Name: in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells
Uploaded: 2021-09-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells at JoVE.com

Diese Studie wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 und Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (an H.P.), ein Mechtild Harf Forschungsstipendium der DKMS Foundation for Giving Life (an H.P.) ein Young Investigator Award der Melanoma Research Alliance (an S.H.), ein Stipendium der Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (an F.S.), einen Seed Fund der Technischen Universität München (an S.H.) und ein Forschungsstipendium der Wilhelm Sander Stiftung (2021.041.1, an S.H.). H. P. wird durch das EMBO Young Investigator Program unterstützt.
AUTORENBEITRÄGE:
F.S., H.P. und S.H. entwarfen die Forschung, analysierten und interpretierten die Ergebnisse. F.S. und S.H. schrieben das Manuskript. H.P. und S.H. leiteten die Studie.

Zu Beginn der Experimente waren die Mäuse mindestens 6 Wochen alt und wurden unter bestimmten pathogenfreien Bedingungen gehalten. Das vorliegende Protokoll entspricht den institutionellen ethischen Standards und den geltenden lokalen Vorschriften. Tierversuche wurden von der örtlichen Zulassungsbehörde (Regierung von Oberbayern, München, Deutschland) genehmigt. Mögliche geschlechtsspezifische Verzerrungen wurden in diesen Studien nicht untersucht.
1. Erzeugung und Isolierung von EVs aus Tu...

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	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+cell+death+in+cancer+therapy.">Immunogenic cell death in cancer therapy.</a> Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).</li><li>Kepp, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+detection+of+immunogenic+cell+death.">Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death.</a> Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).</li><li>Fuertes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+type+I+IFN+signals+are+required+for+antitumor+CD8++T+cell+responses+through+CD8{alpha}++dendritic+cells.">Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).</li><li>Sistigu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell-autonomous+contribution+of+type+I+interferon+signaling+to+the+efficacy+of+chemotherapy.">Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).</li><li>Fridman, W. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+antigens+to+secreted+membrane+vesicles+in+vivo+induces+efficient+antitumor+immune+responses.">Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses.</a> Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).</li><li>Diamond, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+Shuttle+TREX1-Sensitive+IFN-Stimulatory+dsDNA+from+Irradiated+Cancer+Cells+to+DCs.">Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).</li><li>Kitai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-containing+exosomes+derived+from+cancer+cells+treated+with+topotecan+activate+a+STING-dependent+pathway+and+reinforce+antitumor+immunity.">DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity.</a> Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).</li><li>Heidegger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I+activation+is+critical+for+responsiveness+to+checkpoint+blockade.">RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade.</a> Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).</li><li>Schadt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-cell-intrinsic+cGAS+expression+mediates+tumor+immunogenicity.">Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity.</a> Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+immunization+of+a+TLR9+agonist+virus-like+particle+enhances+anti-PD1+therapy.">In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li><li>Jeyaram, A., Jay, S. 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F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+generation+but+normal+maintenance+of+memory+T+cells+in+old+mice.">Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).</li><li>Bloom, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+tyrosinase-related+protein+2+as+a+tumor+rejection+antigen+for+the+B16+melanoma.">Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).</li><li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield,+purity+and+downstream+applications.">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).</li><li>DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+activation+and+associated+primary+adhesion+is+inducible+via+T+cell+receptor+stimulation.">CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation.</a> The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).</li><li>Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shedding+of+CD62L+(L-selectin)+regulates+the+acquisition+of+lytic+activity+in+human+tumor+reactive+T+lymphocytes.">The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes.</a> PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).</li><li>Bek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+intrinsic+RIG-I+signaling+turns+melanoma+cells+into+type+I+interferon-releasing+cellular+antitumor+vaccines.">Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines.</a> Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).</li><li>Nabet, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+RNA+unshielding+couples+stromal+activation+to+pattern+recognition+receptor+signaling+in+cancer.">Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer.</a> Cell. 170 (2), 352-366 (2017).</li><li>Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+masters+of+intercellular+communication+and+potential+clinical+interventions.">Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).</li></ol>

Dieses Protokoll bietet eine immunologische In-vivo-Bewertung von EVs, die aus Melanomzellen unter chemotherapieinduziertem Stress gewonnen werden, während es sich an EVs anpasst, die von verschiedenen Krebsarten unter verschiedenen Behandlungen emittiert werden. Die Immunisierung von Mäusen mit EVs, die aus Oxaliplatin-behandelten B16-OVA-Zellen gewonnen werden, erweitert beispielsweise IFN-γ-produzierende CD8+ T-Zellen in der Milz, die durch Ex-vivo-Inkubation mit Ovalbumin weiter stimul...

Das Immunsystem spielt eine zentrale Rolle im Kampf gegen Krebs, sowohl wenn es durch Immun-Checkpoint-Hemmung angeregt wird, als auch für die Wirksamkeit konventioneller Krebstherapien. Tumorzellen, die genotoxischen Therapien wie den Chemotherapeutika Oxaliplatin und Doxorubicin oder der ionisierenden Strahlenbehandlung erliegen, können Antigene und gefahrenassoziierte molekulare Muster (DAMPs) freisetzen, die möglicherweise eine adaptive Antitumor-Immunantwort auslösen1. Zu den bekanntesten DAMPs im Zusammenhang mit dem immunogenen Zelltod gehören Find-me-Signale wie chemotaktisches ATP, Eat-Me-Signale wie die Exposition von Calreticulin, das die Aufnahme von Tumorzellen durch Antigen-präsentierende Zellen fördert, und die Freisetzung von HMGB1, das Mustererkennungsrezeptoren aktiviert und dadurch die Kreuzpräsentation von Tumorantigenen verbessert2. Darüber hinaus werden Typ-I-Interferone (IFN-I), die über tumorabgeleitete immunogene Nukleinsäuren oder andere Reize induziert werden, von dendritischen Zellen wahrgenommen, so dass sie tumorspezifische zytotoxische T-Zellen effektiv primieren können3,4. Klinisch, aktivierte und proliferierende CD8+ T-Zellen, die den Tumor infiltrieren, bieten bei vielen Krebspatienten einen unabhängigen prognostischen Faktor für ein verlängertes Überleben. IFN-γ wird aus solchen aktivierten T-Zellen freigesetzt und vermittelt direkte antiproliferative Wirkungen auf Krebszellen und treibt die Th1-Polarisation und die zytotoxische T-Zell-Differenzierung voran, wodurch es zu einer wirksamen Immunüberwachung gegen Krebs beiträgt5,6. Oxaliplatin ist ein echter immunogener Zelltodinduktor, der eine solche adaptive Immunantwort gegen Krebs vermittelt7. Die Fülle der anfänglichen immunogenen Signale, die von Tumorzellen unter therapieinduziertem Stress freigesetzt werden, muss jedoch noch vollständig enthüllt werden. Trotz erheblicher Fortschritte in der Krebsimmuntherapie bleibt die Ausweitung des Nutzens auf einen größeren Teil der Patienten eine Herausforderung. Ein detaillierteres Verständnis der immunogenen Signale, die die T-Zell-Aktivierung initiieren, könnte die Entwicklung neuartiger Therapien leiten.
Eine heterogene Gruppe von membranumschlossenen Strukturen, die als extrazelluläre Vesikel (EVs) bekannt sind, scheinen als interzelluläre Kommunikationsgeräte zu dienen. EVs, die von praktisch allen Zelltypen emittiert werden, transportieren funktionelle Proteine, RNA, DNA und andere Moleküle zu einer Empfängerzelle oder können den Funktionszustand einer Zelle verändern, indem sie einfach an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden. Ihre biologisch aktive Fracht variiert erheblich je nach Art und Funktionszustand der erzeugenden Zelle8. In der Krebsimmunologie wurden EVs, die aus Tumorzellen freigesetzt werden, überwiegend als Gegner der Immuntherapie angesehen, da sie schließlich das invasive Wachstum fördern, metastasierende Nischen9 präformen und die Immunantwort unterdrücken10. Im Gegensatz dazu haben einige Studien gezeigt, dass EVs Tumorantigene auf dendritische Zellen übertragen können, um eine effektive Kreuzpräsentation zu ermöglichen11,12. EVs können immunstimulierende Nukleinsäuren liefern, wenn sie unter therapieinduziertem Stress entstehen, was eine Anti-Tumor-Immunantwort ermöglicht13,14. Es wurde kürzlich gezeigt, dass die Erfassung solcher RNA- und DNA-angeborenen Immunliganden in der Tumormikroumgebung die Reaktionsfähigkeit auf die Checkpoint-Blockade signifikant moduliert15,16,17. Daher muss die immunogene Rolle von EVs, die von Tumorzellen unter verschiedenen therapieinduzierten Belastungen freigesetzt werden, weiter aufgeklärt werden. Da EVs ein junges, aber wachsendes Forschungsfeld darstellen, ist die Standardisierung der Methoden noch nicht abgeschlossen. Daher ist der Austausch von Wissen unerlässlich, um die Reproduzierbarkeit der Forschung über Wechselwirkungen zwischen EVs und Krebsimmunologie zu verbessern. Vor diesem Hintergrund beschreibt dieses Manuskript ein einfaches Protokoll zur Beurteilung der immunogenen Wirkung von tumorabgeleiteten EVs in vivo.
Diese Bewertung wird durchgeführt, indem tumorabgeleitete EVs erzeugt, Empfängermäuse mit diesen EVs immunisiert und Milz-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Die EV-Erzeugung erfolgt idealerweise durch die Aussaat muriner Tumorzellen in einem EV-freien Zellkulturmedium für einen hohen Reinheitsgrad. Zellen werden mit einem spezifischen Zellstressreiz wie einer Chemotherapie behandelt, um die Wirkung von therapieinduzierten EVs mit der Ausgangsimmunogenität der jeweiligen tumorabgeleiteten EVs zu vergleichen. Die Isolierung von Elektrofahrzeugen kann durchaus durch verschiedene Techniken erfolgen, die je nach In-vivo-Anwendbarkeit und lokaler Verfügbarkeit ausgewählt werden sollten. Das folgende Protokoll beschreibt einen niederschlagsbasierten Assay mit einem kommerziellen Kit zur EV-Reinigung. Mäuse werden zweimal mit diesen EVs immunisiert. Vierzehn Tage nach der ersten Injektion werden T-Zellen aus der Milz extrahiert und mittels Durchflusszytometrie auf die IFN-γ-Produktion analysiert, um eine systemische Immunantwort zu bewerten. Auf diese Weise wird das Potenzial von tumorabgeleiteten EVs, die unter verschiedenen therapeutischen Therapieschemata entstehen, relativ einfach, schnell und mit hoher Validität bewertet13. Daher eignet sich diese Methode für ein immunologisches Screening von EVs aus Krebszellen unter verschiedenen Bedingungen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100204</td>
			<td>Clone 17A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 PacBlue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100428</td>
			<td>Clone GK1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100712</td>
			<td>Clone 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN&#947; PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>RM90022</td>
			<td>Clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420601</td>
			<td>Brefeldin A Solution (1,000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>EASYstrainer 100 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td>eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5123-43</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Diluent</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5223-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>407952</td>
			<td>From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, &#8805; 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>vac-pova</td>
			<td>Ovalbumine with &#60; 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Pharmacy of MRI hospital</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1514-122</td>
			<td>Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate, &#8805; 99% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF filter, 0,22 &#181;m, for syringes</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Filter Unit 0.22 &#181;m Durapore PVDF Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 26 G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305501</td>
			<td>1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Exosome Isolation Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478359</td>
			<td>For isolation from cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>31350</td>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells

Der durch Chemotherapie oder Bestrahlung verursachte immunogene Zelltod von Tumoren kann tumorspezifische T-Zell-Reaktionen auslösen, indem er gefahrenassoziierte molekulare Muster freisetzt und die Produktion von Typ-I-Interferon induziert. Immuntherapien, einschließlich der Checkpoint-Hemmung, sind in erster Linie auf bereits vorhandene tumorspezifische T-Zellen angewiesen, um eine therapeutische Wirkung zu entfalten. Daher können synergistische Therapieansätze, die den immunogenen Zelltod als intrinsischen Krebsimpfstoff nutzen, ihre Reaktionsfähigkeit verbessern. Das Spektrum immunogener Faktoren, die von Zellen unter therapieinduziertem Stress freigesetzt werden, bleibt jedoch unvollständig charakterisiert, insbesondere in Bezug auf extrazelluläre Vesikel (EVs). EVs, nanoskalige membranöse Partikel, die von praktisch allen Zellen emittiert werden, sollen die interzelluläre Kommunikation erleichtern und bei Krebs nachweislich Cross-Priming gegen Tumorantigene vermitteln. Um die immunogene Wirkung von EVs aus Tumoren unter verschiedenen Bedingungen zu beurteilen, werden anpassungsfähige, skalierbare und valide Methoden gesucht. Daher wird hierin ein relativ einfacher und robuster Ansatz zur Beurteilung der In-vivo-Immunogenität von Elektrofahrzeugen vorgestellt. Das Protokoll basiert auf der Durchflusszytometrie-Analyse von Milz-T-Zellen nach In-vivo-Immunisierung von Mäusen mit EVs, isoliert durch fällungsbasierte Assays aus Tumorzellkulturen unter Therapie oder stationären Bedingungen. Zum Beispiel zeigt diese Arbeit, dass die Oxaliplatin-Exposition von B16-OVA-murinen Melanomzellen zur Freisetzung immunogener EVs führte, die die Aktivierung tumorreaktiver zytotoxischer T-Zellen vermitteln können. Daher identifiziert das Screening von EVs durch In-vivo-Immunisierung und Durchflusszytometrie Bedingungen, unter denen immunogene EVs entstehen können. Die Identifizierung der Bedingungen der immunogenen EV-Freisetzung ist eine wesentliche Voraussetzung, um die therapeutische Wirksamkeit von EVs gegen Krebs zu testen und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erforschen, um letztendlich neue Erkenntnisse über die Rolle von EVs in der Krebsimmunologie zu gewinnen.

Dieses Protokoll soll die einfache und leicht reproduzierbare Beurteilung der Immunogenität von tumorabgeleiteten EVs erleichtern. Dabei werden Mäuse mit EVs beimpft, die aus In-vitro-Kulturen von Tumorzellen gewonnen werden, die das Modellantigen Hühnerovalbumin (OVA) exprimieren. Die anschließende Immunantwort wird in Milz-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert.
Abbildung 1 gibt einen Überblick über die praktischen Schritte des ...

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In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Dieses Manuskript beschreibt, wie die In-vivo-Immunogenität von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie beurteilt werden kann. EVs, die von Tumoren stammen, die einem behandlungsinduzierten immunogenen Zelltod unterzogen werden, scheinen in der Tumorimmunüberwachung besonders relevant zu sein. Dieses Protokoll veranschaulicht die Beurteilung von Oxaliplatin-induzierten immunstimulierenden Tumor-EVs, kann aber an verschiedene Einstellungen angepasst werden.

Im lebenden Organismus Immunogenitätsscreening von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln durch Durchflusszytometrie von Milz-T-Zellen

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Dieses Video zeigt, wie die In-vivo-Immunogenität von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln oder EVs mittels Durchflusszytometrie beurteilt werden kann. Das hierin beschriebene Screening-Verfahren ist relativ einfach durchzuführen und kann an verschiedene Einstellungen angepasst werden. Bei Krebs wird die Identifizierung von Zuständen immunogener extrazellulärer Vesikel von besonderer translationaler Relevanz freigesetzt.Daher könnten autologe Elektrofahrzeuge als personalisierte Krebsbehandlungen eingesetzt werden. Den ersten Teil des Verfahrens wird Tatiana Nedelko, eine technische Assistentin aus meinem Labor, demonstrieren. Um mit der Herstellung von Zellkulturmedien zu beginnen, die für extrazelluläre Vesikel oder EVs benötigt werden, erschöpfen Sie die Rinder-EVs in FCS-Medien durch Ultrazentrifugation bei 100.000 mal g für 24 Stunden bei 4 Grad Celsius.Entsorgen Sie das Pellet nach der Zentrifugation. Ernten Sie die murinen B16-Melanomzellen, die Ovalbumin oder B16-OVA-Zellen exprimieren, aus der Kultur und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Dann säen Sie die Zellen in einer Konzentration von 400.000 Zellen pro Milliliter in den EV-erschöpften Medien.Als nächstes behandeln Sie die B16-OVA-Zellen mit 30 Mikrogramm Oxaliplatin pro Milliliter und inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit unbehandelten Kontrollproben. Nach 24 Stunden den Überstand sammeln, um bei 400 mal g für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren. Entsorgen Sie das Pellet vor der Zentrifugation erneut bei 2.000 mal g für 30 Minuten bei 4 Grad Celsius.Filtern Sie nach dem Auswerfen des Pellets den Überstand durch einen 220 Nanometer großen PVDF-Membranfilter in ein frisches Rohr. Mischen Sie dann 1 Milliliter Überstand mit 0,5 Millilitern eines bestimmten kommerziell erhältlichen Exosom-Isolationsreagenzes. Wirbeln Sie vor und geben Sie die Mischung in 1,5-Milliliter-Röhrchen, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 4 Grad Celsius.Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Mischung bei 10.000 mal g für 60 Minuten bei 4 Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand vorsichtig entsorgt haben, entfernen Sie die verbleibenden Tropfen, indem Sie das 1,5-Milliliter-Rohr kopfüber auf ein Papiertuch klopfen und durch eine feine Pipettespitze absaugen, ohne das EV-Pellet am Boden zu berühren. Resuspendieren Sie das Pellet in kaltem PBS, indem Sie es auf und ab pipettieren, ohne das Pellet mit der Spitze zu zerkratzen.Bündeln Sie dann die EVs aus allen Röhren. Wenn Sie sie nicht sofort verwenden, lagern Sie die EV-Suspensionen bei 80 Grad Celsius in silikonisierten Gefäßen bis zu 28 Tage bis zur Anwendung. Um jede Maus in der Behandlungsgruppe mit EVs zu immunisieren, die von 4,0 x 10 bis zu den fünften B16-OVA-Zellen isoliert wurden, mischen Sie 5 Mikroliter der EV-Suspension mit 55 Mikrolitern kaltem PBS.Als nächstes füllen Sie Spritzen, die mit 26- bis 30-Gauge-Nadeln montiert sind, mit 60 Mikrolitern der verdünnten EVs oder PBS und legen Sie die Spritze dann sofort auf Eis. Impfen Sie die EVs oder PBS subkutan in den medialen Aspekt des Oberschenkels der Mäuse. Wiederholen Sie die Immunisierung nach sieben Tagen.14 Tage nach der ersten Behandlung opfern Sie die Mäuse, um die Milz zu resezieren. Dann zerdrücken Sie die resezierte Milz mit einem angefeuchteten 100-Mikrometer-Zellsieb und dem Kunststoffkolben einer Spritze. Spülen Sie die Milzzellen in ein 50-Milliliter-Rohr mit 5 bis 10 Millilitern des kühlen kompletten RPMI.Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 mal g für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius, bevor Sie den Überstand verwerfen. Um Erythrozyten aus der Zellsuspension zu entfernen, resuspendieren und inkubieren Sie das Zellpellet mit 2 Millilitern des Lysepuffers der roten Blutkörperchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Stoppen Sie dann die Reaktion, indem Sie fünf bis 10 Milliliter vollständiges RPMI hinzufügen, gefolgt von einer Zentrifugation, wie zuvor beschrieben.Nachdem Sie das Zellpellet in vollständigem RPMI resuspendiert haben, zählen Sie die Zellen von jeder Maus und legen Sie die Triplikatoren von 200.000 Splenozykten mit 200 Mikrolitern cRPMI in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit einem U-förmigen Boden. Dann inkubieren Sie die Platten für 48 Stunden bei 37 Grad Celsius. Nach 48 Stunden behandeln Sie die Zellkultur mit 5 Nanogramm pro Milliliter Brefeldin A, 20 Nanogramm pro Milliliter PMA und 1 Mikrogramm pro Milliliter Ionomycin bei 37 Grad Celsius für 4 Stunden.Nach der Inkubation die Splenozyten auf eine 96-Well-Platte mit einem V-förmigen Boden übertragen und die Zellen zweimal mit PBS waschen. Die pelletierten Splenozyten werden in der frisch zubereiteten Färbelösung resuspendiert und die Zellsuspension 30 Minuten lang bei 4 Grad Celsius lichtgeschützt inkubiert. Zur Fixierung und Permeabilisierung die Splenozyten zweimal im FACS-Puffer waschen und dann die Splenozyten in 100 Mikrolitern pro Vertiefung der Fixations- und Permeabilisierungslösung resuspendieren, gefolgt von einer Inkubation im Dunkeln, wie zuvor erläutert.Um das intrazelluläre Interferon gamma zu färben, waschen Sie die Splenozyten im Fixations- oder Permeabilisierungspuffer, bevor Sie die Zellen mit den fluoreszierenden Antikörpern gegen Interferon gamma verdünnt 1:200 im Puffer erneut senden. Inkubieren Sie die Splenozyten für 1 bis 12 Stunden bei 4 Grad Celsius im Dunkeln. Nach gründlichem Waschen und Resuspension im FACS-Puffer analysieren Sie die Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen gemäß der im Manuskript erläuterten Gating-Strategie.Im repräsentativen Bild ist die Gating-Strategie zur Analyse der Aktivierung zytotoxischer T-Zellen dargestellt. Die Zellen wurden als einzelne Zellen, die Lymphozyten-Untergruppe, die lebensfähigen CD3-positiven T-Zellen und die CD4-negativen CD8-positiven zytotoxischen T-Zellen eingezäunt. Die intrazelluläre Akkumulation des Interferon-Gammas wurde als Surrogatmarker für die Aktivierung bewertet.Nach der Immunisierung mit EVs aus den Tumorzellen wurde die Induktion von antigenspezifischen T-Zell-Reaktionen bei Empfängermäusen untersucht. Die tumorabgeleiteten EVs, die unter genotoxischen Stressbedingungen wie der Oxaliplatinbehandlung kultiviert wurden, induzierten im Gegensatz zu unbehandelten EVs eine starke Aktivierung der splenischen zytotoxischen T-Zellen. Die fahrzeugbehandelte Tiergruppe zeigte die geringste Reaktion.Die Aktivierung von Milz-T-Zellen wurde nach der Ex-vivo-Restimulation entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von Ovalbumin bestimmt. Die Produktion des Interferon-Gammas war erhöht, wenn die Splenozyten von Tumor-EV-behandelten Tieren vor der Analyse mit dem Modell-Tumorantigen Ovalbumin restimuliert wurden. Bitte beachten Sie, dass reproduzierbare Ergebnisse von der konstanten Isolationswirksamkeit von Elektrofahrzeugen abhängen.Stellen Sie daher sicher, dass EV-Pellets vollständig und zeitnah resuspendiert werden, um eine Austrocknung zu vermeiden. Mit diesem Protokoll konnten wir spezifische Signalwege innerhalb von Tumorzellen analysieren, die die Immunogenität von von Tumorzellen abgeleiteten EVs bestimmen. Dies könnte den Weg ebnen, um solche immunogenen EVs in der Krebsbehandlung zu nutzen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Forschung

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Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

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Isolierung von exosomenangereicherten extrazellulären Vesikeln, die Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor aus embryonalen Stammzellen tragen

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Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...