Name: in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells
Uploaded: 2021-09-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ، مؤسسة الأبحاث الألمانية) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 و Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (إلى H.P.) ، وهي منحة بحثية Mechtild Harf من مؤسسة DKMS لإعطاء الحياة (إلى H.P.) جائزة الباحث الشاب من قبل تحالف أبحاث سرطان الجلد (إلى S.H.) ، وهي منحة دراسية من قبل مؤسسة Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (إلى F.S.) ، صندوق تأسيسي من الجامعة التقنية في ميونيخ (إلى S.H) ومنحة بحثية من مؤسسة فيلهلم ساندر (2021.041.1 ، إلى S.H.). يتم دعم H. P. من قبل برنامج EMBO للمحققين الشباب.
مساهمات المؤلف:
قام F.S. ، H.P. ، و S.H. بتصميم البحث وتحليله وتفسيره للنتائج. كتب ف. س. و س. ه. المخطوطة. قام H.P. و S.H. بتوجيه الدراسة.

في بداية التجارب ، كان عمر الفئران 6 أسابيع على الأقل وتم الحفاظ عليها في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض. يتوافق هذا البروتوكول مع المعايير الأخلاقية المؤسسية واللوائح المحلية السائدة. تمت الموافقة على الدراسات على الحيوانات من قبل الوكالة التنظيمية المحلية (Regierung von Oberbayern ، ميونيخ ...

<ol>
	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+cell+death+in+cancer+therapy.">Immunogenic cell death in cancer therapy.</a> Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).</li><li>Kepp, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+detection+of+immunogenic+cell+death.">Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death.</a> Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).</li><li>Fuertes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+type+I+IFN+signals+are+required+for+antitumor+CD8++T+cell+responses+through+CD8{alpha}++dendritic+cells.">Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).</li><li>Sistigu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell-autonomous+contribution+of+type+I+interferon+signaling+to+the+efficacy+of+chemotherapy.">Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).</li><li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+human+tumours:+impact+on+clinical+outcome.">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li><li>Shankaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNgamma+and+lymphocytes+prevent+primary+tumour+development+and+shape+tumour+immunogenicity.">IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity.</a> Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).</li><li>Tesniere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+death+of+colon+cancer+cells+treated+with+oxaliplatin.">Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin.</a> Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Zomer, A., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+extracellular+vesicle+transfer+on+cellular+heterogeneity+in+cancer:+What+are+the+potential+clinical+ramifications.">Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications.</a> Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).</li><li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+tumor-mediated+immune+suppression.">Exosomes and tumor-mediated immune suppression.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).</li><li>Wolfers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomes+are+a+source+of+shared+tumor+rejection+antigens+for+CTL+cross-priming.">Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming.</a> Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).</li><li>Zeelenberg, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+antigens+to+secreted+membrane+vesicles+in+vivo+induces+efficient+antitumor+immune+responses.">Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses.</a> Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).</li><li>Diamond, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+Shuttle+TREX1-Sensitive+IFN-Stimulatory+dsDNA+from+Irradiated+Cancer+Cells+to+DCs.">Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).</li><li>Kitai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-containing+exosomes+derived+from+cancer+cells+treated+with+topotecan+activate+a+STING-dependent+pathway+and+reinforce+antitumor+immunity.">DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity.</a> Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).</li><li>Heidegger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I+activation+is+critical+for+responsiveness+to+checkpoint+blockade.">RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade.</a> Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).</li><li>Schadt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-cell-intrinsic+cGAS+expression+mediates+tumor+immunogenicity.">Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity.</a> Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+immunization+of+a+TLR9+agonist+virus-like+particle+enhances+anti-PD1+therapy.">In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li><li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+and+storage+stability+of+extracellular+vesicles+for+therapeutic+applications.">Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis:+a+variation+study.">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).</li><li>Yuana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+extracellular+vesicles+in+fresh+plasma.">Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+generation+but+normal+maintenance+of+memory+T+cells+in+old+mice.">Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).</li><li>Bloom, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+tyrosinase-related+protein+2+as+a+tumor+rejection+antigen+for+the+B16+melanoma.">Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).</li><li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield,+purity+and+downstream+applications.">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).</li><li>DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+activation+and+associated+primary+adhesion+is+inducible+via+T+cell+receptor+stimulation.">CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation.</a> The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).</li><li>Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shedding+of+CD62L+(L-selectin)+regulates+the+acquisition+of+lytic+activity+in+human+tumor+reactive+T+lymphocytes.">The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes.</a> PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).</li><li>Bek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+intrinsic+RIG-I+signaling+turns+melanoma+cells+into+type+I+interferon-releasing+cellular+antitumor+vaccines.">Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines.</a> Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).</li><li>Nabet, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+RNA+unshielding+couples+stromal+activation+to+pattern+recognition+receptor+signaling+in+cancer.">Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer.</a> Cell. 170 (2), 352-366 (2017).</li><li>Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+masters+of+intercellular+communication+and+potential+clinical+interventions.">Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).</li></ol>

يوفر هذا البروتوكول تقييما مناعيا في الجسم الحي للمركبات الكهربائية المشتقة من خلايا سرطان الجلد تحت الضغط الناجم عن العلاج الكيميائي أثناء التكيف مع المركبات الكهربائية المنبعثة من أنواع السرطان المختلفة تحت علاجات مختلفة. على سبيل المثال، يؤدي تحصين الفئران بالمركبات الكهربائي?...

يلعب الجهاز المناعي دورا محوريا في مكافحة السرطان ، سواء عند التحريض عليه عن طريق تثبيط نقاط التفتيش المناعية أو لفعالية علاجات السرطان التقليدية. يمكن للخلايا السرطانية التي تستسلم للعلاجات السامة للجينات مثل عوامل العلاج الكيميائي أوكساليبلاتين ودوكسوروبيسين، أو العلاج الإشعاعي المؤين أن تطلق مستضدات وأنماط جزيئية مرتبطة بالخطر (DAMPs) يحتمل أن تبدأ استجابة مناعية تكيفية مضادة للورم1. وتشمل أبرز DAMPs ، في سياق موت الخلايا المناعية ، إشارات find-me مثل ATP الكيميائي ، وإشارات eat-me مثل التعرض للكاليريتيكولين ، الذي يعزز امتصاص الخلايا السرطانية بواسطة الخلايا التي تقدم المستضدات ، وإطلاق HMGB1 ، الذي ينشط مستقبلات التعرف على الأنماط ، وبالتالي تعزيز العرض المتبادل لمستضدات الورم 2. علاوة على ذلك، يتم استشعار الإنترفيرون من النوع الأول (IFN-I)، المستحث عن طريق الأحماض النووية المناعية المشتقة من الورم أو غيرها من المحفزات، بواسطة الخلايا المتغصنة، مما يمكنها من إطلاق الخلايا التائية السامة للخلايا الخاصة بالورم بشكل فعال3،4. سريريا ، توفر خلايا CD8 + T المنشطة والمنتشرة التي تتسلل إلى الورم عاملا تنبؤيا مستقلا للبقاء على قيد الحياة لفترة طويلة في العديد من مرضى السرطان. يتوسط IFN-γ ، الذي يتم إطلاقه من هذه الخلايا التائية المنشطة ، التأثيرات المباشرة المضادة للتكاثر على الخلايا السرطانية ويدفع استقطاب Th1 وتمايز الخلايا التائية السامة للخلايا ، مما يساهم في المراقبة المناعية الفعالة ضد السرطان5,6. أوكساليبلاتين هو محفز لموت الخلايا المناعية بحسن نية، ويتوسط مثل هذه الاستجابة المناعية التكيفية ضد السرطان7. ومع ذلك ، فإن العدد الكبير من الإشارات المناعية الأولية التي تطلقها الخلايا السرطانية تحت الضغط الناجم عن العلاج لا يزال يتعين الكشف عنها بالكامل. على الرغم من التقدم الكبير في العلاج المناعي للسرطان ، إلا أن توسيع فوائده لتشمل جزءا أكبر من المرضى لا يزال يمثل تحديا. قد يؤدي الفهم الأكثر تفصيلا للإشارات المناعية التي تبدأ تنشيط الخلايا التائية إلى توجيه تطوير علاجات جديدة.
يبدو أن مجموعة غير متجانسة من الهياكل المغلقة بالغشاء ، والمعروفة باسم الحويصلات خارج الخلية (EVs) ، تعمل كأجهزة اتصال بين الخلايا. تحمل المركبات الكهربائية المنبعثة من جميع أنواع الخلايا تقريبا البروتينات الوظيفية والحمض النووي الريبي والحمض النووي والجزيئات الأخرى إلى الخلية المتلقية أو قد تغير الحالة الوظيفية للخلية فقط عن طريق الارتباط بالمستقبلات الموجودة على سطح الخلية. تختلف حمولتها النشطة بيولوجيا اختلافا كبيرا حسب نوع الخلية المولدة وحالتها الوظيفية8. في علم المناعة السرطاني، اعتبرت المركبات الكهربائية المنبعثة من الخلايا السرطانية في الغالب معادية للعلاج المناعي لأنها تعزز في نهاية المطاف النمو الغازي، وتشكل منافذ النقيلي9، وتثبط الاستجابة المناعية10. في المقابل، أظهرت بعض الدراسات أن المركبات الكهربائية يمكنها نقل مستضدات الورم إلى الخلايا المتغصنة من أجل عرض تقديمي فعال11,12. قد توفر المركبات الكهربائية الأحماض النووية المناعية إذا ظهرت تحت الضغط الناجم عن العلاج، مما يسهل الاستجابة المناعية المضادة للورم13،14. وقد ثبت مؤخرا أن استشعار مثل هذه الروابط المناعية الفطرية للحمض النووي الريبي والحمض النووي في البيئة الدقيقة للورم يعدل الاستجابة لحصار نقاط التفتيش بشكل كبير15،16،17. وبالتالي ، فإن الدور المناعي للمركبات الكهربائية التي تطلقها الخلايا السرطانية تحت ضغط مختلف يسببه العلاج يحتاج إلى مزيد من التوضيح. نظرا لأن المركبات الكهربائية تشكل مجالا بحثيا شابا ولكنه متنام ، فإن توحيد الأساليب لا يزال مستمرا. لذلك ، فإن تبادل المعرفة أمر ضروري لتحسين قابلية تكرار الأبحاث حول التفاعلات بين المركبات الكهربائية وعلم المناعة السرطاني. مع وضع ذلك في الاعتبار، تصف هذه المخطوطة بروتوكولا بسيطا لتقييم التأثير المناعي للمركبات الكهربائية المشتقة من الورم في الجسم الحي.
يتم إجراء هذا التقييم عن طريق توليد EVs المشتقة من الورم ، وتحصين الفئران المتلقية مع تلك EVs ، وتحليل الخلايا التائية الطحالية عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم إجراء توليد EV بشكل مثالي عن طريق بذر خلايا ورم الفئران في وسط زراعة الخلايا الخالية من EV للحصول على درجة عالية من النقاء. يتم التعامل مع الخلايا بمحفز إجهاد خلوي محدد ، مثل العلاج الكيميائي ، لمقارنة تأثير EVs الناجم عن العلاج مع المناعة الأساسية للمركبات الكهربائية المشتقة من الورم. يمكن إجراء عزل المركبات الكهربائية من خلال تقنيات مختلفة يجب اختيارها وفقا للتطبيق في الجسم الحي والتوافر المحلي. يصف البروتوكول التالي فحصا قائما على هطول الأمطار مع مجموعة تجارية لتنقية EV. يتم تحصين الفئران مرتين مع تلك المركبات الكهربائية. بعد أربعة عشر يوما من الحقن الأول ، يتم استخراج الخلايا التائية من الطحال وتحليلها لإنتاج IFN-γ عن طريق قياس التدفق الخلوي لتقييم الاستجابة المناعية الجهازية. مع هذا، يتم تقييم إمكانات المركبات الكهربائية المشتقة من الورم، والتي تظهر في ظل أنظمة علاجية مختلفة، للحث على استجابات الخلايا التائية المضادة للورم بسهولة نسبية وبسرعة وبصلاحية عالية13. لذلك ، هذه الطريقة مناسبة للفحص المناعي للمركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا السرطانية في ظل ظروف مختلفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100204</td>
			<td>Clone 17A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 PacBlue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100428</td>
			<td>Clone GK1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100712</td>
			<td>Clone 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN&#947; PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>RM90022</td>
			<td>Clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420601</td>
			<td>Brefeldin A Solution (1,000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>EASYstrainer 100 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td>eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5123-43</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Diluent</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5223-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>407952</td>
			<td>From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, &#8805; 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>vac-pova</td>
			<td>Ovalbumine with &#60; 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Pharmacy of MRI hospital</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1514-122</td>
			<td>Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate, &#8805; 99% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF filter, 0,22 &#181;m, for syringes</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Filter Unit 0.22 &#181;m Durapore PVDF Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 26 G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305501</td>
			<td>1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Exosome Isolation Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478359</td>
			<td>For isolation from cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>31350</td>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells

يمكن أن يؤدي موت الخلايا المناعية للأورام ، الناجم عن العلاج الكيميائي أو الإشعاعي ، إلى استجابات الخلايا التائية الخاصة بالورم عن طريق إطلاق أنماط جزيئية مرتبطة بالخطر وتحفيز إنتاج الإنترفيرون من النوع الأول. تعتمد العلاجات المناعية، بما في ذلك تثبيط نقاط التفتيش، في المقام الأول على الخلايا التائية الخاصة بالورم الموجودة مسبقا للكشف عن تأثير علاجي. وبالتالي ، فإن النهج العلاجية التآزرية التي تستغل موت الخلايا المناعية كلقاح جوهري مضاد للسرطان قد تحسن استجابتها. ومع ذلك ، فإن طيف العوامل المناعية التي تطلقها الخلايا تحت الضغط الناجم عن العلاج لا يزال غير مميز تماما ، خاصة فيما يتعلق بالحويصلات خارج الخلية (EVs). تعتبر المركبات الكهربائية ، وهي جزيئات غشائية نانوية الحجم تنبعث من جميع الخلايا تقريبا ، تسهل الاتصال بين الخلايا ، وفي السرطان ، ثبت أنها تتوسط في التحضير المتبادل ضد مستضدات الورم. لتقييم التأثير المناعي للمركبات الكهربائية المشتقة من الأورام في ظل ظروف مختلفة ، يتم البحث عن طرق قابلة للتكيف وقابلة للتطوير وصالحة. لذلك ، يتم تقديم نهج سهل وقوي نسبيا لتقييم مناعة المركبات الكهربائية في الجسم الحي . ويستند البروتوكول إلى تحليل التدفق الخلوي للخلايا التائية الطحالية بعد تحصين الفئران في الجسم الحي بالمركبات الكهربائية، معزولة عن طريق المقايسات القائمة على هطول الأمطار من مزارع الخلايا السرطانية تحت العلاج أو ظروف الحالة الثابتة. على سبيل المثال ، يظهر هذا العمل أن التعرض لأوكساليبلاتين لخلايا الورم الميلانيني الفئران B16-OVA أدى إلى إطلاق EVs المناعية التي يمكن أن تتوسط في تنشيط الخلايا التائية السامة للخلايا التفاعلية للورم. وبالتالي، فإن فحص المركبات الكهربائية عن طريق التحصين في الجسم الحي وقياس التدفق الخلوي يحدد الظروف التي يمكن أن تظهر فيها المركبات الكهربائية المناعية. يوفر تحديد ظروف إطلاق EV المناعي شرطا أساسيا لاختبار الفعالية العلاجية للمركبات الكهربائية ضد السرطان واستكشاف الآليات الجزيئية الأساسية للكشف في نهاية المطاف عن رؤى جديدة حول دور EVs في علم المناعة السرطاني.

يهدف هذا البروتوكول إلى تسهيل التقييم المباشر والقابل للتكرار بسهولة للمناعة للمركبات الكهربائية المشتقة من الورم. بموجب هذا ، يتم تلقيح الفئران بمركبات كهربائية مشتقة من مزارع الخلايا السرطانية في المختبر التي تعبر عن نموذج مستضد الدجاج ovalbumin (OVA). يتم تحليل الاستجابة المناعية اللا...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells at JoVE.com

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

تصف هذه المخطوطة كيفية تقييم المناعة في الجسم الحي للحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا السرطانية (EVs) باستخدام قياس التدفق الخلوي. تبدو المركبات الكهربائية المشتقة من الأورام التي تخضع لموت الخلايا المناعية الناجم عن العلاج ذات أهمية خاصة في المراقبة المناعية للورم. يجسد هذا البروتوكول تقييم المركبات الكهربائية للورم المناعي الناجم عن أوكساليبلاتين ولكن يمكن تكييفه مع مختلف الإعدادات.

في فيفو فحص المناعة للحويصلات خارج الخلية المشتقة من الورم عن طريق قياس التدفق الخلوي للخلايا التائية الطحالية

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

يوضح هذا الفيديو كيفية تقييم المناعة في الجسم الحي للحويصلات خارج الخلية المشتقة من الورم ، أو EVs ، باستخدام قياس التدفق الخلوي. طريقة الفحص الموصوفة هنا سهلة الأداء نسبيا ويمكن تكييفها مع الإعدادات المختلفة. في السرطان ، تحديد ظروف إطلاق الحويصلة خارج الخلية المناعية ذات الصلة الانتقالية الخاصة.على هذا النحو ، يمكن استخدام EVs الذاتية كعلاجات شخصية مضادة للسرطان. ستوضح الجزء الأول من الإجراء تاتيانا نيدلكو ، وهي مساعدة فنية من مختبري. لبدء إعداد وسائط زراعة الخلايا اللازمة للحويصلة خارج الخلية ، أو EVs ، استنفد المركبات الكهربائية البقرية في وسائط FCS عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 100،000 مرة غرام لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.تخلص من الكريات بعد الطرد المركزي. حصاد خلايا الورم الميلانيني B16 الفئران التي تعبر عن ovalbumin ، أو خلايا B16-OVA ، من الثقافة وغسل الخلايا مرتين مع PBS. ثم ، زرع الخلايا بتركيز 400،000 خلية لكل ملليلتر في الوسائط المستنفدة EV.بعد ذلك ، عالج خلايا B16-OVA ب 30 ميكروغرام من أوكساليبلاتين لكل ملليلتر واحتضنها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع عينات تحكم غير معالجة. بعد 24 ساعة ، اجمع السوبرنات لجهاز الطرد المركزي بسرعة 400 مرة لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من الكريات قبل الطرد المركزي مرة أخرى عند 2000 مرة غرام لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.بعد التخلص من الكريات ، قم بتصفية supernatant من خلال مرشح غشاء PVDF 220 نانومتر في أنبوب جديد. ثم ، امزج 1 ملليلتر من supernatant مع 0.5 ملليلتر من كاشف عزل exosome محدد متاح تجاريا. دوامة ونقل الخليط إلى أنابيب 1.5 ملليلتر ، تليها حضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للخليط عند 10،000 مرة غرام لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد التخلص بعناية من السوبرناتانت ، قم بإزالة القطرات المتبقية عن طريق النقر على أنبوب 1.5 ملليلتر رأسا على عقب على منشفة ورقية وعن طريق الشفط من خلال طرف ناعم من ماصة دون لمس حبيبة EV في الأسفل. أعد تعليق الكريات في PBS البارد عن طريق السحب لأعلى ولأسفل دون خدش الكريات بالطرف.ثم ، قم بتجميع EVs من جميع الأنابيب. إذا لم يتم استخدامها على الفور ، فقم بتخزين معلقات EV عند 80 درجة مئوية في أوعية مصنوعة من السيليكون لمدة تصل إلى 28 يوما حتى التطبيق. لتحصين كل فأر في مجموعة العلاج بمركبات كهربائية معزولة من 4.0 × 10 إلى خلايا B16-OVA الخامسة ، امزج 5 ميكرولترات من تعليق EV مع 55 ميكرولتر من PBS البارد.بعد ذلك ، املأ المحاقن المثبتة بإبر قياس 26 إلى 30 مع 60 ميكرولتر من EVs المخففة أو PBS ثم ضع المحقنة على الفور على الجليد. قم بتلقيح EVs أو PBS تحت الجلد في الجانب الإنسي من فخذ الفئران. كرر التحصين بعد سبعة أيام.بعد 14 يوما من العلاج الأول ، ضحى بالفئران لاستئصال الطحال. ثم ، اهرسي الطحال المقطوع باستخدام مصفاة خلية مبللة بسعة 100 ميكرومتر ومكبس بلاستيكي لمحقنة. اغسل الخلايا الطحالية في أنبوب 50 ملليلتر مع 5 إلى 10 ملليلتر من RPMI الكامل البارد.بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 400 مرة غرام لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية قبل التخلص من المادة الفائقة. لإزالة كريات الدم الحمراء من تعليق الخلية ، أعد تعليق واحتضان حبيبة الخلية مع 2 ملليلتر من مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم ، أوقف التفاعل بإضافة خمسة إلى 10 ملليلتر من RPMI الكامل ، متبوعا بالطرد المركزي كما هو موضح سابقا.بعد إعادة تعليق حبيبات الخلايا في RPMI كاملة ، قم بحساب الخلايا من كل فأر ووضع ثلاثة أضعاف 200،000 خلية طحالية مع 200 ميكرولتر من cRPMI في كل بئر من صفيحة 96 بئرا مع قاع على شكل حرف U. ثم ، احتضن الألواح لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد 48 ساعة ، عالج مزرعة الخلايا ب 5 نانوغرام لكل ملليلتر بريفيلدين A ، و 20 نانوغرام لكل ملليلتر PMA ، و 1 ميكروغرام لكل ملليلتر Ionomycin عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.بعد الحضانة ، انقل الخلايا الطحالية إلى صفيحة من 96 بئرا ذات قاع على شكل حرف V واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. أعد تعليق الخلايا الطحالية الحبيبية في محلول التلطيخ المعد حديثا واحتضن تعليق الخلية لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء. للتثبيت والنفاذية ، اغسل الخلايا الطحالية مرتين في المخزن المؤقت FACS-ثم أعد تعليق الخلايا الطحالية في 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول التثبيت والنفاذية ، تليها الحضانة في الظلام كما هو موضح سابقا.لتلطيخ غاما الإنترفيرون داخل الخلايا ، اغسل الخلايا الطحالية في المخزن المؤقت للتثبيت أو التخلل قبل إعادة إرسال الخلايا بالأجسام المضادة الفلورية ضد جاما الإنترفيرون المخففة 1:200 في المخزن المؤقت. احتضان الخلايا الطحالية لمدة 1 إلى 12 ساعة عند 4 درجات مئوية في الظلام. بعد الغسيل الشامل وإعادة التعليق في المخزن المؤقت FACS-، قم بتحليل تنشيط الخلايا التائية السامة للخلايا وفقا لاستراتيجية البوابات الموضحة في المخطوطة.في الصورة التمثيلية ، يتم عرض استراتيجية البوابة لتحليل تنشيط الخلايا التائية السامة للخلايا. كانت الخلايا مسورة كخلايا مفردة ، ومجموعة فرعية من الخلايا الليمفاوية ، والخلايا التائية الإيجابية CD3 القابلة للحياة ، والخلايا التائية السامة للخلايا CD8 السلبية CD8. تم تقييم التراكم داخل الخلايا لجاما الإنترفيرون كعلامة بديلة للتنشيط.بعد التحصين بالمركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا السرطانية ، تمت دراسة تحريض استجابات الخلايا التائية الخاصة بالمستضدات في الفئران المتلقية. وقد أدت المركبات الكهربائية المشتقة من الورم المستزرعة في ظل ظروف الإجهاد السام الوراثي، مثل علاج أوكساليبلاتين، إلى تنشيط قوي للخلايا التائية السامة للخلايا الطحالية على النقيض من المركبات الكهربائية غير المعالجة. أظهرت مجموعة الحيوانات المعالجة بالمركبات أدنى استجابة.تم تحديد تنشيط الخلايا التائية الطحالية بعد إعادة التحفيز خارج الجسم الحي إما في وجود أو عدم وجود ovalbumin. تم زيادة إنتاج جاما الإنترفيرون عندما تم إعادة تنشيط الخلايا الطحالية للحيوانات المعالجة بالورم EV مع نموذج مستضد الورم ovalbumin قبل التحليل. يرجى ملاحظة أن النتائج القابلة للتكرار تعتمد على فعالية العزل المستمرة للمركبات الكهربائية.وبالتالي ، تأكد من إعادة تعليق كريات EV بالكامل وعلى الفور لتجنب الجفاف. باستخدام هذا البروتوكول ، تمكنا من تحليل مسارات محددة داخل الخلايا السرطانية التي تحدد مناعة المركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا السرطانية. هذا قد يمهد الطريق لتسخير مثل هذه المركبات الكهربائية المناعية في علاج السرطان.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

تدفق المخدرات على أساس الخلوي فحص النظام لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز الخلوي للخلايا الجذعية جليوبلاستوما

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

في فيفو تقييم الجيش الشعبي الثوري لدرجة الحموضة، فس2، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات الفوسفات والجلوتاثيون في "ورم المكروية"

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

التدفق الخلوي لتقدير لوكيميا الخلايا الجذعية في الابتدائي سرطان الدم النقوي الحاد والمريض-المشتقة-تكثيفها، في التشخيص والمتابعة حتى

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

إيمونوفينوتيبينج من أورثوتوبيك هوموجرافت (سينجينيك) من الفيلق الابتدائي موريني البنكرياس الأقنية غدية بالتدفق الخلوي

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

مقايسة قتل كروي من خلايا تي السيارة

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

الكشف عن الوقت الحقيقي في المختبر ورم الخلايا المبرمج الناجمة عن CD8+ تي الخلايا لدراسة وظائف المناعة القمعية من التسلل إلى ورم الخلايا النقوي

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

استخراج الحويصلات خارج الخلية من الأنسجة كاملة

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

قياس دورة الخلية محددة من γH2AX والمبرمج بعد الإجهاد السامة الجينية عن طريق قياس التدفق الخلوي

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

عزل الحويصلات خارج الخلية المخصبة Exosome تحمل عامل تحفيز مستعمرة الحبيبية-الضامة من الخلايا الجذعية الجنينية

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

توليد أورام البنكرياس التقويمية وتوصيف الجسم السابق للخلايا التي تتسلل إلى الخلايا T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...