dokusunu doğrudan buz gibi çözeltinin kabına koyun.Beş dakika karıştırın. Aynı anda cımbız kullanarak dokuya mümkün olduğunca fazla kan almak için hafif bir basınç uygulayın. Dokuyu tokalarla çıkarın ve kanı çıkarmak için kalbi temiz bir filtre kağıt havlu ile sıkın.Daha sonra dokuyu başka bir buz gibi çözelti kabına yerleştirin. Dokuyu beş dakika karıştırdıktan sonra, dokuyu bir kağıt havlu üzerinde hafifçe kurulayın ve yağ, pıhtılaşmış kan, kulak kepçesi ve fasyayı çıkarın. Ventrikül dokusunu bire birle.Doku örneklerini parçalamak için, 50 ila 300 miligram kalp dokusunu koç tarafından doku parçalayıcı odasına yerleştirin ve koç tarafını kapatın. Daha sonra tüpün kapak tarafına yaklaşık 0,2 ila 0,8 mililitre yıkama tamponu ekleyin. Shredder odasını fazla sıkmadan shredder kapağıyla sıkıca kaplamak için tüp aracını kullanın.Öğütücü haznesini, devreye girmek için koç tarafı aşağı olacak şekilde öğütücü tutucu ünitesine yerleştirin. Tam yüklü öğütücü sürücüsünün bitini öğütücü kapağıyla takın ve ucun yerine sıkıca kilitlenmesini sağlayın, ardından öğütücü tutucusundaki basınç göstergesi yaklaşık iki ayara ulaşana kadar öğütücü odasındaki öğütücü sürücüsüne basınç uygulayın. Tetiğe basın ve ayarı ikide tutarken öğütücü sürücüsünü yaklaşık 10 ila 12 saniye çalıştırın.Doku kütlesinin tamamının veya çoğunun lizis diskinden üst parçalayıcı odasına parçalanıp geçirilmesini sağlamak için tüpü gözlemleyin ve gerekirse parçalamaya devam etmek için tüpü parçalayıcı tutucuya geri verin. Numuneyi parçaladıktan sonra öğütücü haznesini tutucu ünitesinden kaldırın ve diğer doku örneklerinden çapraz bulaşmayı önlemek için daha sonra sadece aynı numunede önerilen temiz bir yüzeye yerleştirmek için boru aracını kullanın. Parçalanmış kalp dokusunu bir karıştırma çubuğu ile 40 mililitre yıkama tamponu ile üçüncü kabın içine aktarın ve karıştırma plakasındayken orta hızda beş dakika boyunca dokuyu karıştırın.Süspansiyonu önceden ıslanmış bir naylon ağ monofilamenti ile filtreleyin. Filtratı attıktan sonra, filtredeki parçalanmış dokuyu 10 mililitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Yıkanmış dokuyu, manyetik karıştırma üzerine buz banyosuna yerleştirilen 20 mililitre yıkama tamponu ile 50 mililitrelik bir kabın içine aktarın.15 dakika boyunca sürekli karıştırırken 0,5 mililitre tripsin çözeltisi ekleyin. Karıştırmanın yaklaşık yarısında doku süspansiyonu, 15 mililitre hacim tutabilen gevşek bir şekilde monte edilmiş el camı cam üzerinde homojenizatöre aktarın. Köpüğü üretmeden süspansiyonu dört ila beş hafif vuruşla homojenize edin.Daha sonra homojenatı 50 mililitrelik bir kabın içine yerleştirin ve karıştırma plakasına karıştırın. Daha sonra, homojenasyona tripsin inhibitörü içeren izolasyon tamponunun 10 mililitresini ekleyin ve hafifçe karıştırırken kuluçkaya yatırın. Süspansiyonu tekrar naylon filtreden geçirdikten sonra filtreyi 50 mililitrelik konik bir tüpe kaydedin ve filtrede kalan partikül fraksiyonunu cam üzerindeki homojenizatöre aktarın.Yıkama tamponunun 15 ila 20 mililitresinde ve elle 25 ila 30 saniye boyunca hafifçe homojenize edin. Homojenatı filtratla birleştirdikten ve tüpleri denge ettikten sonra, santrifüj ve daha sonra plastik bir pipet kullandıktan sonra, kabarık peletin üstünden 0,2 mililitre bırakarak süpernatantı çıkarın. Kirlenmeyi önlemek ve bir kez daha santrifüj yapmak için naylon filtre kullanarak elde ettiği süpernatantı yeni bir konik tüpe filtreleyin.Süpernatant attıktan sonra, peletin kırılmasını veya kirlenmesini önlemek için izolasyon tamponu tüpün yanına ekleyerek peleti iki ila üç kez yıkayın. Kabarık beyaz dış jant tabakasını her seferinde atın. Her tüpe beş mililitre izolasyon tamponu ekleyin ve bir mililitre uçlu veya yeni bir transfer pipeti içeren bir pipet kullanarak peleti parçalayın, ardından süspansiyonu 20 mililitre ek izolasyon tamponu ile seyreltin ve süspansiyonu dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 8, 500 X g'da santrifüjleyin.Süpernatantı attıktan sonra peletı önce beş mililitreye, daha sonra 8, 500 X g'da 15 mililitrelik ek bir 15 mililitrede dört santigrat derecede 15 dakika boyunca yeniden dirildi. Şimdi süpernatantı atın ve yıkanmış bozulmamış mitokondri içeren kahverengi peleti sakla. Mitokondri zenginleştirilmiş peleti proteaz inhibitörleri de dahil olmak üzere canlandırma tamponunun 250 mikrolitresinde yeniden sunun.Süspansiyonu 25 mikrolitre hacimde aliquot, sıvı nitrojende hızlı dondurun ve birkaç yıl boyunca 80 santigrat derece derin dondurucuda saklayın. Protokolün ardından mitokondri ile zenginleştirilmiş protein, iki grup ekmekten doğan yavruların kalbinden hazırlandı. Biri hamilelik sırasında, diğeri hareketsiz olarak egzersiz yapıldı.ETC protein profili analizi, egzersiz yapılan ekmeklerin yavrularının bazı ETC komplekslerinde nispeten daha düşük seviyeler sunduğunu ortaya koydu. Mitokondriyal proteinler %3 ila %8 gradyan BN-PAGE'de çözümlendi ve antikor kokteylleri ile immünproblandı. Hem egzersizli hem de sedanter gruplar birden fazla süpercomplexes sergiler.Gözlenen belirgin süperkapplex artışı, hareketsiz gruba kıyasla egzersiz grubunda dokuz ayda gerçekleşti. 48 saat üç ay, altı ay ve dokuz aylık farklı yaş gruplarından elde edilen mitokondri ile zenginleştirilmiş proteinler kinetik test kullanılarak Kompleks I-II aktivitesi için analiz edildi. Egzersiz yapılan grup, sedanter grubunkine kıyasla Karmaşık bir I-II aktivitesi gösterdi.Donmuş doku ve hücrelerden elde edilen mitokondriler üzerinde fonksiyonel çalışmaların fizibilitesi diğer araştırmacılar tarafından gösterilmektedir. Donmuş dokudan elde edilen mitokondrilerin hazırlanması, en az hasarla çok çeşitli dokular için uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

İnsan Mitral Valfinden Proteinlerin Çıkarılması İçin Optimize Edilmiş Protokol

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve Proton sızıntı kinetik Holstein süt sığır mitokondrial solunum tahmin etmek için ölçme

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitokondriyal Membran Dinamiğinin Yeniden İkasini için Model Membran Platformu

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Siyatik Sinirde Mitokondriyal Fonksiyonun Yüksek Rezolüsyonlu Respirometri ile Değerlendirilmesi

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...