Name: in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells
Uploaded: 2021-09-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 og Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (til H.P.), et Mechtild Harf Research Grant fra DKMS Foundation for Giving Life (til H.P.) en Young Investigator Award af Melanoma Research Alliance (til S.H.), et stipendium fra Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (til F.S.), en frøfond fra det tekniske universitet I München (til S.H.) og et forskningsstipendium fra Wilhelm Sander Foundation (2021.041.1, til S.H.). H. P. er støttet af EMBO Young Investigator Program.
FORFATTER BIDRAG:
F.S., H.P. og S.H. designede forskningen, analyserede og fortolkede resultaterne. F.S. og S.H. skrev manuskriptet. H.P. og S.H. styrede undersøgelsen.

Ved forsøgets begyndelse var mus mindst 6 uger gamle og blev opretholdt under specifikke patogenfrie forhold. Denne protokol er i overensstemmelse med de institutionelle etiske standarder og gældende lokale regler. Dyreforsøg blev godkendt af det lokale reguleringsorgan (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland). Mulige kønsrelaterede forstyrrelser blev ikke undersøgt i disse undersøgelser.
1. Generering og isolering af elbiler afledt af tumorceller efter kemoterapieksponering
<ol>...

<ol>
	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+cell+death+in+cancer+therapy.">Immunogenic cell death in cancer therapy.</a> Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).</li><li>Kepp, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+detection+of+immunogenic+cell+death.">Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death.</a> Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).</li><li>Fuertes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+type+I+IFN+signals+are+required+for+antitumor+CD8++T+cell+responses+through+CD8{alpha}++dendritic+cells.">Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).</li><li>Sistigu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell-autonomous+contribution+of+type+I+interferon+signaling+to+the+efficacy+of+chemotherapy.">Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).</li><li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+human+tumours:+impact+on+clinical+outcome.">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li><li>Shankaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNgamma+and+lymphocytes+prevent+primary+tumour+development+and+shape+tumour+immunogenicity.">IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity.</a> Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).</li><li>Tesniere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+death+of+colon+cancer+cells+treated+with+oxaliplatin.">Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin.</a> Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Zomer, A., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+extracellular+vesicle+transfer+on+cellular+heterogeneity+in+cancer:+What+are+the+potential+clinical+ramifications.">Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications.</a> Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).</li><li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+tumor-mediated+immune+suppression.">Exosomes and tumor-mediated immune suppression.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).</li><li>Wolfers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomes+are+a+source+of+shared+tumor+rejection+antigens+for+CTL+cross-priming.">Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming.</a> Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).</li><li>Zeelenberg, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+antigens+to+secreted+membrane+vesicles+in+vivo+induces+efficient+antitumor+immune+responses.">Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses.</a> Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).</li><li>Diamond, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+Shuttle+TREX1-Sensitive+IFN-Stimulatory+dsDNA+from+Irradiated+Cancer+Cells+to+DCs.">Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).</li><li>Kitai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-containing+exosomes+derived+from+cancer+cells+treated+with+topotecan+activate+a+STING-dependent+pathway+and+reinforce+antitumor+immunity.">DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity.</a> Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).</li><li>Heidegger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I+activation+is+critical+for+responsiveness+to+checkpoint+blockade.">RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade.</a> Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).</li><li>Schadt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-cell-intrinsic+cGAS+expression+mediates+tumor+immunogenicity.">Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity.</a> Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+immunization+of+a+TLR9+agonist+virus-like+particle+enhances+anti-PD1+therapy.">In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li><li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+and+storage+stability+of+extracellular+vesicles+for+therapeutic+applications.">Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis:+a+variation+study.">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).</li><li>Yuana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+extracellular+vesicles+in+fresh+plasma.">Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+generation+but+normal+maintenance+of+memory+T+cells+in+old+mice.">Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).</li><li>Bloom, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+tyrosinase-related+protein+2+as+a+tumor+rejection+antigen+for+the+B16+melanoma.">Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).</li><li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield,+purity+and+downstream+applications.">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).</li><li>DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+activation+and+associated+primary+adhesion+is+inducible+via+T+cell+receptor+stimulation.">CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation.</a> The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).</li><li>Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shedding+of+CD62L+(L-selectin)+regulates+the+acquisition+of+lytic+activity+in+human+tumor+reactive+T+lymphocytes.">The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes.</a> PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).</li><li>Bek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+intrinsic+RIG-I+signaling+turns+melanoma+cells+into+type+I+interferon-releasing+cellular+antitumor+vaccines.">Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines.</a> Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).</li><li>Nabet, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+RNA+unshielding+couples+stromal+activation+to+pattern+recognition+receptor+signaling+in+cancer.">Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer.</a> Cell. 170 (2), 352-366 (2017).</li><li>Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+masters+of+intercellular+communication+and+potential+clinical+interventions.">Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).</li></ol>

Denne protokol giver en immunologisk in vivo-vurdering af elbiler afledt af melanomceller under kemoterapi-induceret stress, mens de tilpasser sig elbiler, der udsendes fra forskellige kræftformer under forskellige behandlinger. Immunisering af mus med ELBILER afledt af oxaliplatinbehandlede B16-OVA-celler udvider for eksempel IFN-γ-producerende CD8 + T-celler i milten, som yderligere stimuleres af ex vivo-inkubation med ovalbumin, hvilket indikerer et tumorspecifikt immunrespons. Påvisnin...

Immunsystemet spiller en central rolle i kampen mod kræft, både når det anspores af immun checkpoint-hæmning og for effektiviteten af konventionelle kræftbehandlinger. Tumorceller, der bukker under for genotoksiske terapier såsom de kemoterapeutiske midler oxaliplatin og doxorubicin eller ioniserende strålebehandling, kan frigive antigener og fareassocierede molekylære mønstre (DAMP'er), der potentielt initierer et adaptivt antitumorimmunrespons1. De mest fremtrædende DAMP'er i forbindelse med immunogen celledød inkluderer find-me-signaler såsom kemotaktisk ATP, eat-me-signaler såsom eksponering af calreticulin, der fremmer tumorcelleoptagelse af antigenpræsenterende celler og frigivelse af HMGB1, der aktiverer mønstergenkendelsesreceptorer og derved forbedrer krydspræsentationen af tumorantigener2. Desuden opdages type I-interferoner (IFN-I), induceret via tumorafledte immunogene nukleinsyrer eller andre stimuli, af dendritiske celler, hvilket gør det muligt for dem effektivt at prime tumorspecifikke cytotoksiske T-celler3,4. Klinisk, aktiverede og prolifererende CD8 + T-celler, der infiltrerer tumoren, giver en uafhængig prognostisk faktor for langvarig overlevelse hos mange kræftpatienter. FRIGIVET fra sådanne aktiverede T-celler medierer IFN-γ direkte antiproliferative virkninger på kræftceller og driver Th1-polarisering og cytotoksisk T-celledifferentiering og bidrager derved til effektiv immunovervågning mod kræft5,6. Oxaliplatin er en bona fide immunogen celledødsinducer, der formidler et sådant adaptivt immunrespons mod kræft7. Imidlertid er overflod af indledende immunogene signaler frigivet af tumorceller under terapiinduceret stress stadig ikke fuldt ud afsløret. På trods af betydelige fremskridt inden for kræftimmunterapi er det stadig en udfordring at udvide fordelene til en større del af patienterne. En mere detaljeret forståelse af immunogene signaler, der initierer T-celleaktivering, kan styre udviklingen af nye terapier.
En heterogen gruppe af membranlukkede strukturer, kendt som ekstracellulære vesikler (ELBILER), synes at tjene som intercellulære kommunikationsenheder. Udsendt af stort set alle celletyper bærer ELBILER funktionelle proteiner, RNA, DNA og andre molekyler til en modtagercelle eller kan ændre en celles funktionelle tilstand bare ved at binde sig til receptorer på celleoverfladen. Deres biologisk aktive last varierer betydeligt efter typen og den funktionelle tilstand af den genererende celle8. Inden for kræftimmunologi er elbiler, der frigives fra tumorceller, overvejende blevet betragtet som modstandere af immunterapi, fordi de i sidste ende fremmer invasiv vækst, præforme metastatiske nicher9 og undertrykker immunresponset10. I modsætning hertil har nogle undersøgelser vist, at elbiler kan overføre tumorantigener til dendritiske celler for effektiv krydspræsentation11,12. ELBILER kan give immunstimulerende nukleinsyrer, hvis de opstår under terapiinduceret stress, hvilket letter et antitumorimmunrespons13,14. Sensing af sådanne RNA og DNA medfødte immunligander i tumormikromiljøet har for nylig vist sig at modulere lydhørhed over for checkpoint-blokade signifikant15,16,17. Derfor skal den immunogene rolle af elbiler frigivet af tumorceller under forskellig terapiinduceret stress belyses yderligere. Da elbiler udgør et ungt, men voksende forskningsfelt, er standardisering af metoder stadig i gang. Derfor er vidensdeling afgørende for at forbedre forskningsreproducerbarheden af interaktioner mellem elbiler og kræftimmunologi. Med dette i tankerne beskriver dette manuskript en simpel protokol til vurdering af den immunogene virkning af tumorafledte elbiler in vivo.
Denne vurdering udføres ved at generere tumorafledte elbiler, immunisere modtagermus med disse ELBILER og analysere milt-T-celler via flowcytometri. EV-generering udføres ideelt ved at så murine tumorceller i et EV-frit cellekulturmedium for en høj grad af renhed. Celler behandles med en specifik cellestressstimulus, såsom kemoterapi, for at sammenligne effekten af terapiinducerede elbiler med baseline immunogenicitet af respektive tumorafledte elbiler. Isoleringen af elbiler kan meget vel udføres ved hjælp af forskellige teknikker, der bør vælges i henhold til in vivo-anvendelighed og lokal tilgængelighed. Følgende protokol beskriver et nedbørsbaseret assay med et kommercielt sæt til rensning af elbiler. Mus immuniseres to gange med disse elbiler. Fjorten dage efter den første injektion ekstraheres T-celler fra milten og analyseres for IFN-γ produktion via flowcytometri for at evaluere et systemisk immunrespons. Med dette vurderes potentialet for tumorafledte elbiler, der opstår under forskellige terapeutiske regimer, for at inducere antitumor T-celleresponser relativt let, hurtigt og med høj gyldighed13. Derfor er denne metode egnet til en immunologisk screening af elbiler afledt af kræftceller under forskellige forhold.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100204</td>
			<td>Clone 17A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 PacBlue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100428</td>
			<td>Clone GK1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100712</td>
			<td>Clone 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN&#947; PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>RM90022</td>
			<td>Clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420601</td>
			<td>Brefeldin A Solution (1,000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>EASYstrainer 100 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td>eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5123-43</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Diluent</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5223-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>407952</td>
			<td>From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, &#8805; 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>vac-pova</td>
			<td>Ovalbumine with &#60; 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Pharmacy of MRI hospital</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1514-122</td>
			<td>Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate, &#8805; 99% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF filter, 0,22 &#181;m, for syringes</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Filter Unit 0.22 &#181;m Durapore PVDF Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 26 G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305501</td>
			<td>1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Exosome Isolation Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478359</td>
			<td>For isolation from cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>31350</td>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells

Immunogen celledød af tumorer, forårsaget af kemoterapi eller bestråling, kan udløse tumorspecifikke T-celleresponser ved at frigive fareassocierede molekylære mønstre og inducere produktionen af type I-interferon. Immunterapier, herunder checkpoint-hæmning, er primært afhængige af allerede eksisterende tumorspecifikke T-celler for at udfolde en terapeutisk effekt. Således kan synergistiske terapeutiske tilgange, der udnytter immunogen celledød som en iboende anti-cancervaccine, forbedre deres lydhørhed. Imidlertid forbliver spektret af immunogene faktorer, der frigives af celler under terapiinduceret stress, ufuldstændigt karakteriseret, især med hensyn til ekstracellulære vesikler (IV'er). ELBILER, nano-skala membranøse partikler udsendt fra stort set alle celler, anses for at lette intercellulær kommunikation og har i kræft vist sig at formidle cross-priming mod tumorantigener. For at vurdere den immunogene virkning af elbiler afledt af tumorer under forskellige forhold søges tilpasningsdygtige, skalerbare og gyldige metoder. Derfor præsenteres heri en relativt nem og robust tilgang til vurdering af elbilers in vivo-immunogenicitet . Protokollen er baseret på flowcytometrianalyse af milt-T-celler efter in vivo-immunisering af mus med ELBILER, isoleret ved udfældningsbaserede assays fra tumorcellekulturer under terapi eller steady-state-betingelser. For eksempel viser dette arbejde, at oxaliplatineksponering af B16-OVA murine melanomceller resulterede i frigivelse af immunogeneEV'er, der kan formidle aktiveringen af tumorreaktive cytotoksiske T-celler. Derfor identificerer screening af elbiler via in vivo-immunisering og flowcytometri betingelser, hvorunder immunogene elbiler kan dukke op. Identificering af betingelser for immunogen EV-frigivelse giver en væsentlig forudsætning for at teste EV'ers terapeutiske effekt mod kræft og udforske de underliggende molekylære mekanismer for i sidste ende at afsløre ny indsigt i EV'ers rolle i kræftimmunologi.

Denne protokol har til formål at lette en enkel og let reproducerbar vurdering af immunogeniciteten af tumorafledte elbiler. Herved podes mus med elbiler afledt af in vitro-kulturer af tumorceller, der udtrykker modelantigenet chicken ovalbumin (OVA). Det efterfølgende immunrespons analyseres i milt-T-celler via flowcytometri.
Figur 1 giver et overblik over de praktiske trin i hele protokollen. Da arbejdet fokuserer på immunogen celledød, kry...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells at JoVE.com

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Dette manuskript beskriver, hvordan man vurderer in vivo-immunogenicitet af tumorcelleafledte ekstracellulære vesikler (IV'er) ved hjælp af flowcytometri. ELBILER afledt af tumorer, der gennemgår behandlingsinduceret immunogen celledød, synes særligt relevante i tumorimmunovervågning. Denne protokol eksemplificerer vurderingen af oxaliplatin-inducerede immunstimulerende tumor-ELBILER, men kan tilpasses forskellige indstillinger.

In vivo Immunogenicitetsscreening af tumorafledte ekstracellulære vesikler ved flowcytometri af milt-T-celler

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Denne video viser, hvordan man vurderer in vivo-immunogeniciteten af tumorafledte ekstracellulære vesikler eller ELBILER ved hjælp af flowcytometri. Screeningsmetoden beskrevet heri er relativt let at udføre og kan tilpasses forskellige indstillinger. Ved kræft frigives identifikationsbetingelser for immunogene ekstracellulære vesikler af særlig translationel relevans.Som sådan kan autologe elbiler bruges som personlige anti-cancer behandlinger. Den første del af proceduren demonstreres af Tatiana Nedelko, en teknisk assistent fra mit laboratorium. For at starte forberedelsen af cellekulturmedier, der kræves til ekstracellulær vesikel eller elbiler, nedbrydes kvæg-elbilerne i FCS-medier ved ultracentrifugation ved 100.000 gange g i 24 timer ved 4 grader Celsius.Kassér pelleten efter centrifugering. Høst murine B16 melanomceller, der udtrykker ovalbumin eller B16-OVA-celler, fra kulturen og vask cellerne to gange med PBS. Derefter frø cellerne i en koncentration på 400.000 celler pr. Milliliter i det EV-udtømte medie.Derefter behandles B16-OVA-cellerne med 30 mikrogram oxaliplatin pr. Milliliter og inkuberes i 24 timer ved 37 grader Celsius med ubehandlede kontrolprøver. Efter 24 timer opsamles supernatanten til centrifuge ved 400 gange g i fem minutter ved 4 grader Celsius. Kassér pillen før centrifugering igen ved 2.000 gange g i 30 minutter ved 4 grader Celsius.Efter kassering af pelleten filtreres supernatanten gennem et 220 nanometer PVDF-membranfilter i et nyt rør. Derefter blandes 1 milliliter supernatant med 0,5 ml af et specifikt kommercielt tilgængeligt exosomisoleringsreagens. Vortex og overfør blandingen til 1,5 ml rør, efterfulgt af inkubering natten over ved 4 grader Celsius.Den næste dag centrifugeres blandingen ved 10.000 gange g i 60 minutter ved 4 grader Celsius. Efter forsigtigt at have kasseret supernatanten skal du fjerne de resterende dråber ved at banke på 1,5 ml røret på hovedet på et papirhåndklæde og ved aspiration gennem en fin spids af pipetten uden at røre EV-pillen i bunden. Genophæd pelleten i kold PBS ved at pipettere op og ned uden at ridse pillen med spidsen.Pool derefter elbilerne fra alle rør. Hvis du ikke bruger det med det samme, skal du opbevare EV-suspensionerne ved 80 grader Celsius i silikoniserede beholdere i op til 28 dage, indtil de påføring. For at immunisere hver mus i behandlingsgruppen med EV'er isoleret fra 4,0 x 10 til de femte B16-OVA-celler blandes 5 mikroliter af EV-suspensionen med 55 mikroliter kold PBS.Fyld derefter sprøjter monteret med 26 til 30-gauge nåle med 60 mikroliter af de fortyndede elbiler eller PBS og læg derefter straks sprøjten på is. Inokulerev'erne eller PBS subkutant ind i det mediale aspekt af musenes lår. Gentag immuniseringen efter syv dage.14 dage efter den første behandling skal musene ofres for at resektere milten. Mos derefter den resekterede milt med en fugtet 100 mikrometer cellesil og plaststemplet på en sprøjte. Skyl miltcellerne i et 50 ml rør med 5 til 10 ml af den kølige komplette RPMI.Derefter centrifugeres cellerne ved 400 gange g i fem minutter ved 4 grader Celsius, før supernatanten kasseres. For at fjerne erytrocytter fra cellesuspensionen skal du resuspendere og inkubere cellepillen med 2 ml af den røde blodcellelysebuffer i fem minutter ved stuetemperatur. Stop derefter reaktionen ved at tilsætte fem til 10 ml komplet RPMI efterfulgt af centrifugering som beskrevet tidligere.Efter genoplivning af cellepillen i komplet RPMI skal du tælle cellerne fra hver mus og placere triplikaterne på 200.000 splenocytter med 200 mikroliter cRPMI i hver brønd i en 96-brønds plade med en U-formet bund. Derefter inkuberes pladerne i 48 timer ved 37 grader Celsius. Efter 48 timer behandles cellekulturen med 5 nanogram pr. Milliliter Brefeldin A, 20 nanogram pr. Milliliter PMA og 1 mikrogram pr. Milliliter Ionomycin ved 37 grader Celsius i 4 timer.Efter inkubation overføres splenocytterne til en 96-brønds plade med en V-formet bund og vaskes cellerne to gange med PBS. Resuspend de pelleterede splenocytter i den frisklavede farvningsopløsning og inkuber cellesuspensionen i 30 minutter ved 4 grader Celsius beskyttet mod lys. Til fiksering og permeabilisering vaskes splenocytterne to gange i FACS-bufferen og suspenderes derefter splenocytterne igen i 100 mikroliter pr. Brønd i fikserings- og permeabiliseringsopløsningen efterfulgt af inkubation i mørket som forklaret tidligere.Til farvning af den intracellulære interferongamma vaskes splenocytterne i fikserings- eller permeabiliseringsbufferen, inden cellerne videresendes med de fluorescerende antistoffer mod interferongamma fortyndet 1:200 i bufferen. Inkuber splenocytterne i 1 til 12 timer ved 4 grader Celsius i mørket. Efter grundig vask og genoplivning i FACS-buffer analyseres aktiveringen af cytotoksiske T-celler i henhold til gating-strategien forklaret i manuskriptet.I det repræsentative billede vises gating-strategien til analyse af aktiveringen af cytotoksiske T-celler. Cellerne blev gated som de enkelte celler, lymfocytundergruppen, de levedygtige CD3-positive T-celler og de CD4-negative CD8-positive cytotoksiske T-celler. Den intracellulære akkumulering af interferongamma blev vurderet som en surrogatmarkør for aktiveringen.Efter immuniseringen med ELBILER afledt af tumorcellerne blev induktionen af antigenspecifikke T-celleresponser hos modtagermus undersøgt. De tumorafledte elbiler dyrket under genotoksiske stressbetingelser, såsom oxaliplatinbehandling, inducerede kraftig aktivering af de miltcytotoksiske T-celler i modsætning til ubehandlede elbiler. Den køretøjsbehandlede gruppe af dyr viste den laveste respons.Aktiveringen af milt-T-celler blev bestemt efter ex vivo-restimuleringen enten i nærvær eller fravær af ovalbumin. Produktionen af interferongamma blev øget, når splenocytterne af tumor EV-behandlede dyr blev genimuleret med modellen tumorantigen ovalbumin før analysen. Bemærk, at reproducerbare resultater afhænger af elbilernes konstante isolationseffektivitet.Sørg således for, at EV-pellets resuspenderet helt og hurtigt for at undgå udtørring. Med denne protokol var vi i stand til at analysere specifikke veje i tumorceller, der bestemmer immunogeniciteten af tumorcelleafledte elbiler. Dette kan bane vejen for at udnytte sådanne immunogene elbiler i kræftbehandling.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Flow flowcytometri-baserede stof Screening System til identifikation af små molekyler, der fremmer Celledifferentiering glioblastom stamceller

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR vurdering af pH, pO2, Redox Status, og koncentrationen af fosfat og glutathion i Tumor mikromiljø

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow flowcytometri for at vurdere leukæmi stamceller i primære akut Myeloid leukæmi og Patient-afledt-xenografts, på diagnose og følg op

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunofænotypning af Orthotopic Homograft (Syngeneic) af Murine primære KPC pancreas duktalt adenokarcinom ved flowcytometri

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En klumpformet drab Assay af bil T celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid påvisning af i Vitro Tumor celle apoptose induceret af CD8+ T-celler til at studere immun suppressiv funktioner af Tumor infiltrerer myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Udvinding af ekstracellulære vesikler fra hele væv

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Celle cyklus-specifik måling af γH2AX og apoptose efter genotoksisk stress ved flow cytometri

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolering af exosome-beriget ekstracellulære vesikler Transporterer Granulocyte-Makrofag Colony-stimulerende faktor fra embryonale stamceller

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation af Ortotopiske tumorer i bugspytkirtlen og ex vivo karakterisering af tumor Infiltrerende T-celle cytotoksicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...